Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

피에르 Bourdoncle와 코 친 영상 시설 (인 코 친, 파리) 조언과 지원을 위한 토마스 Guilbert 현미경 감사 하 길. 이 작품은 부분적으로 지원 국가 프랑스 리그 죄수 르 암, CARPEM (맞춤 의학에 대 한 암 연구)에 의해에서 교부 금에 의해 Fondation 드 프랑스와 부여에서 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 계약 없음 667980 (캐럿)입니다.

인간의 종양 계약 프랑스 윤리 위원회의 및 프랑스 법률의 기사 L.1121-1 응용 프로그램에서 지원 Publique-Hôpitaux 드 파리 (AP-HP)에 의해 얻은 했다. 서 면된 통지 해준 동의 연구에 포함 하기 전에 환자 로부터 얻은 것입니다.
1. 인간의 폐 종양을 얻기
<ol>
	<li>그들의 폐 종양4의 완전 한 외과 절제술 수술 단계-III 비 작은 세포 폐암 환자에서 신선한 폐 종양 샘플을 가져옵니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI 1640) 매체를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 고정 되지 않은 신선한 종양을 전송 합니다. 2.7 단계까지 30 분 동안 얼음에 따로 설정 합니다. 참고: 종양은 오후에 받으면 넣어 하룻밤에 4 ° C 및 프로세스는 다음 날에. 이 경우 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 RPMI 1640 미디어 보충.</li>
</ol>
2. Agarose 포함 하 고 vibratome 인간의 폐 종양의 슬라이스
참고: 무 균 조건 하에서 2.10까지 모든 단계를 수행 합니다.
<ol>
	<li>1 g 낮은 녹는 포인트 agarose 인산 버퍼 (PBS) 염 칼슘 및 마그네슘의 살 균 20 mL에 용 해 하 여 포함 5 %agarose 솔루션을 준비 합니다. 이 솔루션을 마이크로파는 agarose는 완전히 녹아 때까지. 37 ° C에서 37 ° C에서 5 분 동안 인큐베이터에 솔루션을 배치 하 여 냉각 agarose를 허용 합니다.</li>
	<li>조직 문화 후드, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 4 m m L 글루타민 그리고 페니실린과 스 x 1 (페 놀 레드) 없이 완전 한 RPMI 1640 매체를 준비 합니다.</li>
	<li>6 잘 셀 문화 접시에 잘 당 1.1 mL 전체 RPMI 1640 매체를 추가 하 고 각 우물에서 30 mm 셀 문화 삽입 장소. 정해 접시 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 단계 2.12까지.</li>
	<li>장소는 35 m m 플라스틱 접시 가득 RPMI 완전 한 매체에에서 스테인리스 플랫 와셔 (내경 5 mm, 10 mm의 직경 및 두께 1 mm의 외부의)을 멸 균. 와셔는 vibratome 컷 슬라이스에 항 체를 집중을 더 사용 됩니다.</li>
	<li>10 cm 플라스틱 접시에 종양 생 검을 놓고 약 5 x 5 m m 길이의 작은 큐브 모양 조각으로 날카로운 블레이드와 종양을 잘라.</li>
	<li>인큐베이터에서 agarose를 꺼내와 35 m m 플라스틱 그릇에 솔루션을 붓는 다.</li>
	<li>집게의 쌍을 사용 하 여 신중 하 게 매체의 초과 제거 하는 조직 없애 종양 조각을 전송. agarose 조각을 삽입 하 고 플라스틱 접시의 바닥에 그들을 배치. Agarose 젤을 강화 하기 위해 5 분 동안 얼음에 둡니다.</li>
	<li>일단는 agarose 굳은 플라스틱 접시를 반전 하 고 전체 젤을 주걱을 사용 하 여.</li>
	<li>날카로운 블레이드를 사용 하 여 주변 조직 주위 젤의 3-5 m m를 떠나는 종양 조각 초과 agarose 트림.</li>
	<li>비-독성 부 틸 cyanoacrylate 조직 접착제의 방울으로는 vibratome의 견본 디스크에 각 agarose 블록을 탑재 합니다. 살 균 얼음 처럼 차가운 PBS를 가진 vibratome 버퍼 트레이 표본 디스크 트레이에 설치.</li>
	<li>잘라내기는 agarose 350 µ m 두꺼운 조각으로 조직 포함. Vibratome 설정을 느린 범위 속도 조정 (0.2-0.3 m m/s)와 진동 주파수는 중간 범위 (1.5 m m)에서.</li>
	<li>절단 되 고 6 잘 플레이트 (2.3 단계)의 셀 문화 삽입에 평평 넣어 종양 조각 수집 신중 하 게 미세 집게를 사용 하 여. 1 조각에 각 삽입 전송. 주의 사용 하 여 쉽게 파손 될 수 있으므로 분할 영역을 처리할 때.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여 각 개별 슬라이스에 스테인레스 스틸 와셔를 놓습니다. 와셔 종양 조직을 둘러싼 agarose 잘 배치는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>5% CO2 습도 인큐베이터 immunostaining 10 분 진행에 대 한에서 37 ° C에서 문화 접시를 유지 합니다.</li>
</ol>
3. 거주 CD8 T 세포와 종양 세포의 Immunostaining
<ol>
	<li>항 체 (최종 농도 10 µ g/mL)와 RPMI 1640 미디어 페 놀 레드 없이 핵 염료 (최종 농도 1 µ g/mL)을 희석. 참고: 사용 붙일 결합 안티-CD8 (murine IgG SK1 복제) 및 안티-EpCAM (상피 세포 접착 분자) (murine IgG 좋음-125) 레이블을 CD8 T 세포 및 종양, 상피 세포 각각에 항 체. 레이블 섬유 아 세포와 활성화 된 내 피 세포 항 체 붙일 결합 안티-CD90/Thy1 (murine IgG, 클론 5E10)를 사용 합니다. 사용 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 조직 생존 능력을 평가 하기 위해 손상 된 원형질 막 세포의 핵을.</li>
	<li>인큐베이터에서 배양 배지를 제거 하 고 스테인레스 스틸 와셔 내부 액체를 발음 하는 피 펫을 사용 하 여. 1.1 mL RPMI 1640 미디어 셀 문화 삽입 (2.3 단계) 아래에 배치 제거 하지 마십시오.</li>
	<li>슬라이스를 만지기 없이 피 펫 팁을 사용 하 여 각 종양 조각에 항 체를 포함 하는 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>항 체 얼룩이 지기 수 있도록 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>좋은 집게, 와셔를 제거, 조각, 및 딥 그들 10의 RPMI 1640 미디어 페 놀 레드 없이 밖으로 데리고. 다시 셀 문화 삽입에 분할 영역을 배치 하 고 페 놀 레드 무료 RPMI-1640의 한 방울을 추가 각 개별 슬라이스에 중간. 이미징에 37 ° C 10 분 진행에서 접시를 유지 합니다.</li>
</ol>
4. 상상 하 고 인간 폐 종양 조각 내 거주 CD8 T 세포 마이그레이션 분석
참고:이 프로토콜에서 사용 하는 confocal 현미경은 물 침수 목표 x 25를 장착 하는 디스크를 회전 하는 직 립 (25 x / 0.95 없음).
<ol>
	<li>현미경 설치 준비<ol>
		<li>이미징 세션을 시작 하기 전에 몇 시간 37 ° C에서 현미경 열 챔버의 온도 설정 합니다.</li>
		<li>설정 시스템을 지속적으로 perfuse와 종양 조각 산소 (5% CO2, 95% O2) 페 놀 레드 무료 RPMI 매체 (그림 1). 연동 펌프를 사용 하 여 이미징 챔버로 관류 미디어 흐름 쓰레기 플라스 크에 대 한 해결책을 발음.</li>
		<li>관류 튜브를 통해가 서 산소 솔루션 수 있도록 연동 펌프를 실행 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>좋은 집게와 6 잘 플레이트 및 전송 35 m m 플라스틱 접시를 가득 페 놀 레드 무료 RPMI 매체에서 슬라이스를 꺼내. 2 mm 간격 스레드 19.7 m m 직경 슬라이스 앵커와 슬라이스 무력화 현미경의 이미징 단계에 페 트리 접시를 놓습니다. 관류 시스템의 입구 및 출구 팁을 연결 합니다. 켜고 관류 시스템 0.8 mL/min로 미디어 흐름 속도 설정 합니다.</li>
	<li>물 침수 목표는 슬라이스를 낮춥니다. 밝은 분야 빛 조각 위에 초점.</li></ol>적절 한 형광등을 사용 하 여, CD8 T 세포, 종양 독도 (EpCAM 양수)와 기질 (CD90 양수)를 포함 하는 관심의 영역을 선택 합니다. 조직에 DAPI 잘라 표면에 얼룩과 깊이 평가 하 여 슬라이스 내의 세포의 생존 능력을 확인 합니다. 참고: 건강 한 조각 잘라 표면에서 몇 미크론에서 DAPI 긍정적인 세포의 단지 소수 민족을 포함합니다.
	<li>다음 작업으로 이미징 세션을 설정 합니다.<ol>
		<li>3 fluorophores의 형광 신호 강도 따라 20 ~ 40% 사이 레이저 강도 50 ~ 800 ms 사이의 노출 시간을 설정 합니다.</li>
		<li>Z 스택 두께 종양 조각 내에서 이미지를 선택 합니다. 참고: 여기, 10-12 광 평면 z 차원에서 60-70 µ m의 총 깊이 확장 했다 점령.</li>
		<li>첫 번째 레이블이 CD8 T 세포 아래 약 10 µ m에서 시작 위치를 선택 합니다.</li>
		<li>10 ~ 30 사이 각 z 스택 이미지 사이의 시간 간격을 정의 s와 10 ~ 30 분 사이 총 녹화 시간.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>참조4에 설명 된 대로 주민 CD8 T 세포 마이그레이션 분석.<ol>
		<li>추적 소프트웨어를 데이터를 가져온 후 필드에 각 CD8 T 세포에 대 한 관광 명소를 만듭니다. 셀의 직경 및 탐지 군데 형광 세포에 따라 임계값을 조정 합니다.</li>
		<li>트랙을 검사 하 고 그들을 삭제 하 여 무관 한 트랙을 제거 합니다. 연결 하 고 다른 트랙과 같은 트랙의 다른 시간 점에 분리 하 여 올바른 추적 합니다. 스프레드시트 소프트웨어를 (트랙 속도, 트랙 변위 길이) 데이터를 내보냅니다.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

Confocal 현미경을 사용 하 여 보존된 종양 환경에서 인간의 폐 종양 조각 및 거주 CD8 T 세포의 동적 행동의 평가 생성 하기 위한, 빠르고, 간단 하 고 강력한 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜은 murine 림프 노드 조각2에 도금 된 T 세포의 모니터링에 대해 설명 하는 이전 정돈 문서 상세입니다.
형광 염료의 표백 fluorescein isothiocyanate phycoerythrin 같은 1 세대 염료와 특히 고려 되어야 한다. 우리는 직접 결합 된 항 체의 발음된 photobleaching 2 광자 현미경으로 발생 한 것을 발견. 반대로, 최소한의 photobleaching는 confocal 현미경, 특히 최근 개발 된 밝은 형광 염료를 사용 하 여 함께 발견 되었다.
항 체는 상대적으로 큰 분자 고 따라서 조직으로의 침투 더 어려울 수 있습니다. 이 단계는 부 화 시간이 증가 하 여 개선할 수 있습니다. 또한, 작은 사용 좋은 대안 항 체 나타냅니다의 시 약 같은 직접 커플링 Fab 조각 얼룩.
이 프로토콜에서 설명 하는 모든 항 체 이전 유효성을 검사 하 고 되었습니다 밝은 얼룩4를 생산 알려져. 따라서, isotype 컨트롤이 필요 하지 않습니다. 그러나, 다른 항 체를 사용 하 여이 메서드를 수정 원하는 경우 다음 isotype 제어 항 체의 사용이 좋습니다.
이 실험적인 시스템 몇 가지 한계를 선물 한다. 절단 절차 CD8 T 세포, 특히 절단된 표면 근처의 동작에 영향을 미칠 수 있습니다 조직을 손상 됩니다. 또한, 수용 성 요인 (예: 발산) T 세포의 이동 제어에 손실 될 수 있습니다. 아마도 건강 한 지역 조직의 표면에서 미크론의 몇몇 10에 있는 T 세포를 모니터링 하 여 이러한 문제를 무시 하는 한 방법이입니다. 게시 된 실험 공개 T 세포 조직 내의 깊은 지역화 지역화4컷된 표면 근처 T 세포 보다 더 적극적으로 마이그레이션할. 우리는 우리의 연구 confocal 현미경을 사용 하지만 가능성이 두 광자 현미경 깊이에 공간 해상도 증가 합니다.
이 이렇게 되지 않는 중립 분자는 붙일 결합 항 체의 사용에 의존 합니다. 전체 크기의 항 체는 다른 방법으로 T 세포의 정상적인 작동에 영향을 미칠을 따르게 됩니다. 첫째, 안티 CD8 항 체 림프 구의 골격에 영향을 미치는 수는 세포내 신호 폭포를 실행 하 여 마이그레이션 T 셀을 변경할 수 있습니다. 둘째, 안티-CD8 항 체 CD8와 MHC 사이 상호 작용을 조절 수 종류 I 분자, 항 원 인식 과정에서 중요 한 단계. 셋째, 그대로 항 체 Fc 수용 체는 종양에서 분산 고 따라서 많은 골수성 세포에 의해 표현 일반적인 신호 증가를 바인딩할 수 있습니다. 우리는 같은 문제에 영향 받는 우리의 데이터 표시 아마 거주 골수성 세포의 Fc 수용 체, 세포 문화에, 달리 포화 면역 글로불린 종양 환경 내에서 존재 하기 때문에. 실제로, 라벨링 절차, 무료 Fc 수용 체를 차단 하 알려져 있는 과정 동안 혈 청의 추가 immuno 얼룩이 지를 변화 하지 않았다. 그럼에도 불구 하 고, 항 체, 항 체로 서 Fc 지역에 없는 Fab 조각 그들의 Fc 지역에 돌연변이 camelid 파생 된 항 체 파편8 대표 형광 추적기와 주민 셀을 추적 하기 위해 다른 대안 전략.
지난 수 십년 동안 여러 모델 시스템 개발 고 T 림프 톨의 실시간 이미징에 대 한 사용 되었습니다. T 세포 이전 정화 하 고 교양으로 항 원 제시 세포의 체 외에 준비 포함 됩니다. 이러한 준비 놀라운 진행의 항 원 인식 및 응답 메커니즘을 정의할 수 있다. 그러나, 그들은 조직 환경의 복잡성을 부족합니다. 다른 준비는 더 밀접 하 게 기본 조직 구조 모방 설치 되었다. 예를 들면, 정화 T 셀에 3 차원 콜라겐 젤 매트릭스 되었습니다 포함, reaggregated 조직 파편 형광 이미징 기술9와 T 림프 톨의 동적 동작을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다의 문화 뿐만 아니라 . 이 시스템 기본 조직에 가까운 아키텍처의 장점을 제시 하지만 그들은 다른 중요 한 세포 및 녹는 요소 부족. 마우스, 두 광자 intravital 현미경 그대로 기관10의 진정으로 생리 적인 환경에서 T 셀을 추적 하기 위해 고용 되었다. 그러나, 이러한 접근을 설정 하려면 기술적으로 어렵습니다. 또한, 마우스 모델 인간의 생리와 함께 주목할 만한 차이 보여줍니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 기술을 공동 문화 연구 및 동물 모델 사이의 중요 한 링크 역할을 고유 하 게 배치 된 복잡 한 다중 세포 종양 환경을 나타냅니다.
여기에 설명 된 프로토콜 CD8 T 세포 항 체 생성 된 보다 다른 세포의 운동 성을 추적 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 기술은 다른 인간과 murine 종양 및 조직에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 신선한 인간의 편도 선에 안티 CD19 항 체와 함께 실시간으로 B 세포의 역학 표시 된 이미지를 수 있다.
이 프로토콜에서 설명 하는 기술은 치료 분자 조직에서 T 세포 운동 성 제어에 대 한 화면을 수 있습니다. 문화 시스템의 접근 허용 일부 약리 시 약을 적용 하 고 T 세포 이동에 그들의 결과 테스트 합니다. 그것은 지금 종양 성장, CD8 T 세포 전시 낮은 마이그레이션 허용 하 고 종양 세포11과 접촉을 감소. 중요 한 것은, 종양 세포 지역에서 T 세포의 부족 한 존재 나쁜 결과와 연결 되어 있으며 T 세포 기반 암 immunotherapy에 저항 메커니즘 중 하나 간주 됩니다. T 세포 종양에 이주를 제한 하는 여러 장애물 밀도 기질을 포함 하 여 확인 되었습니다. 이 점에서 분자 T 세포 운동 성 및 악성 세포와 상호 작용 수의 식별 암 immunotherapy에서 중요 한 단계를 나타냅니다. 이전 연구에서 우리는 심하게 인간의 폐 조각에 적용 하는 콜라와 함께 콜라겐의 부분 저하 종양 세포와 T 세포의 접촉을 향상 발견.
마지막으로, 몇 일7,,1213 까지 대 한 문화에서 인간의 종양 조각 유지 가능성 T 세포와 immunotherapy의 기간에서 유망한 응용 프로그램의 수를 제공 합니다.그러나, 긴 기간 문화 중 모델 시스템의 안정성은 철저 하 게 평가 하는 중요 한 매개 변수.
신선 하 고 건강 한 조직을 얻는 품질 조각의 좋은 immunostaining와 CD8 세포, 종양 세포와 기질 요소를 생산 하는 중요 한 요소 이다. 종양 생 검 처리 하기 전에 4 ° C에서 유지 하는 것이 중요 합니다.
좋은 집게와 조각의 처리가이 프로토콜 내에서 또 다른 중요 한 단계를 나타냅니다. 이 agarose는 쉽게 손상 될 수 있습니다로 큰 관심과 함께 수행 되어야 한다. agarose에서 컷 인감 스테인리스 세탁기 결과 솔루션을 포함 하는 항 체의 누설에 의해 손상 됩니다.

CD8 T 세포는 암에 대 한 전투에서 핵심적인 역할을 재생. 그러나, 많은 진압 메커니즘 악성 세포를 죽이에서 T 세포를 방지 합니다. 지난 년 동안 T 세포에 브레이크를 해제 하는 몇 가지 유망한 전략 개발 고 클리닉5에 사용 되었습니다. 상당한 관심을 유지 하는 두 가지 접근은 면역 검사점을 대상으로 안티-PD-1 및 입양 T 세포 치료 등 항 체. 그럼에도 불구 하 고, 최근 성공에도 불구 하 고 환자의 일부만 혜택을 이러한 치료6. 주요 도전 더 효율적인 치료를 개발 하기 위하여 암 immunotherapy 저항 메커니즘을 식별 하는 것입니다. 또 다른 도전 어떤 소설에서 치료 특징 및 테스트할 수 그들의 힘 및 안전에 대 한 모델 시스템을 개발 하는 것입니다. 지금까지,이 분석 실험의 대부분은 체 외에서 세포 배양 시스템을 제대로 종양 조직의 복잡성을 모방 기반으로 합니다.
그것은 원래 조직 microenvironment7보존 조직 조각 비보 전 유망 기술입니다. 년 동안, 우리는 다양 한 조직에서 T 세포의 역학을 추적할이 접근 방식을 설정 했습니다. 우리의 결과 murine 림프 노드 조각 꼭대기 추가 붙일 레이블이 T 세포 조직으로 마이그레이션할 그들의 적절 한 microenvironmental 신호1,2응답 나타냅니다. 마찬가지로, 인간의 폐 종양 조각에 중첩 하는 T 림프 톨은 급속 하 게 종양 기질3으로 보충 했다. 이 기술을 사용 하 여, 우리 인간의 종양3,4내 T 세포의 마이그레이션 및 배포를 제어에서 중요 한 요소로 세포 외 기질을 확인 했습니다. 정화 하는 ex vivo의 동작 때문에 도금 된 T 세포는 반드시 주민 intratumoral T 림프 톨의 동작을 반영 하지 않는다, 우리 최근이 접근4세련 되는.
여기는 신선한 인간의 폐 종양에서 만든 조각 내 거주 T 세포를 추적 하는 프로토콜에 설명 합니다. 신선한 종양, 슬라이스와의 모니터링에서 형광 항 체와 T 세포 내 생의 얼룩 조각의 인간의 폐 종양 (를 포함 하 여 agarose 포함 및 vibratome 포함 된 조직의 단면), 준비의 다른 단계 구성 confocal 현미경이 셀.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

CD8 T 세포는 암과의 싸움에서 중요 한 선수. CD8 T 세포 종양 세포를 죽 일에 대 한 종양에 입력 하는 데 필요한, 종양 microenvironment 내에서 이동 하며 종양 항 원에 적절 하 게 응답. 2 광자 현미경 등 향상 된 이미징 접근의 최근 개발 및 강력한 마우스 종양 모델의 사용 항 종양 T 세포 활동을 조절 하는 메커니즘의 일부에 빛을 발산 했습니다. 반면 이러한 시스템은 귀중 한 통찰력을 제공, 그들은 항상 인간의 응답을 예언 하지 않는다. 인간에 분야에서 우리의 지식을 주로 생체 외에서 연구 뿐만 아니라 인간 환자에서 고정된 종양 샘플의 설명에서 온다. 그러나, 생체 외에서 모델 복잡 한 3 차원 종양 주위 부족 그리고, 따라서, 생체 내에서 의 불완전 한 근사 T 세포 활동. 신선한 조각 explanted 조직에서 만든 공동 교양된 연구 및 동물 모델 사이의 중요 한 링크 역할을 할 수 있는 복잡 한 다중 세포 종양 환경을 나타냅니다. 원래 murine 림프절1 에서 설정 하 고 이전 정돈 제2에 설명 된,이 이렇게는 지금 인간의 종양 도금된3 뿐만 아니라 거주 T 세포4의 역학 검사로 조 변경 되었습니다 있습니다.
여기, 인간의 폐 종양 조각 준비, 주민 CD8 T와 종양 세포의 immunostaining 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 종양 microenvironment 내에서 CD8 T 림프 톨의 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 시스템은 고유 하 게 종양에서 T 셀 마이그레이션 좋아하는 소설 immunotherapy 에이전트에 대 한 화면에 배치.

인간의 폐 종양은 일반적으로 매우 우선적으로 기질3,4에서 발견 되는 CD8 T 세포에 침투 됩니다. 이 프로토콜에 따라 한 인간의 폐 종양 조각에 CD8 T immunostained의 많은 수를 시각화를 기대 해야 한다. 안티-EpCAM 및 안티 CD90 항 체와 공동 레이블 영역과 stromal 종양 독도 윤곽을 그리 다 허용 해야 합니다. 원 콜라겐, 종양 기질에 풍부한 외 인 2 광자 현미경3,4에 두 번째 고조파 생성을 사용 하 여 얼룩 없이 구상 될 수 있다. 참고 일부 인간의 폐 종양 종양 독도 기질 사이 명확한 구별을 제시 합니다. 이러한 종양 세포 괴 사 항 체의 비 특정 바인딩 및 DAPI 얼룩 식별의 넓은 영역을 제시 하는 견본 뿐만 아니라 폐기 해야한다. 게시 된 결과와 일치 인간의 폐 및 난소 carcinomas, 주민 CD8 T 세포는 더 집중 종양 독도4에 비해 기질에서. 종양 세포과 CD90 CD8 T 세포 분포의 대표적인 예는 그림 2에 표시 됩니다.
분할 영역 분석 결과 다른 종양 지역에서 주민 T 세포 운동 성 분석에 대 한 수 있습니다. 다른 지역에서 CD8 T 세포 운동 성 비교에 대 한 유용한 기준 평균 속도 (경로 길이 샘플링 기간으로 나눈 값) 등 변위 길이 (시작 및 끝 트랙의 사이 벡터). 비록 종양 독도에 부족, CD8 T 세포 기질 (그림 3)에 비해이 구획에 더 적극적으로 마이그레이션합니다. 평균, 개별 CD8 T 세포의 평균 속도 4 µ m/min 높은 내부 및 간 종양 variabilities4종양 기질에 가까이 있어야 한다. 종양 기질에 거주 하는 T 세포의 운동 성 밀도 기질 섬유3,4의 방향에 의해 강하게 좌우 된다. 성공적인 실험 느슨한 행렬 영역, 게시 결과3,4일치에 비해 고밀도 매트릭스 지역에 적은 T 세포에서 발생 합니다.
Note는 어떤 인간의 폐 종양 전시 제외 거주 T 세포의 영상 autofluorescence의 매우 높은 수준. 이러한 기능은 빠르게 이미징 세션의 시작 부분에서 관찰 됩니다. Autofluorescent 종양을 폐기 해야한다. Autofluorescent 종양에 거주 CD8 T 세포의 대표적인 예는 그림 4에 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
그림 1: 관류 시스템의 사진. A) 페 놀 레드 무료 RPMI 솔루션 5% C02, 95% O2농축입니다. B) 솔루션은 다음 연동 펌프에 의해 끼얹는다. C) RPMI 솔루션 입구를 통해 문화 접시를 입력합니다. 소켓, 솔루션 폐기물 용기에 약 실에서 펌프에 의해 발음은. 참고 포부 팁 솔루션 높이 결정 하는 수준에서 설정 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
그림 2: 거주 CD8 T의 분포는 인간의 폐 종양에서 세포. 인간의 폐 종양 조각의 대표 이미지 스테인드 CD8 (녹색), 대 한 EpCAM (파란색)와 CD90 (빨간색). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
그림 3: 주민 CD8 T의 운동 성 세포는 인간의 폐 종양에. 개별 주민 CD8 T 세포 실질 (레드)와 인간의 폐 암 조각의 종양 세포 (파란색) 지역에서 궤도 슬라이스 표시 된 항 체로 얼룩진 고 confocal 현미경으로 20 분 대 한 군데. Fibrillary 콜라겐 2 광자 현미경에 두 번째 고조파 생성 (SHG)를 사용 하 여 끝에 검색 되었습니다. 트랙은 CD8 T 세포 변위 길이 따라 색상으로 구분 됩니다. 이 이미지는 4에서 수정 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
그림 4: autofluorescent 인간 폐 종양의 대표 이미지. 종양 조각 (파란색) CD8 (녹색) 및 EpCAM 얼룩 했다. SHG 신호는 빨간색에서 이다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

이 프로토콜에서는 이미지 거주 종양 침투 CD8 T 세포 인간 폐 종양 조각 내 붙일 결합 된 항 체와 함께 표시 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 CD8 T 세포 이동의 실시간 분석을 허용 한다.

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

연구

암 연구학

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

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초음파 화상 진찰에 의하여 마우스에 있는 폐 종양 진행의 탐지

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

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In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정

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Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...