Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Desideriamo ringraziare Pierre Bourdoncle e Thomas Guilbert della Cochin Imaging struttura (Institut Cochin, Parigi) per la consulenza e l'assistenza con microscopi. Questo lavoro è stato supportato in parte da sovvenzioni dal francese Ligue Nationale contre le Cancer, da CARPEM (Cancer Research per Personalized Medicine), dalla Fondation de France e di programma di ricerca e innovazione di Orizzonte 2020 dell'Unione europea sotto grant contratto No 667980 (carati).

Tumori umani sono stati ottenuti con l'accordo del comitato etico francese e dal assistenza Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) nell'applicazione con l'articolo L.1121-1 della legge francese. Un consenso informato scritto è stato ottenuto dai pazienti prima dell'inclusione nello studio.
1. ottenimento di tumori del polmone umano
<ol>
	<li>Ottenere campioni di tumore del polmone fresco dai pazienti con il cancro del polmone non a piccole cellule di fase-III, che ha subito una resezione chirurgica completa del loro polmone tumori4.</li>
	<li>Il tumore fresco non fissa in provetta conica da 15 mL contenenti ghiacciata Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) mezzo di trasporto. Accantonato in ghiaccio per 30 minuti fino al punto 2.7. Nota: Quando i tumori sono ricevuti nel pomeriggio, metterli a 4 ° C durante la notte e il giorno seguente processo. In questo caso, integrare i media di RPMI-1640 con 5% siero bovino fetale (FBS).</li>
</ol>
2. agarosio incorporamento e vibratome affettamento dei tumori del polmone umano
Nota: Eseguire tutti i passaggi fino a 2.10 in condizioni sterili.
<ol>
	<li>Preparare 5% soluzione di agarosio per l'incorporamento di dissoluzione dell'agarosi punto basso punto di fusione di 1 g in 20 mL sterile di tampone fosfato salino (PBS) senza calcio e magnesio. Microonde, questa soluzione fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Consentire l'agarosio raffreddare a 37 ° C inserendo la soluzione in un incubatore a 37 ° C per 5 min.</li>
	<li>In una cappa di coltura del tessuto, preparare completa medium RPMI-1640 (senza rosso fenolo) contenente 10% siero bovino fetale (FBS), 4 mM L Glutammina e 1x penicillina e streptomicina.</li>
	<li>Aggiungere 1,1 mL di terreno completo RPMI-1640 per pozzetto di una piastra di coltura delle cellule 6 pozzetti e collocare un inserto di cultura cellulare 30 mm in ciascun pozzetto. Mettere da parte la piastra in un incubatore a 37 ° C per 30 min fino al punto 2.12.</li>
	<li>Posto sterilizzati rondelle piatte in acciaio inox (diametro interno di 5 mm, esterno diametro di 10 mm e spessore di 1 mm) in un piatto di plastica 35 mm riempito con terreno completo RPMI. Rondelle serviranno ulteriormente concentrare gli anticorpi sulla fetta vibratome-taglio.</li>
	<li>Mettere la biopsia del tumore in un piatto di plastica di 10 cm e tagliare il tumore con una lama affilata in frammenti di forma di piccolo cubo della lunghezza di circa 5 x 5 mm.</li>
	<li>Estrarre l'agarosio dall'incubatrice e versare la soluzione in un piatto di plastica di 35 mm.</li>
	<li>Utilizzare un paio di pinze per trasferire con cautela i frammenti di tumore a un panno di tessuto per rimuovere l'eccesso di mezzo. Inserire i frammenti l'agarosio e posizionarle nella parte inferiore del piatto in plastica. Lasciare il gel di agarosio su ghiaccio per 5 min a solidificare.</li>
	<li>Una volta che l'agarosio si solidifica, invertire il piatto di plastica e utilizzare una spatola per rilasciare il gel intero.</li>
	<li>Utilizzare una lama affilata per tagliare l'agarosio in eccesso che circondano il frammento di tumore, lasciando 3-5 mm di gel intorno al tessuto.</li>
	<li>Montare ogni blocco di agarosio sul disco campione del vibratome con una goccia di colla del tessuto del cianoacrilato di butile atossico. Riempire la vasca tampone vibratome con PBS sterile ghiacciata e installare il disco esemplare nel vassoio.</li>
	<li>Taglio l'agarosio incorporato tessuto a 350 µm fette spesse. Regolare le impostazioni del vibratome ad una velocità di gamma lenta (0.2-0.3 mm/s) e la frequenza di vibrazione a una distanza media (1,5 mm).</li>
	<li>Utilizzando una pinzetta, raccogliere con cura le fette di tumori che sono tagliati e metterli sugli inserti di cultura delle cellule di una piastra a 6 pozzetti (punto 2.3). Trasferire 1 fetta su ogni inserto. Utilizzare grande cura nel maneggiare le fette come possono essere facilmente danneggiati.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta per posizionare le rondelle in acciaio inox su ogni fetta individuale. Assicurarsi che le rondelle sono ben posizionate su agarosio che circonda il tessuto del tumore.</li>
	<li>Mantenere la piastra di coltura a 37 ° C in un incubatore umidificato 5% CO2 per 10 min. dal procedere immunostaining.</li>
</ol>
3. Immunostaining di cellule T CD8 residenti e le cellule del tumore
<ol>
	<li>Diluire gli anticorpi (concentrazione finale di 10 µ g/mL) e il colorante nucleare (concentrazione finale di 1 µ g/mL) in RPMI-1640 media senza rosso fenolo. Nota: Utilizzare fluorescente-accoppiato anti-CD8 (IgG murine, clonare SK1) e anti-EpCAM (molecola di adesione delle cellule epiteliali) (HEA-125 di IgG murine) anticorpi per etichettare i linfociti T CD8 e tumore cellule epiteliali, rispettivamente. Utilizzare l'anticorpo fluorescente-accoppiato anti-CD90/Thy1 (IgG murine, clone 5E10) a etichetta fibroblasti e cellule endoteliali attivate. Utilizzare 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per etichettare il nucleo delle cellule con una membrana plasmatica compromessa al fine di valutare la vitalità del tessuto.</li>
	<li>Rimuovere le piastre di coltura dall'incubatrice e utilizzare una pipetta per aspirare qualsiasi liquido dentro le rondelle in acciaio inox. Non rimuovere il supporto di 1,1 mL RPMI-1640 posizionato sotto gli inserti di cultura cellulare (punto 2.3).</li>
	<li>Senza toccare la fetta e usare una pipetta, aggiungere 40 µ l di soluzione contengono gli anticorpi su ogni fetta di tumore.</li>
	<li>Incubare la piastra a 37 ° C per 15 minuti consentire la macchiatura dell'anticorpo.</li>
	<li>Con una pinzetta, togliere le rondelle, prendere le fette e tuffo loro 10 s in RPMI-1640 media senza rosso fenolo. Riposizionare le fette sugli inserti di cultura cellulare e aggiungere una goccia di rosso fenolo-libero RPMI-1640 medie su ogni fetta individuale. Mantenere la piastra a 37 ° C per 10 min. procedere all'imaging.</li>
</ol>
4. imaging e l'analisi di migrazione di cellule T CD8 residente all'interno di fette di tumore del polmone umano
Nota: Il microscopio confocale utilizzato nel presente protocollo è un montante filatura disco dotato di un obiettivo a immersione in acqua di 25x (25 x / 0,95 N.A.).
<ol>
	<li>Preparare l'installazione di microscopio<ol>
		<li>Impostare la temperatura della camera di calore del microscopio a 37 ° C un paio d'ore prima di iniziare la sessione di imaging.</li>
		<li>Impostare un sistema per irrorare costantemente fette di tumore con ossigenato (5% CO2, 95% O2) medium RPMI rosso fenolo-senza (Figura 1). Utilizzare una pompa peristaltica per il supporto di aspersione di flusso nella camera di imaging e aspirare la soluzione in un pallone di raccolta dei rifiuti.</li>
		<li>Eseguire la pompa peristaltica per consentire la soluzione ossigenata di passare attraverso i tubi di aspersione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Con una pinzetta, togliere la fetta dalla piastra a 6 pozzetti e trasferimento per il piatto di plastica 35 mm riempito con medium RPMI senza rosso fenolo. Immobilizzare la fetta con un ancoraggio di fetta 19.7 mm diametro con fili distanziati di 2 mm. Posizionare la piastra di Petri sul palco formazione immagine del microscopio. Collegare le punte di entrata e di uscita del sistema di perfusione. Accendere il sistema di perfusione e impostare la velocità di flusso media a 0,8 mL/min.</li>
	<li>Abbassare l'obiettivo a immersione in acqua per la fetta. Concentrarsi sulla parte superiore la fetta con la luce del campo luminoso.</li></ol>Utilizzando luce fluorescente appropriato, selezionare una regione di interesse che contiene cellule T CD8, isolotti di tumore (positivi per EpCAM) e una area dello stroma (positiva per CD90). Controllare la vitalità delle cellule all'interno della slice valutando DAPI colorazione alla superficie del taglio e più in profondità nel tessuto. Nota: Una sana fetta contiene solo una minoranza di cellule positive DAPI a diversi micron fra la superficie di taglio.
	<li>Impostare una sessione di imaging con le seguenti azioni.<ol>
		<li>A seconda dell'intensità del segnale fluorescente dei 3 fluorophores, impostare il tempo di esposizione tra 50 e 800 ms e l'intensità del laser tra 20-40%.</li>
		<li>Selezionare lo spessore della pila di z all'immagine all'interno della slice di tumore. Nota: Qui, 10-12 piani ottici che abbracciano una profondità totale di 60-70 µm nella dimensione z sono stati catturati.</li>
		<li>Selezionare la posizione di inizio a circa 10 µm sotto le prime cellule T CD8 con etichettate.</li>
		<li>Definire l'intervallo di tempo tra ogni immagine dello stack z tra 10 e 30 s e il tempo di registrazione totale tra 10 e 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizzare la migrazione di cellule T CD8 residente come descritto nel riferimento4.<ol>
		<li>Dopo avere importato i dati ad un software di monitoraggio, è possibile creare spot per ogni cellula di T di CD8 nel campo. Regolare il diametro delle celle e la soglia di rilevazione secondo sulle cellule fluorescenti imaged.</li>
		<li>Ispezionare le tracce e rimuovere qualsiasi traccia irrilevante eliminandole. Corrette brani di collegamento e scollegamento diverse tracce e diversi momenti delle stesse tracce. Esportare i dati (velocità, lunghezza di spostamento della pista) in un software di foglio di calcolo.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

Conflitti di interesse non dichiarati.

Una tecnica semplice, veloce e affidabile per la generazione di fette di tumore del polmone umano e valutazione del comportamento dinamico delle cellule T CD8 residenti in un ambiente preservato tumore usando un microscopio confocale è descritto. Questo protocollo è un perfezionamento di un precedente articolo di Giove che descrive il monitoraggio delle cellule di T placcate sulla murino di linfonodo fette2.
Imbianchimento di coloranti fluorescenti deve essere considerata specialmente con tinture di prima generazione come isotiocianato di fluorescina e ficoeritrina. Abbiamo trovato che si è verificato un pronunciato photobleaching di anticorpi direttamente accoppiato con un microscopio a due fotoni. Al contrario, minimal photobleaching è stato notato con microscopi confocali, specialmente usando coloranti fluorescenti luminose sviluppati recentemente.
Gli anticorpi sono molecole relativamente grandi e quindi la loro penetrazione nel tessuto può essere difficile. Questo passaggio può essere migliorato aumentando il tempo di incubazione. Inoltre, l'uso di un più piccolo colorazione reagenti come direttamente accoppiati frammenti Fab di anticorpi rappresenta una buona alternativa.
Tutti gli anticorpi descritti nel presente protocollo sono stati precedentemente convalidati e noti per la produzione di macchiatura luminoso4. Di conseguenza, isotype controlli non sono necessari. Tuttavia, se le modifiche a questo metodo utilizzando altri anticorpi sono desiderate, quindi l'uso di anticorpi di controllo isotipo raccomanda vivamente.
Questo sistema sperimentale presenta alcune limitazioni. La procedura di taglio danneggia il tessuto, che può influenzare il comportamento delle cellule T CD8, soprattutto vicino alla superficie di taglio. Inoltre, un numero di fattori solubili (es. chemochine) strumentale nel controllare la migrazione delle cellule di T può essere perso. Un modo per aggirare questi problemi è monitorando le cellule di T si trova a diverse decine di micron dalla superficie in regioni presumibilmente più sane del tessuto. Esperimenti pubblicati rivelano che T cellule localizzate nel tessuto profondo migrano più attivamente rispetto alle cellule T localizzate vicino la superficie tagliata4. Abbiamo usato microscopi confocali per i nostri studi, ma è probabile che due fotoni microscopi aumenterà la risoluzione spaziale in profondità.
Questo approccio si basa sull'uso di anticorpi fluorescente-accoppiato che non sono molecole neutre. Full-size anticorpi sono suscettibili di influenzare il normale funzionamento delle cellule di T in modi diversi. In primo luogo, gli anticorpi anti-CD8 possono alterare la migrazione delle cellule T innescando una cascata di segnalazione intracellulare in grado di pregiudicare il citoscheletro del linfocita. In secondo luogo, gli anticorpi anti-CD8 possono modulare l'interazione tra CD8 e MHC di classe I molecole, un passo importante nel processo di riconoscimento dell'antigene. In terzo luogo, intatti gli anticorpi possono legare ai recettori Fc espressi da molte cellule mieloidi distribuite nel tumore e quindi suscettibile per aumentare il segnale aspecifico. Non abbiamo alcuna indicazione che tale problema influenzato i nostri dati, probabilmente perché i recettori Fc delle cellule mieloidi residenti sono, a differenza delle cellule in coltura, saturi con le immunoglobuline presenti all'interno il milieu di tumore. Infatti, l'aggiunta di siero durante la procedura di etichettatura, un processo noto per bloccare i recettori Fc gratis, non ha cambiato l'immunocolorazione. Tuttavia, frammenti Fab di anticorpi, privo di regione Fc, come pure gli anticorpi mutato nella loro regione di Fc e di frammenti di camelide-derivato dell'anticorpo8 rappresentano altre strategie alternative per tenere traccia di cellule residenti con traccianti fluorescenti.
Negli ultimi decenni, diversi sistemi modello sono stati sviluppati e utilizzati per l'imaging in tempo reale dei linfociti T. Questi includono preparati in vitro di T cellule precedentemente purificate e coltivate con cellule presentanti l'antigene. Tali preparazioni hanno consentito notevoli progressi nella definizione dei meccanismi di riconoscimento dell'antigene e la reattività. Tuttavia, mancano la complessità dell'ambiente del tessuto. Altre preparazioni sono state stabilite che più strettamente imitare la struttura di un tessuto nativo. Per esempi, matrici di gel di collagene tridimensionale in cui purificato le cellule T sono stati incorporati, come pure di cultura del tessuto reaggregated frammenti sono stati utilizzati per monitorare il comportamento dinamico dei linfociti T con fluorescenti imaging technologies9 . Questi sistemi presentano il vantaggio di un'architettura in prossimità del tessuto nativo, ma mancano di altri importanti fattori cellulari e solubile. Nel topo, microscopia intravital due-fotone è stata impiegata per tenere traccia di cellule di T in un ambiente veramente fisiologico di un organo intatto10. Tuttavia, tale approccio è tecnicamente difficile da impostare. Inoltre, i modelli murini mostrano notevoli differenze con la fisiologia umana.
La tecnica descritta in questo protocollo rappresenta un ambiente complesso e multi-cellulare del tumore che è posizionato per agire come un importante collegamento tra studi di co-coltura e modelli animali.
Il protocollo descritto nel presente documento è utilizzabile anche per la motilità di altre cellule di linfociti T CD8, per il quale sono stati generati gli anticorpi di rilevamento. Inoltre, la tecnica può essere adattata ad altri tumori umani e murini e tessuti. Per esempio, siamo stati in grado di immagine in tempo reale le dinamiche delle cellule B etichettate con un anticorpo anti-CD19 nelle tonsille umane fresche.
La tecnica descritta in questo protocollo permette di schermo per terapeutici molecole che controllano la motilità delle cellule T nei tessuti. L'accessibilità del sistema cultura permette di applicare alcuni reagenti farmacologiche e loro conseguenze sulla migrazione delle cellule di T di prova. Ora è accettato che in crescita i tumori, le cellule T CD8 esibiscono una bassa migrazione e ridotto contatti con tumore cellule11. D'importanza, la scarsa presenza di cellule di T nelle regioni delle cellule del tumore è associata con un risultato difettoso ed è considerata come uno dei meccanismi di resistenza ad immunoterapia basata a cellula T del cancro. Più ostacoli che limitano le cellule T dalla migrazione nei tumori sono stati identificati compreso una densa matrice extracellulare. A questo proposito, l'identificazione di molecole in grado di ripristinare la motilità delle cellule T e interazione con le cellule maligne rappresenta un passo importante nell'immunoterapia del cancro. In uno studio precedente, abbiamo trovato che una parziale degradazione del collagene con collagenasi, acutamente applicato a fette di polmone umano, migliora il contatto delle cellule di T con le cellule del tumore.
Infine, la possibilità di tenere fette umane del tumore nella cultura per fino a parecchi giorni7,12,13 offre un numero di applicazioni promettenti in termini di cellule T e l'immunoterapia.Tuttavia, la stabilità del sistema modello durante la coltura a lungo termine è un parametro importante che deve essere accuratamente valutata.
Ottenere il tessuto fresco e sano è un fattore critico per la produzione di fette di qualità con buona immunostaining di elementi stromali, le cellule del tumore e cellule CD8. Mantenere la biopsia del tumore a 4 ° C prima della trasformazione è cruciale.
La gestione delle fette con una pinzetta rappresenta un altro passo fondamentale all'interno di questo protocollo. Questo deve essere eseguito con molta cura, come l'agarosio può essere facilmente danneggiato. Un taglio in agarosio compromette la tenuta dalla rondella in acciaio inox conseguente a una perdita dell'anticorpo contenenti soluzioni.

Le cellule T CD8 gioca un ruolo chiave nella battaglia contro il cancro. Tuttavia, molti meccanismi soppressivi impediscono i linfociti T di uccidere le cellule maligne. Negli ultimi anni, diverse strategie promettenti che rilasciare i freni sulle cellule di T sono state sviluppate e utilizzate in clinica5. I due approcci che mantengono una notevole attenzione sono immuni di checkpoint multitargeting anticorpi, come le terapie con cellule T anti-PD-1 e adottivi. Tuttavia, malgrado i recenti successi, solo un sottoinsieme dei pazienti beneficiare di queste terapie6. Una sfida importante è quello di identificare i meccanismi di resistenza all'immunoterapia del cancro al fine di sviluppare trattamenti più efficaci. Un'altra sfida è sviluppare sistemi di modello nel quale romanzo terapie possono essere caratterizzate e testate per la loro potenza e sicurezza. Finora, la maggior parte di questi test si basano su sistemi di coltura in vitro delle cellule che mal imitano la complessità del tessuto del tumore.
Ex vivo fettine di tessuto è una tecnica promettente, in quanto conserva l'originale tessuto microambiente7. Nel corso degli anni, abbiamo istituito questo approccio per monitorare le dinamiche dei linfociti T in vari tessuti. I nostri risultati indicano che cellule T fluorescente contrassegnate aggiunta in cima murino di linfonodo fette migrano nel tessuto e rispondere a loro appropriati stimoli microambientali1,2. Allo stesso modo, linfociti T sovrapposti su fette di tumore del polmone umano sono rapidamente reclutati nello stroma del tumore3. Utilizzando questa tecnica, abbiamo identificato la matrice extracellulare come elemento importante nel controllare la distribuzione e la migrazione delle cellule di T all'interno di tumori umani3,4. Perché il comportamento di ex vivo purificato e placcate cellule di T non riflette necessariamente il comportamento dei residenti intratumoral T linfociti, recentemente abbiamo raffinato questo approccio4.
Qui descriviamo un protocollo per tenere traccia di linfociti T residenti all'interno di fette fatta dai tumori del polmone umano fresco. Le diverse fasi consistono della preparazione di fette di tumore del polmone umano (compresi l'incorporamento di agarosio e vibratome sezionamento del tessuto incorporato), la colorazione delle cellule di T endogene con anticorpi fluorescenti in fette fresche del tumore e il monitoraggio di Queste cellule con un microscopio confocale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

Delle cellule T CD8 sono attori chiave nella lotta contro il cancro. Affinché le cellule T CD8 uccidere le cellule tumorali che hanno bisogno di entrare nel tumore, migrano all'interno del microambiente tumorale e rispondere adeguatamente agli antigeni tumorali. Il recente sviluppo di approcci di imaging migliorati, come il microscopio 2 fotoni e l'uso di modelli di mouse potente del tumore hanno fatto luce su alcuni dei meccanismi che regolano l'attività delle cellule di T di anti-tumorale. Considerando che tali sistemi hanno fornito preziose informazioni, non sempre prevedere le reazioni umane. Nell'essere umano, la nostra conoscenza nel campo proviene principalmente da una descrizione dei campioni di tumore fisso da pazienti umani, come pure gli studi in vitro . Tuttavia, in vitro modelli mancano il milieu di tumore tridimensionale complessa e, pertanto, sono approssimazioni incomplete in vivo di attività delle cellule T. Fette fresche fatta da tessuto explanted rappresentano un ambiente complesso e multi-cellulare del tumore che può agire come un importante collegamento tra studi di co-colti e modelli animali. Originariamente impostato in murino linfonodi1 e precedentemente descritto in un articolo di Giove2, questo approccio è stato recepito ora a tumori umani per esaminare le dinamiche di placcato3 così come il residente di cellule di T4.
Qui, un protocollo per la preparazione di fette di tumore del polmone umano, immunostaining di cellule T CD8 e tumore residenti e il tracciamento dei linfociti T CD8 nel microambiente del tumore usando la microscopia confocale è descritto. Questo sistema è in modo univoco disposto alla schermata per gli agenti di immunoterapia romanzo favorendo la migrazione delle cellule T nei tumori.

Tumori del polmone umano sono solitamente altamente infiltrati in cellule di T di CD8 che preferenzialmente si trovano in stroma3,4. Seguendo questo protocollo uno deve aspettarsi di visualizzare un gran numero di immunostained T CD8 in fette di tumore del polmone umano. Un co-etichettatura con anticorpi anti-EpCAM e anti-CD90 dovrebbe consentire di delineare aree stromal e isolotti del tumore. Collagene fibrillare, abbondanti nello stroma del tumore, possono essere visualizzate senza macchiare esogeno mediante generazione di seconda armonica in un microscopio a due fotoni3,4. Si noti che alcuni tumori polmonari umane non presentino nessuna chiara distinzione tra isolotti del tumore e lo stroma. Tali tumori devono essere eliminati così come esemplare che presenta ampie aree di necrosi cellulare identificato dal legame non specifico degli anticorpi e colorazione DAPI. Coerente con i risultati pubblicati ottenuti nel polmone umano e carcinomi ovarici, cellule T CD8 residenti sono più concentrate nello stroma rispetto al tumore isolotti4. Un esempio rappresentativo della distribuzione delle cellule T CD8 in relazione alle cellule del tumore e CD90 è illustrato nella Figura 2.
Il dosaggio di fetta permette l'analisi della motilità di cellule T residenti nelle regioni differenti del tumore. Criteri utili per il confronto di motilità delle cellule T CD8 in diverse regioni includono la velocità media (lunghezza del percorso divisa per la durata di tempo campionata) e la lunghezza di spostamento (il vettore tra l'inizio e la fine di una traccia). Anche se limitato in isolotti del tumore, le cellule T CD8 migrano più attivamente in questo comparto rispetto allo stroma (Figura 3). In media, la velocità media delle singole cellule di T di CD8 dovrebbe essere vicino ai 4 µm/min nello stroma del tumore con alta intra e Inter-tumore variabilities4. Nello stroma del tumore, la motilità delle cellule T residenti è fortemente influenzata dalla densità e orientamento di matrice extracellulare fibre3,4. Un esperimento riuscito si tradurrà in meno cellule T presenti nelle aree di matrice densa rispetto alle regioni di matrice sciolto, coerente con i risultati pubblicati3,4.
Si noti che alcuni tumori del polmone umano presentano un altissimo livello di autofluorescenza precludendo imaging delle cellule T residenti. Tale caratteristica è rapidamente osservato all'inizio della sessione di imaging. Autofluorescent tumori dovrebbero essere scartati. Un esempio rappresentativo di cellule T CD8 residenti in un tumore autofluorescent è illustrato nella Figura 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
Figura 1: fotografie del sistema aspersione. A) la soluzione RPMI privo di rosso fenolo viene arricchita in 5% C02, 95% O2. B) la soluzione è quindi irrorata da una pompa peristaltica. C) la soluzione RPMI entra piastra di coltura tramite l'ingresso. All'uscita, la soluzione viene aspirata dalla pompa dalla camera in un contenitore per rifiuti. Si noti che la punta di aspirazione è impostata a un livello per determinare l'altezza di soluzione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
Figura 2: distribuzione di residente CD8 T cellule in un tumore del polmone umano. Immagine rappresentativa di una fetta di tumore del polmone umano macchiato per CD8 (verde), EpCAM (blu) e CD90 (rosso). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
Figura 3: motilità del residente CD8 T cellule in un tumore del polmone umano. Traiettorie di singole cellule T CD8 residenti in stromal (rosso) e regioni (blu) delle cellule del tumore di una fetta di carcinoma polmonare umano. La fetta è stata macchiata con gli anticorpi indicati e imaged per 20 min con un microscopio confocale. Il collagene fibrillare è stato rilevato alla fine mediante generazione di seconda armonica (SHG) su un microscopio a due fotoni. Tracce sono colorate secondo la lunghezza di spostamento delle cellule T CD8. Questa immagine è stata modificata da 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
Figura 4: immagine rappresentativa di un tumore del polmone umano autofluorescent. La fetta di tumore è stata macchiata per CD8 (verde) ed EpCAM (blu). Il segnale SHG è in rosso. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Questo protocollo descrive un metodo per immagine residente tumore-infiltrazione CD8 T cellule identificate con gli anticorpi fluorescente accoppiati all'interno di fette di tumore del polmone umano. Questa tecnica permette in tempo reale analisi di migrazione delle cellule T CD8 usando la microscopia confocal.

Ex Vivo Imaging dei linfociti T CD8 residente nel tumore del polmone umano mediante microscopia confocale a fette

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

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