Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Мы хотим поблагодарить Пьер Bourdoncle и Томас Гильбер Кочин Imaging фонда (Institut Кочин, Париж) для консультаций и помощи с микроскопы. Эта работа была поддержана в части субсидий от le национальной французской лиги против рака, CARPEM (рак исследований для персонализированной медицины), Фондасьон де Франс и программой Европейского союза Horizon 2020 исследований и инноваций Грант Соглашение No 667980 (карат).

Человека опухоли были получены с согласия Французской этического Комитета и помощи Publique-больничный де Пари (AP-HP) в приложение со статьей L.1121-1 французского закона. Письменное информированное согласие было получено от пациентов до включения в исследование.
1. получение опухоли легких человека
<ol>
	<li>Получение образцов опухоли свежие легких у пациентов с стадии-III немелкоклеточного рака легкого, которые прошли полный хирургическая резекция опухоли легких4.</li>
	<li>Транспорт-Исправлена свежие опухоли в 15 мл конические тубы ледяной Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI 1640) среднего. Отложите на льду за 30 мин до шага 2.7. Примечание: При получении опухоли в послеобеденное время, разместите их на 4 ° C на ночь и процесс следующий день. В этом случае дополнение RPMI 1640 СМИ с 5% плода бычьим сывороточным (ФБС).</li>
</ol>
2. агарозы встраивание и vibratome нарезка опухолей человека легких
Примечание: Выполните все шаги до 2,10 в стерильных условиях.
<ol>
	<li>Готовят раствор 5% агарозы для встраивания, растворяя 1 g легкоплавких точки агарозы в 20 мл стерильной фосфат амортизированное saline (PBS) без кальция и магния. СВЧ это решение до тех пор, пока полностью не растворится агарозы. Разрешить агарозы для охлаждения при 37 ° C, поместив решение в инкубаторе при 37 ° C за 5 мин.</li>
	<li>В культуре ткани капюшоном Подготовьте полный носитель RPMI 1640 (без фенола красного), содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 4 мм L-глютамина и 1 x пенициллина и стрептомицина.</li>
	<li>Добавьте 1.1 мл полный RPMI 1640 среднего за хорошо плиты культуры клеток 6-Ну и место вставки культуры клеток 30 мм в каждой скважине. Отложите пластину в инкубаторе при 37 ° C за 30 мин до шага 2.12.</li>
	<li>Место стерилизованное плоские шайбы из нержавеющей стали (внутренний диаметр, наружным диаметром 10 мм и толщиной 1 мм, 5 мм) в 35-мм пластиковая блюдо, наполненный RPMI полного среднего. Шайба будет использоваться далее сосредоточиться антитела на vibratome вырезать фрагмент.</li>
	<li>Место биопсии опухоли в пластиковых блюдо 10 см и вырезать опухоль с острым лезвием на малый куб форму фрагменты примерно 5 x 5 мм длины.</li>
	<li>Возьмите агарозы из инкубатора и залейте раствор в 35-мм пластиковая блюдо.</li>
	<li>Используйте пару щипцов передать тщательно опухоли фрагменты тканей wipe удалить избыток среднего. Вставьте фрагменты в агарозы и расположите их в нижней части пластиковые тарелки. Оставьте агарозном геле на льду на 5 минут, чтобы затвердеть.</li>
	<li>Как только агарозы затвердевает, инвертировать пластиковые тарелки и лопаточкой освободить весь гель.</li>
	<li>Используйте острый нож обрезать излишки агарозы, окружающих опухоль фрагмент, оставляя 3-5 мм гель вокруг ткани.</li>
	<li>Подключите каждый блок агарозы на диск образец vibratome с каплей нетоксичные бутил Цианакрилатный клей ткани. Заполните vibratome буфер лоток с стерильных ледяной PBS и установить образец диск в лоток.</li>
	<li>Вырезать агарозы встроенный тканей толстыми ломтиками 350 мкм. Настройки vibratome со скоростью медленного диапазона (0,2-0,3 мм/сек) и частота вибрации в диапазоне средних (1,5 мм).</li>
	<li>С помощью тонкой щипцы, тщательно соберите кусочки опухоли, как они сокращаются и разместить их на культуры вставки ячейки 6-ну плиты (шаг 2.3). Передача 1 ломтик на каждой вставки. Используйте большую осторожность при обработке ломтиками, как они могут быть легко повреждены.</li>
	<li>Используйте тонкой щипцы для размещения шайб из нержавеющей стали на каждый отдельным дольке. Убедитесь, что шайбы хорошо позиционируется на агарозе, окружающие ткани опухоли.</li>
	<li>Сохранение культуры пластины при 37 ° C в 5% CO2 увлажненные инкубатор для 10 min. приступить к иммуноокрашивания.</li>
</ol>
3. иммуноокрашивания-резидентов CD8 Т-клеток и клеток опухоли
<ol>
	<li>Разбавьте антитела (конечной концентрации 10 мкг/мл) и ядерных краситель (конечная концентрация 1 мкг/мл) в средствах массовой информации RPMI 1640 без фенола красного. Примечание: Используйте дневно в сочетании анти CD8 (мышиных IgG, клонировать SK1) и анти EpCAM (эпителиальных клеток молекулы адгезии) (мышиных IgG АЭМ-125) антител к этикетке CD8 Т-лимфоцитов и опухоли эпителиальных клеток, соответственно. Использование антител дневно в сочетании анти CD90/Thy1 (мышиных IgG, клон 5E10) метка фибробластов и активированные эндотелиальных клеток. Использование 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для пометки ядро с нарушенной плазматической мембраны клеток для того чтобы оценить жизнеспособность тканей.</li>
	<li>Снимите крышки культуры из инкубатора и использовать пипетку для аспирационная любой жидкости внутри шайб из нержавеющей стали. Не удаляйте 1.1 мл RPMI 1640 СМИ под вставки культуры клеток (шаг 2.3).</li>
	<li>Не касаясь срез и с помощью кончика пипетки, без 40 мкл раствора, содержащего антител на каждый кусочек опухоли.</li>
	<li>Инкубируйте пластины при 37 ° C на 15 минут, чтобы позволить Пятнать антитела.</li>
	<li>С тонкой щипцами снимите шайбы, вынимают фрагменты и провал их 10 s в RPMI 1640 СМИ без фенола красного. Обратно место ломтики на вставки культуры клеток и добавить каплю свободного фенола Красного RPMI 1640 средних на каждый отдельным дольке. Поддерживать пластины при 37 ° C на 10 мин приступить к визуализации.</li>
</ol>
4. обработки изображений и анализа резидентов T CD8 клетки миграции внутри опухоли фрагменты человеческих легких
Примечание: Конфокальный микроскоп, используемые в настоящем Протоколе является вертикально, спиннинг диск оснащен 25 x цель погружения воды (25 x / 0,95 н.а.).
<ol>
	<li>Подготовка установки микроскопа<ol>
		<li>Установите температуру тепло-камеры микроскопа при 37 ° C за несколько часов до начала сессии изображений.</li>
		<li>Настройка системы постоянно perfuse опухоли фрагменты с кислородом (5% CO2, O 95%2) свободного фенола Красного RPMI среднего (рис. 1). Используйте Перистальтический насос поступать СМИ перфузии в тепловизионной камеры и аспирационная решение настой сбора отходов.</li>
		<li>Запустите Перистальтический насос, чтобы позволить кислородом решение пройти через трубы перфузии.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Тонкой пинцетом вынимают фрагмент из 6-ну пластины и передачи его на 35-мм пластиковая блюдо заполнены с свободного фенола Красного RPMI среднего. Иммобилизации срез с 19,7 мм диаметр среза якорь с интервалом 2 мм-потоков. Место на Петри блюдо на стадии визуализации микроскопа. Соедините вход и выход советы перфузии системы. Включите систему перфузии и равным 0,8 мл/мин скорость потока средств массовой информации.</li>
	<li>Понизить целью погружения в воду на фрагмент. Фокус на вершине срез с яркими поле света.</li></ol>Используя соответствующие флуоресцентный свет, выберите область интереса, который содержит CD8 T клетки, опухоли островков (положительный для EpCAM) и зона стромы (положительный для CD90). Проверьте жизнеспособность клеток в пределах фрагмента путем оценки DAPI окрашивания на поверхности среза и глубже в ткани. Примечание: Здоровый ломтик содержит лишь меньшинство DAPI позитивных клеток в несколько микрон от поверхности среза.
	<li>Набор изображений сессии со следующими действиями.<ol>
		<li>В зависимости от интенсивности флуоресцентного сигнала 3 флуорофоров задайте время экспозиции между 50 до 800 мс и интенсивности лазера от 20 до 40%.</li>
		<li>Выберите толщину стека z изображения в пределах кусочек опухоли. Примечание: Здесь, 10-12 оптических плоскостях, охватывающих общую глубину 60-70 мкм в измерении z были захвачены в плен.</li>
		<li>Выберите начальную позицию на приблизительно 10 мкм ниже первого надписью CD8 Т-клеток.</li>
		<li>Определить временной интервал между каждой z стек изображений между 10-30 s и общее время звучания от 10 до 30 мин.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Анализировать резидентов CD8 T клетки миграции, как описано в ссылка4.<ol>
		<li>После импорта данных для отслеживания программного обеспечения, создайте места для каждой ячейки CD8 T в поле. Отрегулируйте диаметр клетки и порог обнаружения зависимости образа люминесцентные клеток.</li>
		<li>Проверьте треки и удалите любые не значения трек, удаляя их. Правильное треков, подключение и отключение различных треков и точек разное время же треков. Экспорт данных (трек скорость, длина пути перемещения) для программного обеспечения электронной таблицы.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Описан простой, быстрый и надежный метод для генерации легкое человека опухоли фрагменты и оценки динамического поведения-резидентов CD8 Т-клеток в среде сохранились опухоли с помощью конфокального микроскопа. Этот протокол является уточнение предыдущей статьи JoVE, которая описывает мониторинг покрытием Т-клеток на мышиных Лимфоузел ломтики2.
Особенно с первого поколения краски флуоресцеин Изотиоцианаты и фикоэритрин должны рассматриваться отбеливания флуоресцентных красителей. Мы обнаружили, что произносится Фотообесцвечивание непосредственно сочетании антител произошло с микроскопом двух фотонов. И наоборот минимальный Фотообесцвечивание был замечен с конфокальные микроскопы, особенно с помощью ярких флуоресцентных красителей, разработали недавно.
Антитела являются относительно большие молекулы, и поэтому их проникновения в ткани может быть трудно. Этот шаг можно повысить, увеличив время инкубации. Кроме того использование меньшего пятнать реагентов как непосредственно-в сочетании Fab фрагментов антитела представляет хорошей альтернативой.
Все антитела, указанных в настоящем протоколе были ранее проверены и известно, производят яркие окраски4. Таким образом изотипа элементы управления не являются обязательными. Однако если изменения в этот метод, с помощью других антител, использование isotype антитела управления настоятельно рекомендуется.
Эта экспериментальная система представляет некоторые ограничения. Процедура резки будет повредить ткани, которая может повлиять на поведение CD8 Т-клеток, особенно вблизи поверхности среза. Кроме того количество растворимых факторов (например, chemokines) важную роль в регулировании миграции Т-клетки могут быть потеряны. Одним из способов обойти эти проблемы является мониторинг Т-клеток, расположенных в нескольких десятков мкм от поверхности в регионах предположительно здоровой ткани. Опубликованные эксперименты показывают, что Т-клетки, локализованные глубоко в ткани мигрируют более активно, чем локализовано вблизи вырезать поверхности4Т-клеток. Мы использовали конфокальные микроскопы для нашего исследования, но вполне вероятно, что два фотона Микроскопы увеличит пространственное разрешение в глубину.
Этот подход основывается на использовании дневно в сочетании антител, которые не являются нейтральными молекулами. Полноразмерная антитела подвержены повлиять на нормальное функционирование клеток T различными способами. Во-первых антитела анти CD8 может изменить миграции Т-клеток, вызывая внутриклеточной сигнализации Каскад, способных затронуть цитоскелета лимфоцитов. Во-вторых, анти CD8 антител может модулировать взаимодействие между CD8 и MHC I класса молекул, важным шагом в процессе распознавания антигена. В-третьих, нетронутыми антитела можно привязать к Fc рецепторов, выраженные многими миелоидных клеток, распределенных в опухоли и поэтому подвержены увеличить неспецифичный сигнал. У нас есть никаких признаков того, что такая проблема затрагивает наши данные, вероятно потому, что рецепторы Fc-резидент миелоидных клеток в отличие от клеток в культуре, насыщены иммуноглобулинов в обстановке опухоли. Действительно добавлением сыворотки в процедуре маркировки, процесс, известный блокировать бесплатно Fc рецепторов, не изменить, иммуно окрашивание. Тем не менее Fab фрагментов антител, лишенный ФК региона, а также антитела мутировали в их регионе ФК и животноводческие, полученных антител фрагменты8 представляют другие альтернативные стратегии для отслеживания резидентов клетки с трасеров флуоресцентной.
За последние десятилетия несколько типовых систем разработаны и используются для реального времени изображений Т-лимфоцитов. К ним относятся препараты в vitro T клетки предварительно очищенный и культивировали с антиген представляющих клеток. Такие препараты позволили значительный прогресс в определении механизмов антигены и отзывчивость. Однако им не хватает сложность среды ткани. Были созданы другие препараты, что более тесно имитировать структуру родной ткани. Для примеров трехмерные коллаген гель матрицы в которых очищенная Т-клетки были внедрены, и культуры ткани, реагрегироваться, фрагменты были использованы для мониторинга динамического поведения Т-лимфоцитов с флуоресцентных изображений технологий9 . Эти системы представляют преимущества архитектуры недалеко от родной ткани, но им не хватает других важных клеточных и растворимых факторов. В мышь два Фотон прижизненной микроскопии был нанят отслеживать Т-клеток в поистине физиологической среде нетронутыми орган10. Однако такой подход является технически трудно настроить. Кроме того мышь модели показывают заметные различия с человеческой физиологии.
Метод, описанный в настоящем Протоколе представляет сложных многоклеточных опухоли среды, которая имеет уникальную возможность служить важным связующим звеном между исследования совместно культуры и Животные модели.
Протокол, описанные здесь, также может использоваться для отслеживания подвижности других клеток, чем CD8 Т-лимфоцитов, для которых были созданы антител. Кроме того техника может быть адаптирована к другим человека и мышиных опухолей и тканей. Например мы смогли изображение в реальном времени динамику клеток B помечены с анти CD19 антитела в свежей человеческой миндалин.
Метод, описанный в настоящем Протоколе позволяет экран для терапевтических молекул контроль моторики Т-клеток в тканях. Доступность системы культуры позволяет применять некоторые фармакологические реагентов и проверить их последствий миграции Т-клеток. Он теперь признается, что в растущей опухоли, CD8 Т-клетки exhibit низкий миграции и сокращение контактов с опухолевых клеток11. Важно отметить, что скудные присутствие Т-клеток в опухоли ячейки регионов связан с плохой результат и считается одним из механизмов сопротивления на основе Т клеток рака иммунотерапия. Были выявлены несколько препятствий, ограничивающих Т-клетки мигрировать в опухоли включая плотной внеклеточного матрикса. В этой связи выявление молекулы способны восстановить подвижность Т-клеток и взаимодействие с злокачественных клеток представляет собой важный шаг в Рак иммунотерапия. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что их частичную деградацию коллагена с коллагеназы, остро применяется к фрагментам легкое человека, улучшает контакт Т-клеток с опухолевых клеток.
Наконец возможность держать человека опухоли фрагменты в культуре для до7,12,несколько дней13 предлагает ряд перспективных приложений в срок Т-клеток и иммунотерапии.Однако стабильность модель системы в долгосрочной перспективе культуры является важным параметром, который необходимо тщательно оценивать.
Получение свежей и здоровой ткани является решающим фактором для получения фрагментов качества с хорошим иммуноокрашивания CD8 клетки, клетки опухоли, и стромальных элементов. Сохраняя биопсия опухоли на 4 ° C до обработки имеет решающее значение.
Обработка срезов с тонкой щипцами представляет собой еще один важный шаг в рамках настоящего Протокола. Это следует выполнять с большой осторожностью, как агарозы могут быть легко повреждены. Вырезать в агарозном скомпрометирует печать, сделанное шайбы из нержавеющей стали, что приводит к утечке антитела, содержащие решения.

CD8 T клетки играют ключевую роль в битве против рака. Однако многие подавляющих механизмы предотвращения Т-лимфоцитов от убийства злокачественных клеток. За последние годы разработаны и использованы в клинике5несколько перспективных стратегий, которые тормозов на Т-клетки. Эти два подхода, которые сохраняют значительное внимание являются иммунные контрольно-пропускной пункт ориентация антител, таких как анти PD-1 и приемных T клеточной терапии. Тем не менее несмотря на недавние успехи, только подмножество пациентов выгоду от этих терапии6. Одной из основных задач заключается в выявлении механизмов сопротивления Рак иммунотерапия с целью разработки более эффективных методов лечения. Еще одна задача заключается в разработке типовых систем в котором Роман терапии можно охарактеризовать и проверены на их эффективность и безопасность. До настоящего времени большинство этих анализов основаны на культуру в vitro клетки систем, которые плохо имитировать сложности опухолевой ткани.
Ex vivo кусочки ткани является перспективной техники, как он сохраняет оригинальные ткани микроокружения7. С годами мы создали этот подход для отслеживания динамики Т-лимфоцитов в различных тканях. Наши результаты показывают, что дневно обозначенных Т-клеток, добавил на вершине мышиных Лимфоузел ломтики мигрируют в ткани и реагировать на их соответствующие сигналы microenvironmental1,2. Аналогичным образом Т-лимфоциты, накладывается на легкое человека опухоли фрагменты быстро набираются в опухоли стромы3. Используя эту технику, мы определили внеклеточная матрица как важный элемент контроля распределения и миграции Т-клеток в опухоли человека3,4. Потому что поведение ex vivo очищенный и покрытием Т-клетки не обязательно отражает поведение резидентов внутриопухолевых Т-лимфоцитов, недавно мы уточнили этот подход4.
Здесь мы описываем протокол для отслеживания резидентов Т-лимфоцитов в пределах ломтиками, сделанные из свежих легкое человека опухоли. Различные этапы состоят из подготовки легкое человека опухоли фрагменты (включая агарозы встраивание и vibratome секционирование встроенных ткани), окрашивание эндогенного Т-клеток с флуоресцентных антител в ломтики свежих опухоли и контроля за Эти клетки с конфокального микроскопа.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

CD8 Т-клеток являются ключевыми игроками в борьбе против рака. Чтобы CD8 Т-клеток убить раковые клетки, они должны вступить в опухоль мигрируют в пределах микроокружения опухоли и адекватно реагировать на опухолевые антигены. Последние разработки усовершенствованных тепловизионных подходов, таких как 2-Фотон микроскопии и использование моделей мощных мыши опухоли пролили свет на некоторые из механизмов, которые регулируют деятельность противоопухолевый Т-клеток. Такие системы предоставляют ценную информацию, в то время как они не всегда прогнозирования реакции человека. В человека наши знания в области главным образом приходит от описания образцов фиксированной опухоль от человека пациентов, а также в vitro исследования. Однако в пробирке модели отсутствуют сложные трехмерные опухоли окружение и, таким образом, являются неполными аппроксимации в естественных условиях деятельность Т-клеток. Ломтики свежих, сделанные из ткани, описаны представляют сложные многоклеточные опухоли среды, которая может служить важным связующим звеном между совместно культивируемых исследований и животных моделей. Первоначально в мышиных лимфатических узлов1 и описано в статье JoVE2, этот подход теперь было перенесено в человека опухоли для изучения динамики покрытием3 , а также резидентов клетки T4.
Здесь описывается протокол для подготовки легкое человека опухоли фрагменты, иммуноокрашивания-резидентов CD8 T и опухолевых клеток и отслеживания CD8 Т-лимфоцитов в пределах микроокружения опухоли, с помощью конфокальной микроскопии. Эта система является уникальной размещены на экран для агентов Роман иммунотерапия пользу миграции Т-клеток в опухоли.

Опухоли легких человека обычно сильно проникли в CD8 Т-клеток, которые преимущественно находятся в строме3,4. Следуя этой протокол следует ожидать для визуализации большое количество immunostained CD8 T в срезах опухоли легкое человека. Совместной маркировки с анти EpCAM и анти CD90 антитела должны позволяют разграничить опухоль островков и стромальных областях. Фибриллярного коллагена, обильные в опухоли стромы, могут быть визуализированы без экзогенного окрашивание с помощью второго поколения гармонических на двух Фотон Микроскоп3,4. Обратите внимание, что некоторые опухоли легких человека представляют нет четкого различия между островками опухоли и стромы. Такие опухоли должны быть отброшены, а также образец, представляя большие площади некроз клеток, выявленных неспецифической связывание антител и DAPI окрашивания. В соответствии с опубликованным результаты, полученные в человеческих легких и рака яичников, резидентов CD8 Т-клетки более сконцентрированы в стромы, по сравнению с опухоли островков4. Представитель пример распределения клеток CD8 T опухолевых клеток и CD90 показан на рисунке 2.
Срез assay позволяет для анализа подвижности-резидентов Т-клеток в опухоли в различных регионах. Полезные критерии для сравнения CD8 T клетки подвижности в различных регионах относятся средняя скорость (длина пути, деленную на продолжительность времени пробы) и длина перемещения (вектор в начале и конце трека). Хотя мало в опухоли островков, CD8 T клетки мигрируют более активно в этот отсек, по сравнению с стромы (рис. 3). В среднем средняя скорость отдельных CD8 Т-клетки должна быть близка к 4 мкм/мин в опухоли стромы с высокой внутри и между опухоли вариативности4. В опухоли стромы сократительной способности резидентов Т-клеток сильно зависит от плотности и ориентации внеклеточная матрица волокон3,4. Успешный эксперимент приведет к менее присутствует в районах плотной матрицы по сравнению с свободно матричные области, в соответствии с опубликованные результаты3,4Т-клеток.
Обратите внимание, что некоторые опухоли легких человека exhibit очень высокий уровень аутофлюоресценция, исключающие изображений-резидентов Т-клеток. Такая особенность быстро наблюдается в начале сессии изображений. Autofluorescent опухоли должны быть отброшены. Представитель пример резидентов CD8 Т-клеток в опухоли autofluorescent показан на рисунке 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
Рисунок 1: фотографии системы перфузии. A) раствор фенола Красного бесплатно RPMI обогащается в 5% C02, 95% O2. B решение затем увлажненную перистальтического насоса. C) RPMI решение входит культуры блюдо через вход. На выходе решение придыханием насосом из камеры в контейнер для отходов. Обратите внимание, что кончик стремление устанавливается на уровне для определения высоты решение. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
Рисунок 2: распределение резидентов CD8 T-клеток в опухоли легких человека. Представитель образ кусочек опухоли легких человека витражи для CD8 (зеленый), EpCAM (синий) и CD90 (красный). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
Рисунок 3: моторику резидентов CD8 T-клеток в опухоли легких человека. Траекторий отдельных резидентов CD8 Т-клеток стромы (красный) и опухолевых клеток (синий) регионах ломтиком карцинома легких человека. Срез был окрашенных с указанных антител и образы для 20 мин с конфокального микроскопа. Фибриллово коллагена был обнаружен в конце с помощью гармонических второго поколения (SHG) на двух Фотон микроскопа. Треки цветом согласно CD8 T клетки перемещения длины. Этот образ был изменен с 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
Рисунок 4: представитель изображение опухоли человека легких autofluorescent. Кусочек опухоли был окрашенных CD8 (зеленый) и EpCAM (синий). SHG сигнал — красным цветом. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Этот протокол описывает метод для изображения резидентов проникновения опухоли CD8 Т-клеток помечены дневно спаренных антител в легкое человека опухоли фрагменты. Этот метод позволяет в реальном времени анализ CD8 T клетки миграции с помощью конфокальной микроскопии.

Ex Vivo Визуализация-резидентов CD8 Т-лимфоцитов в опухоли легких человека кусочки с помощью конфокальной микроскопии

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

В естественных условиях ЭПР Оценка рН, pO2, окислительно-восстановительного состояния и концентрации фосфатов и глутатиона в микроокружения опухоли

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Радионуклида флуоресценции Репортер ген Imaging для отслеживания опухолевой прогрессии в моделях грызунов опухоли

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Парамиксовирусы для ориентированных на опухоль иммуномодуляция: дизайн и оценке Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Режиме реального времени обнаружения в апоптоз клеток in Vitro опухоли индуцированные CD8 клетки+ T для изучения подавляющей иммунные функции проникновения опухоли миелоидных клеток

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Обнаружение прогрессирования опухоли легких у мышей с помощью ультразвуковой визуализации

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Поколение ортотопических опухолей поджелудочной железы и Ex vivo Характеристика опухоли-проникновения T клеточной цитотоксичности

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Измерение в режиме реального времени ответ на наркотики в органотипической опухоли ткани фрагменты

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Патологический анализ метастазирования в легкие после инъекции опухолевых клеток в латеральную хвостовую вену

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...