Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Pierre Bourdoncle e Thomas Guilbert da Cochin Imaging facilidade (Institut Cochin, Paris) para aconselhamento e assistência com microscópios. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do francês Ligue Nationale contre le Cancer, pelo CARPEM (pesquisa do câncer para medicina personalizada), pelo Fondation de France e da União Europeia Horizonte 2020 pesquisa e inovação do programa sob concessão n 667980 (CARAT) de acordo.

Tumores humanos foram obtidos com o acordo do Comité francês de ético e pela assistência Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) no aplicativo com o artigo L.1121-1, da lei francesa. Obteve-se um termo de consentimento informado dos pacientes antes da inclusão no estudo.
1. obtenção de tumores de pulmão humano
<ol>
	<li>Obter amostras de tumor de pulmão frescas de pacientes com câncer de pulmão de células não-pequenas estágio-III, que foi submetido a uma ressecção cirúrgica completa de seus tumores de pulmão4.</li>
	<li>Transporte o tumor fresco não fixa em tubo cônico de 15 mL contendo meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) gelado. Reserve no gelo por 30 min até passo 2.7. Nota: Quando os tumores são recebidos no período do tarde, colocá-los em 4 ° C durante a noite e o processo no dia seguinte. Neste caso, complementar a mídia RPMI-1640 com 5% de soro fetal bovino (FBS).</li>
</ol>
2. Agarose incorporação e vibratome de corte de tumores de pulmão humano
Nota: Execute todas as etapas até 2.10 sob condições estéreis.
<ol>
	<li>Prepare a solução de agarose de 5% para incorporação pela dissolução de 1 g agarose de ponto baixo ponto de fusão em 20 mL estéril de tampão fosfato salino (PBS) sem cálcio e magnésio. Microondas esta solução até a agarose é completamente dissolvido. Permitir que a agarose esfriar a 37 ° C, colocando a solução em uma incubadora a 37 ° C por 5 min.</li>
	<li>Em uma capa de cultura de tecidos, prepare meio RPMI-1640 completo (sem vermelho de fenol) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 4 mM L glutamina e 1x penicilina e estreptomicina.</li>
	<li>Adicionar meio RPMI-1640 completo de 1,1 mL por alvéolo para uma placa de cultura de células de 6-poços e coloque uma inserção de cultura de célula de 30 mm em cada poço. Reserve a placa em uma incubadora a 37 ° C por 30 min até passo 2.12.</li>
	<li>Lugar esterilizado arruelas planas de aço inoxidável (diâmetro interno de 5 mm, fora de 10 mm de diâmetro e espessura de 1 mm) em um prato de plástico-35mm preenchido com completo meio RPMI. Anilhas serão mais usadas para concentrar os anticorpos a fatia de vibratome de corte.</li>
	<li>Coloque a biópsia do tumor em um prato de plástico de 10 cm e corte o tumor com uma lâmina afiada em fragmentos de forma cubo pequeno de aproximadamente 5 x 5 mm de comprimento.</li>
	<li>Retire o agarose da incubadora e despeje a solução em um prato de plástico-35mm.</li>
	<li>Use um par de pinças para transferir com cuidado, os fragmentos do tumor para uma limpeza de tecido para retirar o excesso do meio. Inserir os fragmentos o agarose e posicioná-los no fundo do prato plástico. Deixe o gel de agarose no gelo por 5 min solidificar.</li>
	<li>Uma vez que a agarose solidifica, inverta o prato plástico e use uma espátula para liberar o gel todo.</li>
	<li>Use uma lâmina afiada para aparar o excesso agarose cercam o fragmento do tumor, deixando de 3 a 5 mm de gel ao redor do tecido.</li>
	<li>Monte cada bloco de agarose no disco espécime do vibratome com uma gota de cola de tecido de cianoacrilato butílico de tóxicos. Encha a bandeja de tampão vibratome com PBS estéril gelada e instalar o disco de amostra na bandeja.</li>
	<li>Corte o agarose incorporado tecido em 350 µm de espessura. Ajustar as definições de vibratome a uma velocidade lenta de gama (0.2-0.3 mm/s) e a frequência de vibração em um intervalo médio (1,5 mm).</li>
	<li>Usando a pinça fina, cuidadosamente colete as fatias de tumores, como eles estão sendo cortados e colocá-los horizontalmente para as inserções de cultura de células de uma placa de 6 (passo 2.3). Transferi 1 fatia em cada inserção. Use muito cuidado ao manusear as fatias como eles podem ser facilmente danificados.</li>
	<li>Use pinça fina para colocar arruelas de aço inoxidável em cada fatia individual. Certifique-se que as anilhas estão bem posicionadas no tecido do tumor o agarose.</li>
	<li>Manter a placa de cultura a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO2 durante 10 min. proceder de imunocoloração.</li>
</ol>
3. imunocoloração de residentes células T CD8 e células tumorais
<ol>
	<li>Dilua os anticorpos (concentração final de 10 µ g/mL) e o corante nuclear (concentração final de 1 µ g/mL) em mídia RPMI 1640 sem vermelho de fenol. Nota: Usar fluorescente acoplados anti-CD8 (IgG murino, clonar SK1) e anti-EpCAM (molécula de adesão de células epiteliais) (murino IgG HEA-125) anticorpos para rotular os linfócitos T CD8 e tumor células epiteliais, respectivamente. Use anticorpos acoplados fluorescente anti-CD90/Thy1 (IgG murino, clone 5E10) rótulo fibroblastos e células endoteliais ativadas. Use 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para rotular o núcleo das células com uma membrana de plasma comprometida a fim de avaliar a viabilidade do tecido.</li>
	<li>Remover as placas de cultura de incubadora e usar uma pipeta para aspirar qualquer líquido dentro as anilhas de aço inoxidável. Não remova a mídia de 1,1 mL de RPMI-1640 colocada sob as inserções de cultura celular (passo 2.3).</li>
	<li>Sem tocar a fatia e utilize uma ponta de pipeta, adicione 40 µ l da solução que contém os anticorpos para cada fatia de tumor.</li>
	<li>Incube a placa a 37 ° C por 15 min permitir que a mancha do anticorpo.</li>
	<li>Com a pinça fina, retire as anilhas, tire as fatias e mergulho os 10 s em RPMI-1640 mídia sem vermelho de fenol. Coloque de volta as fatias para as inserções de cultura celular e adicionar uma gota de vermelho de fenol-livre RPMI-1640 médio em cada fatia individual. Manter a placa a 37 ° C por 10 min. proceder à imagem.</li>
</ol>
4. imaging e analisando a migração de células T CD8 residente dentro de fatias de tumor de pulmão humano
Nota: O microscópio confocal utilizado neste protocolo é uma verticalidade girando o disco equipado com um 25 x objetivo de imersão de água (25 x / 0.95 N.A.).
<ol>
	<li>Preparando a instalação do microscópio<ol>
		<li>Defina a temperatura da câmara de calor microscópio a 37 ° C, algumas horas antes de iniciar a sessão de imagens.</li>
		<li>Configurar um sistema para perfundir constantemente fatias do tumor com oxigenada (5% CO2, 95% O2) meio RPMI de vermelho de fenol-livre (Figura 1). Use uma bomba peristáltica para fluxo de mídia a perfusão na câmara de imagens e de aspirar a solução para um balão de recolha de resíduos.</li>
		<li>Execute a bomba peristáltica para permitir que a solução oxigenada para passar os tubos de perfusão.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Com a pinça fina, retire a fatia da placa de 6 e transferência para o prato de plástico-35mm encheu de vermelho de fenol-livre médio RPMI. Imobilize a fatia com uma âncora de fatia 19,7 mm de diâmetro com 2 mm espaçadas-tópicos. Coloque o prato de Petri no palco de imagem do microscópio. Conecte as pontas de entrada e saída do sistema de perfusão. Ligue o sistema de perfusão e definir a taxa de fluxo de mídia de 0,8 mL/min.</li>
	<li>Baixe o objectivo da água-imersão a fatia. Concentre-se no topo a fatia com luz de campo brilhante.</li></ol>Com luz fluorescente apropriado, selecione uma região de interesse que contém células T CD8, ilhotas de tumor (positivas para EpCAM) e uma área de estroma (positiva para CD90). Verificar a viabilidade de células dentro da fatia, avaliando DAPI mancha na superfície de corte e mais profunda no tecido. Nota: Uma fatia saudável contém apenas uma minoria de células positivas DAPI a vários mícrons de superfície de corte.
	<li>Defina uma sessão de imagens com as seguintes ações.<ol>
		<li>Dependendo da intensidade do sinal fluorescente dos 3 fluorophores, defina o tempo de exposição entre 50 a 800 ms e a intensidade do laser entre 20 a 40%.</li>
		<li>Selecione a espessura de pilha de z a imagem dentro da fatia de tumor. Nota: 10-12 aviões ópticos abrangendo uma profundidade total de 60-70 µm na dimensão z aqui, foram capturados.</li>
		<li>Selecione a posição inicial em aproximadamente 10 µm abaixo as primeiras células T CD8 rotuladas.</li>
		<li>Definir o intervalo de tempo entre cada imagem de z-pilha entre 10 a 30 s e o tempo de gravação total entre 10 a 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analise a migração de células T CD8 residente conforme descrito na referência4.<ol>
		<li>Depois de importar os dados para um software de rastreamento, crie pontos para cada célula T CD8 no campo. Ajuste o diâmetro das células e o limite de deteção de acordo sobre as células fluorescentes imagens.</li>
		<li>Inspecione as faixas e remover qualquer faixa irrelevante por excluí-los. Corretas trilhas conectando e desconectando faixas diferentes e pontos de tempo diferentes das mesmas faixas. Exporte os dados (faixa de velocidade, faixa de comprimento de deslocamento) para um software de planilha eletrônica.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

É descrita uma técnica simples, rápida e robusta para a geração de fatias de tumor de pulmão humano e avaliação do comportamento dinâmico de residentes células T CD8 em um ambiente preservado tumor usando um microscópio confocal. Este protocolo é um refinamento do anterior artigo JoVE que descreve o monitoramento chapeadas de pilhas de T no linfonodo murino fatias2.
Branqueamento de corantes fluorescentes deve ser considerado especialmente com corantes de primeira geração como isotiocianato de fluoresceína e ficoeritrina. Nós achamos que um pronunciado fotobranqueamento de anticorpos acoplados diretamente ocorreu com um microscópio de dois fotões. Por outro lado, percebeu-se fotobranqueamento mínimo com microscópios confocal, especialmente usando corantes fluorescentes brilhantes desenvolvidos recentemente.
Os anticorpos são moléculas relativamente grandes e, portanto, a sua penetração no tecido pode ser difícil. Esta etapa pode ser melhorada, aumentando o tempo de incubação. Além disso, o uso de uma menor coloração reagentes tais como diretamente acoplados Fab fragmentos de anticorpos representa uma boa alternativa.
Todos os anticorpos descritos neste protocolo foram previamente validados e conhecidos para produzir a coloração brilhante4. Portanto, o isotipo controles não são necessários. No entanto, se as modificações para este método usando outros anticorpos são desejadas, então o uso de anticorpos do isotipo controle é altamente recomendável.
Este sistema experimental apresenta algumas limitações. O procedimento de corte irá danificar o tecido, que pode afetar o comportamento de células T CD8, especialmente perto da superfície de corte. Além disso, uma série de fatores solúveis (por exemplo, quimiocinas) instrumentais em controlar a migração de células T pode ser perdida. Uma maneira de contornar estes problemas é através da monitorização de células T, localizadas em várias dezenas de mícrons da superfície em regiões supostamente mais saudáveis do tecido. Experimentos publicados revelam que as células T localizadas profundamente dentro do tecido migram mais ativamente do que células T localizadas perto da superfície corte4. Nós usamos microscópios confocal para nossos estudos, mas é provável que dois fotões microscópios irão aumentar a resolução espacial em profundidade.
Esta abordagem baseia-se na utilização de anticorpos acoplados fluorescente que não são moléculas neutras. Anticorpos de tamanho são susceptíveis de afectar o funcionamento normal das células T em maneiras diferentes. Primeiro, anticorpos anti-CD8 podem alterar a migração de células T provocando uma cascata de sinalização intracelular capaz de afetar o citoesqueleto do linfócito. Em segundo lugar, os anticorpos anti-CD8 podem modular a interação entre o CD8 e MHC classe I moléculas, um passo importante no processo de reconhecimento de antígeno. Anticorpos em terceiros lugar, intactos podem ligar aos receptores Fc expressados por muitas células mieloides distribuídas no tumor e, portanto, suscetíveis para aumentar o sinal específico. Não temos indicação que tal problema afetou nossos dados, provavelmente porque os receptores Fc de células mieloides residentes são, ao contrário de células em cultura, saturados com imunoglobulinas presentes dentro do meio do tumor. Com efeito, a adição de soro durante o procedimento de rotulagem, um processo conhecido para bloquear os receptores Fc livre, não alterou a imuno-coloração. Não obstante, Fab fragmentos de anticorpos, desprovido de região Fc, bem como anticorpos mutado em sua região de Fc e de fragmentos de anticorpos derivados camelid8 representam outras estratégias alternativas para rastrear as células residentes com marcadores fluorescentes.
Nas últimas décadas, vários sistemas de modelo foram desenvolvidos e utilizados para o tratamento de imagens em tempo real de linfócitos T. Estes incluem em vitro preparações de T células previamente purificadas e cultas com células apresentadoras. Tais preparações permitiram progressos notáveis na definição dos mecanismos de reconhecimento do antígeno e capacidade de resposta. No entanto, falta-lhes a complexidade do ambiente tecido. Foram estabelecidas outras preparações que mais estreitamente imitam a estrutura de um tecido nativo. Para obter exemplos, matrizes de gel de colágeno tridimensional na qual células T purificadas tem sido incorporadas, bem como a cultura do tecido reaggregated fragmentos têm sido utilizados para monitorar o comportamento dinâmico de linfócitos T com fluorescentes imaging technologies9 . Estes sistemas apresentam a vantagem de uma arquitetura perto do tecido nativo, mas falta-lhes outros factores importantes de celulares e solúveis. No rato, microscopia intravital dois fotões tem sido empregada para rastrear as células T no ambiente verdadeiramente fisiológica de um órgão intacto10. No entanto, tal abordagem é tecnicamente difícil de configurar. Além disso, o rato modelos mostram notáveis diferenças com a fisiologia humana.
A técnica descrita neste protocolo representa um ambiente de complexos multicelulares tumor que está singularmente posicionada para atuar como um elo importante entre a co-cultura estudos e modelos animais.
O protocolo descrito neste documento também pode ser usado para rastrear a motilidade de outras células que os linfócitos T CD8, para o qual foram gerados anticorpos. Além disso, a técnica pode ser adaptada para outros tumores humanos e murino e tecidos. Por exemplo, nós fomos capazes de imagem em tempo real a dinâmica das células B rotulada com um anticorpo anti-CD19 em amígdalas humanos frescos.
A técnica descrita neste protocolo permite que a tela para moléculas terapêuticas controlando a motilidade de células T em tecidos. A acessibilidade do sistema de cultura permite aplicar alguns reagentes farmacológicas e testar as suas consequências sobre a migração de células T. Ele agora é aceito que, no crescimento de tumores, as células T CD8 apresentam uma baixa migração e reduzidos contatos com células de tumor11. Importante, a escassa presença de células T em regiões de células de tumor está associada um resultado ruim e é considerada um dos mecanismos de resistência, a imunoterapia baseada em células T. Foram identificados vários obstáculos, limitando as células T de migração em tumores incluindo uma densa matriz extracelular. A este respeito, a identificação de moléculas capazes de restaurar a motilidade da célula T e interação com células malignas representa um importante passo na imunoterapia. Em um estudo anterior, achamos que uma degradação parcial de colágeno com colagenase, agudamente aplicado a fatias de pulmão humano, melhora o contato das células T com as células do tumor.
Finalmente, a possibilidade de manter as fatias de tumor humano na cultura por até vários dias7,12,13 oferece uma série de aplicações promissoras em termos de células T e imunoterapia.No entanto, a estabilidade do sistema de modelo durante a cultura de longo prazo é um parâmetro importante que deve ser cuidadosamente avaliada.
Obtenção de tecido fresco e saudável é um fator crítico para produzir fatias de qualidade com boa imunocoloração de elementos estromais, células tumorais e células CD8. Manter a biópsia do tumor a 4 ° C antes do processamento é crucial.
A manipulação de fatias com pinça fina representa mais um passo crítico no âmbito do presente protocolo. Isto deve ser realizado com muito cuidado, como a agarose pode ser facilmente danificado. Um corte no agarose irá comprometer o selo feito pela arruela de aço inoxidável, resultando em um vazamento do anticorpo contendo soluções.

Células T CD8 desempenham um papel chave na batalha contra o câncer. No entanto, muitos mecanismos supressivos impedem linfócitos T matar células malignas. Nos últimos anos, várias estratégias promissores que liberam os freios em células T foram desenvolvidas e utilizadas na clínica5. As duas abordagens que retêm a atenção considerável são alvos de ponto de verificação imune-anticorpos, tais como terapias anti-PD-1 e adotivos célula T. No entanto, apesar dos sucessos recentes, apenas um subconjunto de pacientes beneficiar estas terapias6. Um grande desafio é identificar mecanismos de resistência à imunoterapia para desenvolver tratamentos mais eficazes. Outro desafio é desenvolver sistemas de modelo no qual romance terapias podem ser caracterizadas e testadas pela sua potência e segurança. Até agora, a maioria destes ensaios se baseiam em vitro celular cultura sistemas que imitam mal a complexidade do tecido do tumor.
Ex vivo fatias de tecido é uma técnica promissora, que conserva o original tecido microambiente7. Ao longo dos anos, criámos esta abordagem para acompanhar a dinâmica dos linfócitos T em vários tecidos. Nossos resultados indicam que a fluorescente etiquetadas células T adicionadas no topo do nó de linfa murino fatias migram para o tecido e respondem às suas sugestões microenvironmental apropriado1,2. Da mesma forma, linfócitos T, sobrepostos em fatias de tumor de pulmão humano são rapidamente recrutou para o tumor estroma3. Usando esta técnica, nós identificamos a matriz extracelular como um elemento importante para controlar a distribuição e a migração de células T dentro de tumores humanos3,4. Porque o comportamento do ex vivo purificado e chapeadas células T não reflete necessariamente o comportamento dos linfócitos T de residente intratumoral, nós recentemente refinaram esta abordagem4.
Aqui descrevemos um protocolo para controlar residentes linfócitos T dentro de fatias de tumores de pulmão humano fresco. As diferentes etapas da preparação de fatias de tumor de pulmão humano (incluindo incorporação de agarose e vibratome de corte do tecido incorporado), consistem a coloração endógenas de pilhas de T com anticorpos fluorescentes fatias frescas de tumor, e o controlo da Estas células com um microscópio confocal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

Células T CD8 são jogadores-chave na luta contra o câncer. Em ordem para as células T CD8 matar células tumorais precisam entrar o tumor, migrar dentro o microambiente do tumor e dar uma resposta adequada aos antígenos do tumor. O recente desenvolvimento de abordagens de imagem melhoradas, como microscopia 2-fóton e o uso de modelos de tumor poderoso rato tem lançar luz sobre alguns dos mecanismos que regulam a actividade anti-tumoral T celular. Considerando que tais sistemas forneceram informações valiosas, eles não sempre prever respostas humanas. Em humanos, nosso conhecimento no campo vem principalmente de uma descrição das amostras de tumor fixo dos pacientes humanos, bem como estudos em vitro . No entanto, em vitro modelos carecem de meio de tumor tridimensionais complexos e, portanto, são aproximações incompletas do in vivo atividades de células T. Fatias frescas feitas de tecido explantado representam um ambiente de tumor multicelulares complexos que pode atuar como um elo importante entre estudos co cultos e modelos animais. Originalmente criada em linfonodos murino1 e descrito anteriormente em um artigo de Júpiter2, esta abordagem agora foi transposta para tumores humanos para examinar a dinâmica de chapeado3 bem como residente de células T4.
Aqui, um protocolo para a preparação de fatias de tumor de pulmão humano, imunocoloração de células T CD8 e tumor residentes e rastreamento de linfócitos T CD8 dentro o microambiente do tumor utilizando microscopia confocal é descrito. Este sistema é exclusivamente colocada a tela para agentes de imunoterapia romance, favorecendo a migração de células T em tumores.

Tumores de pulmão humano são geralmente altamente infiltradas em células T CD8 que encontram-se preferencialmente no estroma3,4. Seguindo este protocolo se deve esperar para visualizar um grande número de immunostained T CD8 em fatias de tumor de pulmão humano. Co de uma rotulagem com anticorpos anti-EpCAM e anti-CD90 deve permitir delinear ilhotas de tumor e áreas do estroma. Fibrillar colágeno, abundante no estroma do tumor, pode ser visualizado sem coloração exógena usando a segunda geração de harmônica em um microscópio de dois fotões3,4. Observe que alguns tumores de pulmão humano não apresentam nenhuma distinção clara entre ilhotas de tumor e estroma. Esses tumores devem ser descartados bem como espécime apresentar grandes áreas de necrose celular identificado por ligação não específica de anticorpos e DAPI coloração. Consistente com resultados publicados obtidos no pulmão humano e carcinomas de ovário, residentes células T CD8 estão mais concentradas no estroma em relação ao tumor de ilhotas4. Um exemplo representativo da distribuição de células T CD8 em relação às células tumorais e CD90 é mostrado na Figura 2.
O ensaio de fatia permite a análise da motilidade residente células T em regiões diferentes do tumor. Critérios úteis para comparar a motilidade de células T CD8 em diferentes regiões incluem a velocidade média (comprimento de caminho dividido pela duração tempo amostrada) e o comprimento do deslocamento (o vetor entre o início e final de uma trilha). Embora escassos em ilhotas do tumor, as células T CD8 migram mais activamente neste compartimento em comparação com o estroma (Figura 3). Em média, a velocidade média de células T CD8 individuais deve ser perto de 4 µm/min no estroma tumor com alta intra e inter tumor variabilities4. No estroma do tumor, a motilidade do residentes células T é fortemente influenciada pela densidade e a orientação da matriz extracelular fibras3,4. Uma experiência bem sucedida resultará em menos células T presentes em áreas de matriz densa em comparação com regiões de matriz solto, consistentes com resultados publicados3,4.
Observe que alguns tumores de pulmão humano apresentam um nível muito alto de autofluorescência impedindo a imagem latente de residentes células T. Tal característica é observada rapidamente no início da sessão de imagens. Autofluorescent tumores devem ser descartados. Um exemplo representativo de residentes células T CD8 em um tumor de autofluorescent é mostrado na Figura 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
Figura 1: fotografias do sistema de perfusão. A) a solução de vermelho de fenol-livre RPMI é enriquecida em 5% C02, 95% O2. B) a solução é então perfundida por uma bomba peristáltica. C) a solução RPMI entra o prato de cultura através da entrada. Na saída, a solução é aspirada pela bomba da câmara em um recipiente de resíduos. Note que a ponta de aspiração é fixada a um nível para determinar a altura de solução. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
Figura 2: distribuição de T de CD8 residente células em um tumor de pulmão humano. Imagem representativa de uma fatia de tumor de pulmão humano manchado para CD8 (verde), EpCAM (azul) e CD90 (vermelho). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
Figura 3: motilidade do residente T CD8 células em um tumor de pulmão humano. Trajetórias das células individuais de T CD8 residentes nas regiões de célula (azul) tumor de uma fatia de carcinoma de pulmão humano e do estroma (vermelho). A fatia foi manchada com os anticorpos indicados e fotografada por 20 min com um microscópio confocal. O colágeno fibrilar foi detectado no final usando a segunda geração de harmônica (SHG) em um microscópio de dois fotões. Faixas são codificados por cores de acordo com o comprimento de deslocamento de células T CD8. Esta imagem foi modificada em 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
Figura 4: imagem representativa de um tumor de pulmão humano autofluorescent. A fatia do tumor foi manchada para CD8 (verde) e EpCAM (azul). O sinal SHG está em vermelho. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Este protocolo descreve um método de imagem residente tumor infiltrando T CD8 células rotulado com anticorpos fluorescente acoplados dentro de fatias de tumor de pulmão humano. Esta técnica permite análises em tempo real de migração de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

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