Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

אנחנו רוצים להודות פייר Bourdoncle, תומאס גילברט של קוצ'ין הדמיה המתקן (Institut קוצ'ין, פריז) עבור ייעוץ וסיוע עם מיקרוסקופ. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים le חדר מרווח וחדיש ליגה צרפתית נאסיונאל סרטן, על ידי CARPEM (Cancer Research ללימודי רפואה אישית), על ידי דה פראנס של Fondation על ידי אופק 2020 תכנית האיחוד האירופי מחקר וחדשנות תחת גרנט ההסכם לא 667980 (קראט).

גידולים אנושיים התקבלו עם ההסכם של הוועדה האתית הצרפתי ועל ידי של סיוע Publique-Hôpitaux פריז (AP-HP) ביישום עם המאמר L.1121-1 של החוק הצרפתי. הסכמה מדעת בכתב הושג מן המטופלים לפני ההכללה במחקר.
1. קבלת גידולים אמבריולוגיה
<ol>
	<li>להשיג דגימות הגידול ריאות טריים של חולים עם סרטן ריאות שאינם קטנים התא שלב I-III, שעברו כריתה כירורגית מלאה של גידולים שלהם ריאות4.</li>
	<li>תחבורה הגידול טרי שאינו קבוע בצינור חרוט 15 מ"ל המכילה קרח בינוני רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI 1640). להפריש על קרח למשך 30 דקות עד שלב 2.7. הערה: כאשר גידולים מתקבלים בשעות אחר הצהריים, למקם אותם על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ותהליך למחרת. במקרה זה, תוספת התקשורת RPMI-1640 עם 5% סרום שור עוברית (FBS).</li>
</ol>
2. Agarose הטבעה וחלוקת vibratome של גידולים אמבריולוגיה
הערה: בצע את כל השלבים עד 2.10 בתנאים סטריליים.
<ol>
	<li>להכין 5% agarose פתרון הטבעה על ידי המסת 1 g התכה נמוכה נקודת agarose ב- 20 מ ל סטרילי של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ללא סידן ומגנזיום. מיקרוגל פתרון זה עד agarose זה התפרקה לחלוטין. אפשר את agarose להתקרר ב 37 מעלות צלזיוס על ידי הצבת הפתרון באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>בשכונה תרביות רקמה, להכין מלא RPMI-1640 בינונית (ללא פנול אדום) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS), גלוטמין 4 מ מ L ו- 1 x פניצילין, סטרפטומיצין.</li>
	<li>להוסיף 1.1 mL בינוני RPMI-1640 מלאה בכל טוב צלחת תרבות 6-ובכן תא ולמקם הוספה תרבות של 30 מ מ תא מכל קידוח. להפריש את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שלב 2.12.</li>
	<li>המקום מעוקר שיבות שטוחות פלדת אל-חלד (הקוטר הפנימי של 5 מ מ, מחוץ בקוטר של 10 מ"מ, עובי 1 מ"מ) בצלחת פלסטיק 35 מ מ מלא בינוני מלא RPMI. דיסקיות ישמש עוד יותר להתרכז הנוגדנים הפרוסה vibratome-קאט.</li>
	<li>מקם את הביופסיה הגידול בצלחת פלסטיק 10 ס מ וחותכים את הגידול עם סכין חדה לחלקים צורה קובייה קטנה של 5 x 5 מ מ אורך.</li>
	<li>להוציא את agarose מן החממה ויוצקים את הפתרון לתוך צלחת פלסטיק 35 מ מ.</li>
	<li>השתמש זוג מלקחיים להעביר בזהירות השברים גידול רקמות מחיקה כדי להסיר את עודף של מדיום. להוסיף שברי agarose ומקם אותם בתחתית קערה מפלסטיק. השארתי את הג'ל agarose קרח במשך 5 דקות כדי לחזק.</li>
	<li>ברגע agarose מתמצק, היפוך קערה פלסטיק ולהשתמש מרית לשחרר את הג'ל כולו.</li>
	<li>השתמש סכין חדה לחתוך את agarose עודף השבר הגידול, להשאיר 3-5 מ מ ג'ל סביב הרקמה שמסביב.</li>
	<li>הר כל בלוק agarose על הדיסק הדגימה של vibratome עם טיפת רעיל בוטיל cyanoacrylate רקמות דבק. למלא את המגש מאגר vibratome סטרילי PBS קר כקרח, להתקין את הדיסק הדגימה במגש.</li>
	<li>לחתוך agarose מוטבע רקמות לפרוסות עבות מיקרומטר 350. התאם את ההגדרות vibratome במהירות איטית טווח (0.2-0.3 מ מ/s) ותדירות רטט בטווח בינוני (1.5 מ מ).</li>
	<li>בזהירות בעזרת מלקחיים בסדר, לאסוף את הפרוסות גידולים כפי שהם נקטעים ולמקם אותם בחוזקה הכיסויים התרבות התא של צלחת 6-טוב (שלב 2.3). העבר 1 פרוסה על כל הוספה. השתמש בקפידה רבה בעת טיפול פרוסות כפי שהם יכול להיפגע בקלות.</li>
	<li>השתמש בסדר מלקחיים למקום דיסקיות נירוסטה על כל פרוסה בודדים. ודא דיסקיות ממוקמות היטב על agarose המקיפים את רקמת הגידול.</li>
	<li>לשמור על לוח תרבות-37 מעלות צלזיוס 5% CO2 humidified החממה במשך 10 דקות להמשיך כדי immunostaining.</li>
</ol>
3. Immunostaining של תאי CD8 T תושב ותאים סרטניים
<ol>
	<li>לדלל הנוגדנים (הריכוז הסופי 10 µg/mL) וצבע את הגרעין (ריכוז סופי 1 µg/mL) בתקשורת RPMI-1640 ללא פנול אדום. הערה: השתמש מצמידים fluorescently anti-CD8 (מאתר IgG, לשבט SK1) ו- anti-EpCAM (תאים אפיתל אדהזיה מולקולה) (מאתר אג האה-125) נוגדנים כדי לתייג לימפוציטים מסוג CD8 T, גידול תאי אפיתל, בהתאמה. השתמש מצמידים fluorescently אנטי-CD90/Thy1 (מאתר IgG, שיבוט 5E10) נוגדנים כדי תווית fibroblasts ותאי אנדותל מופעל. השתמש 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) לתייג את הגרעין של תאים עם קרום פלזמה פרוץ כדי להעריך את יכולת הקיום של רקמות.</li>
	<li>להסיר את הלוחות תרבות מן החממה ולהשתמש פיפטה לרוקן כל נוזל בתוך הדיסקיות פלדת אל-חלד. אל תסיר את המדיה 1.1 mL RPMI-1640 תחת השרוול התרבות התא (שלב 2.3).</li>
	<li>בלי לגעת הפרוסה ושימוש טיפ פיפטה, להוסיף µL 40 של הפתרון המכיל את הנוגדנים על כל פרוסה הגידול.</li>
	<li>דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לאפשר נוגדן מכתים.</li>
	<li>עם מלקחיים בסדר, להסיר את הדיסקיות, להוציא פרוסות, ו- s לטבול אותם 10 RPMI-1640 מדיה ללא פנול אדום. מניחים בחזרה את הפרוסות על גבי השרוול התרבות תאים, להוסיף טיפה של פנול אדום ללא RPMI-1640 בינונית על כל פרוסה בודדים. לשמור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות להמשיך כדי הדמיה.</li>
</ol>
4. הדמיה וניתוח תושב נדידת תאים CD8 T בתוך פרוסות הגידול אמבריולוגיה
הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי בשימוש פרוטוקול זה הוא ישר ספינינג דיסק מצויד של 25 x המטרה טבילה במים (25 x / 0.95 נ. א).
<ol>
	<li>הכנת ההתקנה מיקרוסקופ<ol>
		<li>לקבוע את הטמפרטורה של החום-התא מיקרוסקופ 37 ° C מספר שעות לפני תחילת ההפעלה הדמיה.</li>
		<li>הגדרת מערכת ללא הרף perfuse הגידול פרוסות עם חמצן (5% CO2, 95% O2) ללא פנול אדום בינוני RPMI (איור 1). השתמש משאבה סחרור לזרום התקשורת זלוף אל החדר הדמיה לרוקן את הפתרון בקבוקון ומפקחת.</li>
		<li>הפעל את משאבת סחרור כדי לאפשר את הפתרון מחומצן ללכת דרך הצינורות זלוף.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>עם מלקחיים בסדר, תוציא את הפרוסה צלחת 6-ובכן, העברת אותו לצלחת פלסטיק של 35 מ מ מלא ללא פנול אדום בינוני RPMI. לשתק את הפרוסה עם עוגן פרוסה 19.7 mm בקוטר עם 2 מ"מ במרווח-חוטים. במקום הפטרי על הבמה הדמיה במיקרוסקופ. לחבר את הטיפים כניסת ו עודפים של מערכת זלוף. להפעיל את המערכת זלוף ולהגדיר את קצב זרימת מדיה 0.8 mL/min.</li>
	<li>. תוריד את המטרה טבילה במים כדי הפרוסה. פוקוס על הפרוסה עם אור בהיר שדה.</li></ol>באמצעות אור ניאון המתאים, בחר אזור עניין זה מכיל תאים CD8 T, הגידול איים קטנים (חיובי עבור EpCAM), אזור משתית (חיובי עבור CD90). בדיקת הכדאיות של תאים בתוך הפרוסה על-ידי הערכת דאפי מכתימים על פני לחתוך יותר ויותר עמוק לתוך הרקמה. הערה: פרוסה בריא מכיל רק מיעוט של דאפי תאים חיוביים על מספר מיקרונים מהמשטח לחתוך.
	<li>הגדר הפעלה של הדמיה עם הפעולות הבאות.<ol>
		<li>בהתאם עוצמת האות פלורסנט של fluorophores 3, הגדר את זמן החשיפה בין 50 ל 800 ms ועוצמת לייזר בין 20-40%.</li>
		<li>בחר את עובי מחסנית z כדי התמונה בתוך הפרוסה הגידול. הערה: כאן, 10-12 מטוסי אופטיים פורש לעומק סך של 60-70 מיקרומטר בממד z נלכדו.</li>
		<li>בחר את מיקום ההתחלה כ 10 מיקרומטר מתחת תאי CD8 T שכותרתו הראשון.</li>
		<li>להגדיר את מרווח הזמן בין כל תמונה z-מחסנית בין 10-30 s ואת זמן ההקלטה הכולל בין 10-30 דקות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לנתח את נדידת תאים CD8 T תושב כפי שמתואר הפניה4.<ol>
		<li>לאחר ייבוא הנתונים כדי תוכנת מעקב, ליצור נקודות עבור כל תא CD8 T בשטח. להתאים את הקוטר של התאים את הסף של זיהוי על פי על תאים פלורסנט שבעורך.</li>
		<li>לבדוק את הרצועות ולהסיר כל רצועה לא רלוונטי על-ידי מחיקתן. רצועות הנכון על-ידי חיבור וניתוק מסלולים שונים של נקודות זמן שונות של המסילה אותו. לייצא את הנתונים (מהירות המסלול, אורך המסלול הזחה) תוכנת הגיליון האלקטרוני.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

טכניקה פשוטה, מהירה, חזקה ליצירת פרוסות הגידול אמבריולוגיה והערכה של ההתנהגות דינמי של תאי CD8 T תושב בסביבת הגידול נשמר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מתואר. פרוטוקול זה הוא זיקוק של מאמר הקודם של יופיטר המתארת את הפיקוח על מצופה בתאי T לתוך הצומת לימפה מאתר פרוסות2.
יש לקחת בחשבון הלבנה של צבעי פלורסנט במיוחד עם צבעי הדור הראשון כמו fluorescein isothiocyanate ו- phycoerythrin. מצאנו כי photobleaching בולטת של נוגדנים ישירות מצמידים התרחשה עם מיקרוסקופ שני הפוטונים. לעומת זאת, photobleaching מינימלי היה לב עם מיקרוסקופ קונפוקלי, במיוחד באמצעות צבעי פלורסנט בהיר שפותחה לאחרונה.
נוגדנים הם מולקולות גדולות יחסית, ולכן שלהם חדירה לתוך הרקמה יכול להיות קשה. שלב זה ניתן לשפר על ידי הגדלת זמן הדגירה. בנוסף, השימוש קטן מכתים שברי Fab ריאגנטים כגון ישירות מצמידים נוגדנים מייצג חלופה טובה.
לכל הנוגדנים שמתואר פרוטוקול זה היה בעבר לאמת, ידוע לייצר מכתימים בהיר4. לכן, isotype הפקדים אינם נדרשים. עם זאת, אם שינויים בשיטה זו באמצעות נוגדנים אחרים הם הרצויה, ואז השימוש isotype שליטה נוגדנים מומלץ מאוד.
מערכת ניסויית זו מציגה מספר מגבלות. ההליך חיתוך יגרום נזק רקמת, אשר עשוי להשפיע על ההתנהגות של תאי CD8 T, במיוחד סמוך לפני השטח לחתוך. בנוסף, מספר גורמים מסיסים (למשל נוגדנים) תפקיד חשוב בשליטה על ההעברה של תאי T יכול להיות אבוד. דרך אחת לעקוף את הבעיות הללו היא על-ידי ניטור בתאי T הממוקם ב כמה עשרות מיקרונים מפני השטח באזורים ככל הנראה בריא של הרקמה. ניסויים שפורסמו לחשוף תאי T מקומי עמוק בתוך הרקמה להעביר באופן פעיל יותר מאשר בתאי T מקומי ליד משטח לחתוך4. השתמשנו מיקרוסקופ קונפוקלי ללימודי שלנו אבל סביר להניח כי מיקרוסקופ שני הפוטונים יגדיל את הרזולוציה המרחבית לעומק.
גישה זו נסמכת על השימוש של נוגדנים מצמידים fluorescently שאינם מולקולות נייטרלים. נוגדנים בגודל מלא רגישים ישפיע לתפקוד תקין של תאי T בדרכים שונות. ראשית, נוגדנים anti-CD8 יכול לשנות נדידת תאים T על ידי מפעילה של המפל איתות תאיים מסוגלים להשפיע על שלד של התא של לימפוציטים. שנית, נוגדנים anti-CD8 יכול לווסת את האינטראקציה בין CD8 MHC מחלקה אני מולקולות, שלב חשוב בתהליך זיהוי אנטיגן. השלישי, שלם ניתן לאגד נוגדנים לקולטנים Fc שביטאו רבים התאים מיאלואידית מבוזרת בגידול ורגישה לכן להגדיל את האות לא ספציפית. אין לנו שום אינדיקציה כזו בעיה מושפעות הנתונים שלנו, כנראה בגלל Fc קולטני התאים מיאלואידית תושב, בניגוד תאים בתרבות, רוויים immunoglobulins מתנה בתוך חצרו הגידול. אכן, התוספת של סרום במהלך ההליך תיוג, תהליך חוסמות רצפטורים Fc חינם, לא השתנו ההכתמה חיסונית. בכל זאת, שברי Fab של נוגדנים, ללא אזור Fc, כמו גם נוגדנים מוטציה באזור שלהם Fc, נגזר גמליים נוגדן שברי8 מייצגים אחרים אסטרטגיות אלטרנטיביות כדי לעקוב אחר תאים תושב עם פלורסנט המשדרים.
בעשורים האחרונים, מספר דגם מערכות יש פותחה, המשמש את הדמיה בזמן אמת של לימפוציטים מסוג T. אלה כוללים את ההכנות במבחנה של תאים בעבר מטוהרים, תרבותי עם אנטיגן בתאי T. הכנות אפשרו התקדמות נפלאה בהגדרת על מנגנוני זיהוי אנטיגן ואת ההיענות. עם זאת, היעדר למורכבות הסביבה רקמות. תכשירים אחרים הוקמו יותר מקרוב לחקות את המבנה של רקמה מקורית. לקבלת דוגמאות, מטריצות ג'ל קולגן תלת מימדי שבו תאים T מזוכך להיות מוטבע, כמו גם התרבות של רקמת reaggregated שברי שימשו כדי לפקח על התנהגות דינמית של לימפוציטים מסוג T עם פלורסנט הדמיה טכנולוגיות9 . מערכות אלו מציגים את היתרון של ארכיטקטורה קרוב הרקמה הטבעית, אך היעדר גורמים חשובים אחרים התאית ולא מסיסים. עכבר, מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital ננקטה כדי לעקוב אחר תאים T בסביבה באמת פיזיולוגיים של איברים שלמים10. עם זאת, גישה כזו קשה מבחינה טכנית להגדיר. בנוסף, הדגמים העכבר מראים הבדלים בולטים עם הפיזיולוגיה האנושית.
בטכניקה המתוארת פרוטוקול זה מייצג סביבת גידול רב תאית מורכבים זה ממוקם באופן ייחודי כדי לשמש חוליה חשובה בין תרבות משותפת מחקרים בבעלי חיים.
הפרוטוקול המתואר במסמך זה יכול לשמש גם עבור מעקב אחר על תנועתיות של תאים אחרים מאשר לימפוציטים מסוג CD8 T שעבורו נוצרו נוגדנים. יתר על כן, הטכניקה ניתן להתאים האנושי וגידולים מאתר ורקמות אחרות. למשל, היינו מסוגלים תמונה בזמן אמת הדינמיקה של תאים B המסומנות עם נוגדן anti-CD19 ב השקדים האנושי טריים.
בטכניקה המתוארת פרוטוקול זה מאפשר למסך מולקולות טיפולית שליטה תא T תנועתיות ברקמות. הנגישות של מערכת התרבות מאפשרת להחיל כמה ריאגנטים תרופתי ולבדוק את ההשלכות שלהם על נדידת תאים T. זה מקובל לחשוב כעת, גידול גידולים, תאי CD8 T התערוכה העברה נמוך שומן מופחתת אנשי קשר עם גידול תאים11. חשוב, נוכחות נדיר של תאי T באזורים תא הגידול מזוהה עם תוצאה גרועה, ונחשב לאחד מנגנוני ההתנגדות על חיסוני סרטן T מבוססי תאים. מספר מכשולים הגבלת תאים T מעבר גידולים זוהו כולל מטריצה חוץ-תאית צפופה. במובן זה, הזיהוי של מולקולות אפשרות לשחזר תא T תנועתיות ואינטראקציה עם תאים ממאירים מייצג שלב חשוב חיסוני סרטן. במחקר הקודם, מצאנו כי הפירוק החלקי של קולגן עם collagenase, בחריפות. מוחל על פרוסות אמבריולוגיה, משפרת את הקשר של תאי T עם תאים סרטניים.
בסופו של דבר, האפשרות לשמור על גידול אנושי פרוסות בתרבות עבור עד מספר ימים7,12,13 מציע מספר יישומים מבטיחים לטווח של תאי T וחיסוני.אולם, היציבות של מערכת מודל במהלך תרבות לטווח ארוך היא פרמטר חשוב זה צריך להיות מוערך ביסודיות.
קבלת רקמה טריים ובריאים מהווה גורם קריטי כדי לייצר איכות פרוסות עם immunostaining טוב של תאי CD8, תאים סרטניים ורכיבים סטרומה. לשמור את הביופסיה הגידול ב 4 ° C לפני עיבוד היא קריטית.
הטיפול של פרוסות עם מלקחיים בסדר מייצג צעד קריטי נוסף בתוך פרוטוקול זה. זו צריכה להתבצע בקפידה רבה כפי agarose יכולה להיפגע בקלות. חתך על agarose תסכן את החותם שנעשו על ידי הדיסקית פלדת אל-חלד וכתוצאה מכך דליפה של הנוגדן המכיל פתרונות.

תאי CD8 T לשחק תפקיד מפתח בקרב נגד סרטן. עם זאת, רבים מדכאים מנגנון למנוע לימפוציטים מסוג T הורגים תאים ממאירים. במהלך השנים האחרונות, מספר אסטרטגיות מבטיח שחרור המעצורים של תאי T יש פותחה, המשמשים את המרפאה5. שתי הגישות לשמור תשומת לב רבה הן פילוח מחסום המערכת החיסונית נוגדנים, כגון טיפולים אנטי-PD-1 ואת המאמץ T cell. ובכל זאת, למרות ההצלחות האחרונות, רק תת-ערכה של חולים תועלת אלה טיפולים6. האתגר העיקרי הוא לזהות מנגנוני עמידות חיסוני סרטן כדי לפתח טיפולים יעילים יותר. אתגר נוסף הוא לפתח מודל מערכות ברומן אילו טיפולים יכולים להיות מאופיין ונבדק את האונות ואת הבטיחות. עד כה, רוב מבחני אלה מבוססים על במבחנה תא מערכות התרבות לקוי לחקות את המורכבות של רקמת הגידול.
Ex-vivo רקמות פרוסות הוא טכניקה מבטיח, זה שומר את microenvironment המקורי הרקמה7. במהלך השנים, הקמנו בגישה זו כדי לעקוב אחר הדינמיקה של לימפוציטים מסוג T ברקמות שונות. התוצאות שלנו מצביעים על כך fluorescently שכותרתו בתאי T הוסיף על גבי פרוסות מאתר הלימפה בבית השחי הצומת להעביר לתוך הרקמה להגיב שלהם המתאים רמזים microenvironmental1,2. באופן דומה, לימפוציטים מסוג T מעולף על פרוסות הגידול אמבריולוגיה מגויסים במהירות לתוך הגידול משתית3. בעזרת טכניקה זו, זיהינו את מטריצה חוץ-תאית כמרכיב חשוב בשליטה על הפצה של נדידה של תאי T בתוך גידולים אנושיים3,4. מאחר לטהר אופן הפעולה של ex-vivo מצופה בתאי T אינה משקפת בהכרח את אופן הפעולה של תושב intratumoral T לימפוציטים, לנו יש לאחרונה מעודן זה הגישה4.
כאן נתאר פרוטוקול כדי לעקוב אחר תושב לימפוציטים מסוג T בתוך פרוסות מחומרים טריים אמבריולוגיה גידולים. השלבים השונים מורכב הכנת פרוסות הגידול אמבריולוגיה (כולל הטבעה agarose vibratome חלוקתה של הרקמה מוטבע), צביעה של אנדוגני בתאי T עם נוגדנים פלורסנט הגידול טריות פרוסות, פיקוח על תאים אלה עם מיקרוסקופ קונפוקלי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

תא CD8 T הם שחקנים מרכזיים במאבק נגד סרטן. על מנת תאי CD8 T להרוג תאים סרטניים שהם צריכים להיכנס לתוך הגידול, להעביר בתוך microenvironment הגידול ולהגיב בצורה הולמת גידול אנטיגנים. ההתפתחות האחרונה של גישות הדמיה משופר, כגון פוטון 2 מיקרוסקופ, ושימוש של העכבר עוצמה הגידול דגמים יש לשפוך אור על חלק המנגנונים המווסתים פעילויות אנטי הגידול T cell. ואילו מערכות אלו סיפקו תובנות בעלות ערך, הם לא תמיד לחזות תגובות בני האדם. בשפת בני אדם, את הידע שלנו בתחום נובעת בעיקר תיאור של גידול קבוע דגימות בחולים אנושיים, כמו גם מחקרים במבחנה . עם זאת, במבחנה חסר את חצרו הגידול תלת-ממדיים מורכבים ומודלים, הם לפיכך, הערכות לא שלם של in vivo פעילויות תאי T. טריות פרוסות עשוי רקמת explanted מייצגים סביבת גידול רב תאית מורכבות שיכולות להתנהג כמו חוליה חשובה בין תרבותי משותף מחקרים בבעלי חיים. במקור להגדיר הלימפה מאתר1 , שתואר קודם לכן יופיטר בסעיף2, גישה זו יש עכשיו כבר משורבב גידולים אנושיים כדי לבחון את הדינמיקה של הן מצופה3 , כמו גם תאי T4תושב.
. הנה, עבור הכנת אמבריולוגיה הגידול פרוסות, immunostaining של תאי CD8 T וגידול תושב, מעקב של לימפוציטים מסוג CD8 T בתוך microenvironment הגידול באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פרוטוקול המתואר. מערכת זו הוא ייחודי שמוקם למסך לסוכנים חיסוני הרומן העדפה נדידת תאים T בגידולים.

אמבריולוגיה גידולים הם בדרך כלל מאוד הסתננו בתאי CD8 T מעדיפים שנמצאו משתית3,4. לפי פרוטוקול זה אחד צריך לצפות לדמיין מספר רב של immunostained CD8 T בפרוסות הגידול אמבריולוגיה. שותף-תיוג עם נוגדנים anti-EpCAM ו- anti-CD90 צריך היתר על הגידול איים ואזורים סטרומה. Fibrillar קולגן, בשפע stroma הגידול, ניתן לאבחן מבלי להכתים אקסוגני באמצעות הדור השני הרמונית על מיקרוסקופ שני הפוטונים3,4. שימו לב כי כמה גידולים אמבריולוגיה להציג אין הבחנה ברורה בין גידול סלעיים משתית. גידולים כאלה צריכים להיות מושלך כמו גם הדגימה הצגת שטחים גדולים של נמק תא המזוהה על-ידי איגוד שאינם ספציפיים של נוגדנים דאפי מכתים. בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו אמבריולוגיה, קרצינומות השחלות, תאי CD8 T תושב יותר מרוכזים stroma לעומת הגידול איים קטנים4. דוגמה מייצגת התפלגות תא CD8 T ביחס תאים סרטניים CD90 מוצג באיור2.
וזמינותו פרוסה מאפשר הניתוח של תא T תושב תנועתיות באזורי גידול שונים. קריטריונים שימושיים להשוואת תנועתיות תאי CD8 T באזורים השונים כוללים את מהירות ממוצעת (אורך נתיב המחולק במשך הזמן שנדגמו) האורך הזחה (וקטור בין ההתחלה ואת הסוף של מסלול). למרות נדירה הגידול איונים, תאי CD8 T להעביר באופן פעיל יותר במחלקה הזו בהשוואה stroma (איור 3). בממוצע, כלומר המהירות של תאים CD8 T בודדים צריך להיות קרוב 4 מיקרומטר/min ב- stroma הגידול עם הבין-הגידול variabilities4אינטרא גבוהה. ב stroma הגידול, תנועתיות תאי T תושב מושפעת מאד צפיפות והכיוון של מטריצה חוץ-תאית-סיבים-3,-4. ניסוי מוצלח יגרום פחות תאי T נוכח באזורים צפופים מטריקס בהשוואה לאזורים מטריקס רופף, בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו3,4.
שימו לב כי כמה גידולים אמבריולוגיה מוכיחים רמה גבוהה מאוד של autofluorescence מסלק הדמיה של תאי T תושב. תכונה כזאת הוא ציין במהירות בתחילת המפגש הדמיה. צריך להיות מושלך גידולים Autofluorescent. דוגמה מייצגת של CD8 T תושב, בתאי גידול autofluorescent מוצג באיור4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
איור 1: צילומים של מערכת זלוף. א) פתרון RPMI נטולת פנול אדום הוא מועשר ב- 5% C02, 95% O2. B) הפתרון הוא perfused אז על ידי משאבה סחרור. ג) הפתרון RPMI מזין את המנה תרבות דרך הים. משקע החשמל, הפתרון הוא aspirated מאת המשאבה מן החדר לתוך מיכל פסולת. שימו לב כי הטיפ שאיפה מוגדרת ברמה לקביעת גובה פתרון. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
איור 2: התפלגות T CD8 תושב תאי גידול אמבריולוגיה. תמונה ייצוגית על נתח הגידול אמבריולוגיה מוכתם CD8 (ירוק), EpCAM (כחול) ו CD90 (אדום). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
איור 3: תנועתיות T CD8 תושב תאי גידול אמבריולוגיה. מסלולים של תאים בודדים CD8 T תושב סטרומה (אדום), גידול התא (כחול) מחוזות פרוסה קרצינומה אמבריולוגיה. הפרוסה היה מוכתם הנוגדנים המצוין, עם תמונה עבור 20 דקות עם מיקרוסקופ קונפוקלי. הקולגן fibrillary התגלה בסוף באמצעות הדור השני הרמוני (SHG) במיקרוסקופ שני הפוטונים. רצועות ומסומנות בצבעים לפי אורך הזחה תא CD8 T. תמונה זו שונתה מ- 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
איור 4: תמונת הנציגה של גידול אמבריולוגיה autofluorescent. הפרוסה הגידול היה מוכתם CD8 (ירוק), EpCAM (כחול). האות SHG הוא אדום. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

פרוטוקול זה מתאר שיטה התמונה תושב גידולים הסתננות CD8 בתאי T עם נוגדנים fluorescently בשילוב בתוך אמבריולוגיה הגידול פרוסות תוויות. טכניקה זו מאפשרת ניתוחים בזמן אמת של נדידת תאים CD8 T באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

רדיונוקלידים-זריחה מדווח הדמיה כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול במודלים הגידול מכרסמים

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

זיהוי של התקדמות הגידול ריאה בעכברים על ידי הדמיה אולטרסאונד

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

מדידת תגובת התרופה בזמן אמת בפרוסות רקמה אורגנוטימית לגידול

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...