Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Deseamos agradecer a Pierre Bourdoncle y Thomas Guilbert de la Cochin Imaging (Institut Cochin, Paris) para asesoramiento y asistencia con los microscopios. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones del francés Ligue Nationale contre le Cancer, por CARPEM (investigación del cáncer para la medicina personalizada), la Fondation de France y por programa de investigación e innovación de horizonte 2020 de la Unión Europea bajo concesión Acuerdo No 667980 (quilates).

Tumores humanos se obtuvieron con el acuerdo del Comité de ético francés y por la asistencia Publique-Hôpitaux de París (AP-HP) en aplicación al artículo L.1121-1 de la ley. Se obtuvo un consentimiento informado de los pacientes antes de la inclusión en el estudio.
1. obtención de tumores de pulmón humano
<ol>
	<li>Obtener muestras de tumor fresco pulmonar de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas estadio I-III, sometidos a una resección quirúrgica completa de los tumores de pulmón4.</li>
	<li>El tumor fresco no fija en tubo cónico de 15 mL que contiene helado Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) medio de transporte. Dejar reposar en hielo por 30 min hasta el paso 2.7. Nota: Cuando los tumores son recibidos en la tarde, ponerlos a 4 ° C durante la noche y al día siguiente del proceso. En este caso, complementar el Medio RPMI-1640 con 5% de suero bovino fetal (FBS).</li>
</ol>
2. agarosa incrustar y vibratome corte de tumores de pulmón humano
Nota: Realice todos los pasos hasta 2.10 bajo condiciones estériles.
<ol>
	<li>Preparar solución de agarosa al 5% para incrustar mediante la disolución de agarosa de punto bajo punto de fusión de 1 g 20 ml estéril de solución salina con tampón fosfato (PBS) sin calcio y magnesio. El microondas esta solución hasta que la agarosa se disuelva completamente. Permita que la agarosa enfriar a 37 º C colocando la solución en una incubadora a 37 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>En una campana de cultivo de tejidos, preparar Medio RPMI-1640 completo (sin rojo de fenol) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), glutamina 4 mM L y 1 x penicilina y estreptomicina.</li>
	<li>Añadir el Medio RPMI-1640 completo 1.1 mL por pozo a una placa de cultivo celular 6-bien y colocar un inserto de cultura celular de 30 mm en cada pozo. Coloque la placa a un lado en una incubadora a 37 ° C por 30 min hasta el paso 2.12.</li>
	<li>Lugar esteriliza las arandelas planas de acero inoxidable (diámetro interno de 5 mm, exterior de 10 mm de diámetro y 1 mm de espesor) en un plato de plástico de 35 mm con medio completo RPMI. Las arandelas se utilizará más para los anticuerpos se concentran en el segmento de vibratome corte.</li>
	<li>Colocar la biopsia del tumor en un plato de plástico de 10 cm y cortar el tumor con una cuchilla afilada en fragmentos de forma de cubo pequeño de aproximadamente 5 x 5 mm de longitud.</li>
	<li>Saque la agarosa de la incubadora y vierta la solución en un recipiente de plástico de 35 mm.</li>
	<li>Utilice un par de pinzas para transferir cuidadosamente los fragmentos de tumor a un trapo de tejido para retirar el exceso de medio. Inserte los fragmentos de la agarosa y colocar en la parte inferior del plato plástico. Deja el gel de agarosa en hielo por 5 min a solidificar.</li>
	<li>Una vez que solidifique la agarosa, invierta el plato plástico y espátula para liberar el gel entero.</li>
	<li>Utilice una cuchilla afilada para recortar el exceso agarosa que rodea el fragmento del tumor, dejando 3-5 mm de gel alrededor del tejido.</li>
	<li>Montar cada bloque de agarosa en el disco de muestra del vibratome con una gota de pegamento de tejido no tóxico butil cianoacrilato. Llene la bandeja de búfer de vibratome con PBS estéril fría e instale el disco del espécimen en la bandeja.</li>
	<li>Corte la agarosa había incrustada tejido en rodajas gruesas de 350 μm. Ajuste el vibratome a una velocidad de gama lenta (0.2-0.3 mm/s) y la frecuencia vibratoria en un rango medio (1,5 mm).</li>
	<li>Cuidadosamente con unas pinzas finas, recoger las rodajas de los tumores ya que se cortan y colocar plano en los insertos de la cultura de célula de una placa de 6 pozos (paso 2.3). Transferencia 1 rebanada en cada inserción. Tenga mucho cuidado al manipular las rebanadas ya que puede dañarse fácilmente.</li>
	<li>Utilice pinzas finas para colocar arandelas de acero inoxidable en cada segmento individual. Asegúrese de que las arandelas están bien posicionadas en la agarosa que rodea el tejido del tumor.</li>
	<li>Mantener la placa de cultivo a 37 ° C en un incubador humidificado 5% CO2 durante 10 minutos proceder a immunostaining.</li>
</ol>
3. el Immunostaining de residente células T CD8 y células tumorales
<ol>
	<li>Diluir los anticuerpos (concentración final 10 μg/mL) y el colorante nuclear (concentración final 1 μg/mL) en Medio RPMI-1640 sin rojo de fenol. Nota: Use junto fluorescencia anti-CD8 (IgG murino, clon SK1) y anti-EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial) (murino IgG HEA-125) anticuerpos para etiquetar los linfocitos T CD8 y tumor de células epiteliales, respectivamente. Uso de anticuerpos fluorescente unida anti-CD90/Thy1 (IgG murino, clon 5E10) etiqueta fibroblastos y células endoteliales activadas. Utilice 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para etiquetar el núcleo de las células con membrana plasmática comprometida con el fin de evaluar la viabilidad del tejido.</li>
	<li>Retire las placas de cultivo de la incubadora y utilice una pipeta para aspirar el líquido dentro de las arandelas de acero inoxidable. No retire el medio de 1,1 mL de RPMI-1640 situado bajo las inserciones de la cultura de célula (paso 2.3).</li>
	<li>Sin tocar la rebanada y utilizando una pipeta, añadir 40 μl de la solución que contiene los anticuerpos sobre cada rebanada de tumor.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 ° C durante 15 min permitir anticuerpos.</li>
	<li>Con pinzas finas, retire las arandelas, las rebanadas y s dip 10 de ellos en Medio RPMI-1640 sin rojo de fenol. Coloque nuevamente las rebanadas en los insertos de la cultura de célula y añada una gota de rojo de fenol libre RPMI-1640 medio en cada segmento individual. Mantener la placa a 37 ° C durante 10 minutos proceder a la proyección de imagen.</li>
</ol>
4. la proyección de imagen y análisis de la migración de células T CD8 residente dentro de rebanadas de tumor de pulmón humano
Nota: El microscopio confocal utilizado este protocolo es una vertical gira disco, equipado con un 25 x objetivo de inmersión de agua (25 x 0.95 N.A.).
<ol>
	<li>Preparación de la configuración del microscopio<ol>
		<li>Ajuste la temperatura de la cámara de calor del microscopio a 37 ° C pocas horas antes de iniciar la sesión de proyección de imagen.</li>
		<li>Establecer un sistema de perfusión constantemente trozos de tumor con oxigenada (5% CO2, 95% O2) sin rojo fenol Medio RPMI (figura 1). Utilizar una bomba peristáltica para los medios de perfusión del flujo en la cámara de proyección de imagen y aspirar la solución a un matraz de recogida de residuos.</li>
		<li>Funcionar la bomba peristáltica para permitir la solución oxigenada al pasar por los tubos de la perfusión.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Con pinzas finas, sacar la rodaja de la placa de 6 pozos y transferencia para el plato de plástico de 35 mm lleno de Medio RPMI sin rojo de fenol. Inmovilizar el segmento con un ancla de rebanada 19,7 mm diámetro con 2 mm espaciados-hilos de rosca. Coloque el plato Petri en la etapa de proyección de imagen del microscopio. Conecte las puntas de entrada y salida del sistema de perfusión. Encienda el sistema de perfusión y ajustar el caudal de los medios de comunicación a 0.8 mL/min.</li>
	<li>Bajar el objetivo de inmersión en agua a la rebanada. Se centran en la parte superior de la rodaja con luz de campo brillante.</li></ol>Con luz fluorescente apropiada, seleccione una región de interés que contiene las células T CD8, islotes tumor (positivos para EpCAM) y una zona de tejido conectador (positiva para CD90). Evaluar DAPI coloración en la superficie de corte y más profundo en el tejido para comprobar la viabilidad de las células dentro de la rebanada. Nota: Una porción saludable contiene sólo una minoría de células positivas DAPI a varias micras de la superficie de corte.
	<li>Establecer una sesión de imágenes con las siguientes acciones.<ol>
		<li>Dependiendo de la intensidad de la señal fluorescente de los 3 fluoróforos, establecer el tiempo de exposición entre 50 a 800 ms y la intensidad del láser entre 20 a 40%.</li>
		<li>Seleccione el espesor z pila imagen dentro el segmento de tumor. Nota: Aquí, 10-12 aviones ópticos que abarca una profundidad total de 60-70 μm en la dimensión z fueron capturados.</li>
		<li>Seleccione la posición de inicio a aproximadamente 10 μm por debajo de las primeras células de T CD8 marcadas.</li>
		<li>Definir el intervalo de tiempo entre cada imagen z-stack entre 10 a 30 s y el tiempo de grabación total entre 10 a 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizar migración de células T CD8 residente como se describe en la referencia4.<ol>
		<li>Después de importar los datos a un software de seguimiento, crear lugares para cada célula T CD8 en el campo. Ajustar el diámetro de las células y el umbral de detección según en las células fluorescentes reflejadas.</li>
		<li>Inspeccionar las pistas y eliminar cualquier pista irrelevante por eliminarlos. Canciones correcto de conexión y desconexión de diferentes pistas y diferentes momentos de las mismas pistas. Exportar los datos (velocidad, longitud de desplazamiento de la pista) a un software de hoja de cálculo.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

No hay conflicto de interés declarado.

Se describe una técnica sencilla, rápida y robusta para la generación de rebanadas de tumor de pulmón humano y evaluación del comportamiento dinámico de las células de T CD8 residente en un entorno conservado tumor con un microscopio confocal. Este protocolo es un refinamiento de un anterior artículo de Zeus que describe el control plateadas de células de T en murine del nodo de linfa rebanadas2.
Decoloración de los tintes fluorescentes se debe considerar especialmente con tintes de primera generación como el isotiocianato de fluoresceína y ficoeritrina. Encontramos que un pronunciado fotoblanqueo de anticuerpos directamente acoplado se produjo con un microscopio de dos fotones. Por el contrario, photobleaching mínimo observó con microscopios confocales, especialmente utilizando colorantes fluorescentes brillantes desarrolladas recientemente.
Los anticuerpos son moléculas relativamente grandes y por lo tanto puede ser difícil su penetración en el tejido. Este paso puede mejorarse incrementando el tiempo de incubación. Además, el uso de una menor coloración reactivos tales como directamente acoplado de fragmentos Fab de anticuerpos representa una buena alternativa.
Todos los anticuerpos descritos en este protocolo han sido previamente validados y conocido para producir tinción brillante4. Por lo tanto, no se requieren controles de isotipo. Sin embargo, si desean modificaciones a este método con otros anticuerpos, entonces el uso de anticuerpos de isotipo control es altamente recomendable.
Este sistema experimental presenta algunas limitaciones. El procedimiento de corte dañará el tejido, que puede afectar el comportamiento de las células T CD8, especialmente cerca de la superficie de corte. Además, un número de factores solubles (e.g. quimiocinas) instrumentales en el control de la migración de células T puede perder. Una forma para evitar estos problemas es mediante el control de las células T a varias decenas de micras de la superficie en regiones probablemente más saludables del tejido. Experimentos publicados revelan que localizada profundamente dentro del tejido de las células de T emigran más activamente que las células T localizadas cerca de la superficie cortada4. Hemos utilizado microscopios confocales para nuestros estudios, pero es probable que dos fotones microscopios aumentará la resolución espacial en profundidad.
Este enfoque se basa en el uso de anticuerpos de fluorescencia junto que no son moléculas neutras. Tamaño completo los anticuerpos son susceptibles de afectar el funcionamiento normal de las células de T de diferentes maneras. En primer lugar, los anticuerpos anti-CD8 pueden alterar la migración de la célula de T mediante la activación de una cascada de señalización intracelular capaz de afectar el citoesqueleto de los linfocitos. En segundo lugar, los anticuerpos anti-CD8 pueden modular la interacción entre CD8 y MHC clase I moléculas, un paso importante en el proceso de reconocimiento del antígeno. En tercer lugar, intacto puede se unen a receptores Fc expresados por muchas células mieloides distribuidas en el tumor y por lo tanto susceptibles para aumentar la señal inespecífica. No tenemos ningún indicio de que un problema afectó nuestros datos, probablemente porque los receptores Fc de las células mieloides residente son, a diferencia de las células en cultivo, impregnados de las inmunoglobulinas presentes en el entorno del tumor. De hecho, la adición de suero durante el procedimiento de etiquetado, un proceso conocido para bloquear los receptores de Fc gratis, no cambió la inmuno-tinción. Sin embargo, los fragmentos Fab de anticuerpos, sin región Fc, así como anticuerpos mutado en su región de Fc y de fragmentos de anticuerpos derivados de camélidos8 representan otras estrategias alternativas para rastrear las células residentes con trazadores fluorescentes.
En las últimas décadas, varios sistemas de modelo se han desarrollado y utilizado para la proyección de imagen en tiempo real de los linfocitos T. Se trata de preparaciones en vitro de las células previamente purificadas y cultivadas con presentadoras de antígeno las células. Estas preparaciones han permitido notables avances en la definición de los mecanismos de reconocimiento del antígeno y la capacidad de respuesta. Sin embargo, carecen de la complejidad del ambiente de tejido. Se han establecido otras preparaciones que más imitan muy de cerca la estructura de un tejido propio. Ejemplos, matrices de gel de colágeno tridimensional en que linfocitos T purificados han sido incrustados, así como cultura de tejido reaggregated fragmentos han sido utilizados para monitorear el comportamiento dinámico de los linfocitos T con fluorescentes tecnologías9 . Estos sistemas presentan la ventaja de una arquitectura cerca del tejido propio, pero carecen de otros factores celulares y solubles importantes. En ratón, microscopia intravital de dos fotones ha sido empleada para seguimiento de células T en el medio ambiente realmente fisiológica de un órgano intacto10. Sin embargo, tal enfoque es técnicamente difícil de establecer. Además, los modelos de ratón muestran diferencias notables con la fisiología humana.
La técnica descrita en este protocolo representa un entorno complejo multicelular tumor que está en una posición para actuar como un vínculo importante entre los estudios de la cultura y modelos animales.
El protocolo descrito en este documento puede utilizarse también para el seguimiento de la movilidad de otras células de los linfocitos T CD8 que se han generado anticuerpos. Además, la técnica puede adaptarse a otros tumores murinos y humanos y de los tejidos. Por ejemplo, hemos sido capaces de imagen en tiempo real la dinámica de las células B etiquetada con un anticuerpo anti-CD19 en amígdalas humanas frescas.
La técnica descrita en este protocolo permite a pantalla de moléculas terapéuticas control de motilidad de la célula de T en los tejidos. La accesibilidad de lo sistema de cultivo permite aplicar algunos reactivos farmacológicas y sus consecuencias en la migración de la célula de T de la prueba. Ahora se acepta que en el crecimiento de tumores, las células T CD8 muestran una baja migración y reducción de contactos con células de tumor11. Importante, la escasa presencia de células T en las regiones de la célula tumoral se asocia con un mal resultado y se considera uno de los mecanismos de resistencia a la inmunoterapia basada en células T cáncer. Se han identificado múltiples obstáculos que limitan las células T migren en tumores incluyendo una densa matriz extracelular. En este sentido, la identificación de moléculas capaces de restaurar la motilidad de la célula de T y la interacción con las células malignas representa un paso importante en la inmunoterapia del cáncer. En un estudio anterior, encontramos que una degradación parcial del colágeno con colagenasa, agudo aplicado a trozos de pulmón humano, mejora el contacto de las células T con las células del tumor.
Por último, la posibilidad de mantener sectores tumorales humanas en cultura hasta varios días7,12,13 ofrece una serie de aplicaciones prometedoras en términos de células T y la inmunoterapia.Sin embargo, la estabilidad del sistema modelo en cultura a largo plazo es un parámetro importante que debe evaluarse detenidamente.
Obtener tejido fresco y saludable es un factor crítico para producir rebanadas de calidad con buena immunostaining de células CD8, las células del tumor y elementos estromales. Es crucial mantener la biopsia del tumor a 4 ° C antes de procesar.
El manejo de trozos con pinzas finas representa otro paso importante dentro de este protocolo. Esto debe realizarse con mucho cuidado como la agarosa puede ser dañado fácilmente. Un corte en la agarosa comprometerá el sello de la arandela de acero inoxidable, dando como resultado una fuga de los anticuerpos que contiene las soluciones.

Linfocitos t CD8 juega un papel clave en la batalla contra el cáncer. Sin embargo, muchos mecanismos de prevencion prevenir los linfocitos T de matar las células malignas. En los últimos años, varias estrategias prometedoras que liberan los frenos en las células de T se han desarrollado y utilizado en la clínica5. Los dos enfoques que conservan una considerable atención son metas de control inmune anticuerpos, tales como terapias con células T anti-PD-1 y adoptivos. Sin embargo, a pesar de los recientes éxitos, sólo un subconjunto de pacientes se benefician de estas terapias6. Un desafío importante es identificar mecanismos de resistencia a la inmunoterapia del cáncer para desarrollar tratamientos más eficaces. Otro desafío es desarrollar sistemas modelo en cual novela terapias pueden ser caracterizadas y comprobadas para su potencia y seguridad. Hasta ahora, la mayoría de estos ensayos se basa en vitro de la célula sistemas de cultivo que mal imitan la complejidad del tejido del tumor.
Ex vivo rebanadas de tejido es una técnica prometedora, ya que conserva el original del microambiente del tejido7. Con los años, hemos creado este enfoque a la dinámica de los linfocitos T en varios tejidos. Nuestros resultados indican que las células de T fluorescencia marcadas añadidas encima de rebanadas de murine del nodo de linfa migran en los tejidos y responden a sus señales microambiental apropiado1,2. Del mismo modo, los linfocitos T overlaid sobre rodajas de tumor de pulmón humano rápidamente son reclutados en el tumor de estroma3. Usando esta técnica, hemos identificado la matriz extracelular como un elemento importante en el control de la distribución y migración de las células en los tumores humanos3,4. Porque el comportamiento del ex vivo purificada y plateado de las células T no necesariamente refleja el comportamiento de los linfocitos T de residente intratumoral, recientemente nos hemos refinado este enfoque4.
Aquí se describe un protocolo para el seguimiento de residentes linfocitos T dentro de tumores pulmonares humanas frescas rebanadas. Los pasos consisten en la preparación de rodajas de tumor de pulmón humano (incluyendo incorporación de agarosa y vibratome corte del tejido integrado), la tinción de células de T endógenas con anticuerpos fluorescentes en rebanadas frescas del tumor y el monitoreo de Estas células con un microscopio confocal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

Célula T CD8 son actores clave en la lucha contra el cáncer. En orden para que las células T CD8 matar las células tumorales que necesitan para entrar en el tumor, migran dentro del microambiente del tumor y responder adecuadamente a los antígenos tumorales. El reciente desarrollo de enfoques imagen mejorados, tales como microscopia de 2 fotones y el uso de modelos de tumor de ratón poderoso han arrojado luz sobre algunos de los mecanismos que regulan las actividades de la célula de T antitumorales. Considerando que estos sistemas han proporcionado información valiosa, ellos no siempre predicen las respuestas humanas. En humanos, nuestros conocimientos en el campo viene principalmente de la descripción de muestras tumorales fija de pacientes humanos, así como estudios en vitro . Sin embargo, en vitro modelos carecen el medio tumor tridimensional complejo y, por lo tanto, son aproximaciones incompletas de en vivo las actividades de la célula de T. Frescas rebanadas de tejido explanted representan un ambiente complejo multicelular tumor que puede actuar como un vínculo importante entre los estudios co cultivos y modelos animales. Originalmente en murinos ganglios1 y descrito previamente en un artículo de JoVE2, este enfoque ha sido transpuesto a tumores humanos para examinar la dinámica de tanto plateado3 como residente de las células de T4.
Aquí, se describe un protocolo para la preparación de rodajas de tumor de pulmón humano, immunostaining de células T CD8 y tumor residente y el seguimiento de linfocitos T CD8 en el microambiente del tumor usando microscopia confocal. Este sistema es únicamente para pantalla para agentes de inmunoterapia novela favoreciendo la migración de la célula de T en tumores.

Tumores de pulmón humano son generalmente altamente infiltrados en las células T CD8 que se encuentran preferentemente en el tejido conectador3,4. Siguiendo este protocolo se debe esperar a visualizar un gran número de linfocitos T CD8 immunostained en rebanadas de tumor de pulmón humano. Un etiquetado conjuntamente con los anticuerpos anti-EpCAM y anti CD90 debe permitir delimitar el tumor islotes y áreas estromales. Colágeno fibrilar, abundante en el estroma del tumor, se puede visualizar sin manchas exógenas utilizando segunda generación armónica en un microscopio de dos fotones3,4. Tenga en cuenta que algunos tumores de pulmón humano no presentan ninguna distinción clara entre islotes tumorales y el estroma. Estos tumores deben ser desechados así como muestra que presenta áreas extensas de necrosis celular identificado por fijación no específica de anticuerpos y la coloración de DAPI. Consistente con resultados publicados en pulmón humano y carcinomas de ovarianos, residente células T CD8 están más concentradas en el estroma comparado con tumor islotes4. Un ejemplo representativo de la distribución de células T CD8 en relación con las células del tumor y CD90 se muestra en la figura 2.
El ensayo de corte permite el análisis de la motilidad celular T residente en regiones diferentes del tumor. Criterios útiles para comparar la motilidad de la célula T CD8 en las diferentes regiones incluyen la velocidad media (longitud del camino dividida por la duración de tiempo muestreada) y la longitud de desplazamiento (vector entre el principio y el final de una pista). Aunque es escaso en islotes tumorales, linfocitos t CD8 migra más activamente en este compartimiento en comparación con el tejido conectador (figura 3). En promedio, la velocidad media de células T CD8 debe ser cerca de 4 μm/min en el estroma del tumor con alta intra y variabilidades entre tumor4. En el estroma del tumor, la motilidad de las células residentes está fuertemente influenciada por la densidad y orientación de la matriz extracelular fibras3,4. Un experimento exitoso tendrá como resultado menos células T presentes en las áreas de la matriz densa en comparación con regiones de la matriz floja, constantes con resultados publicados3,4.
Tenga en cuenta que algunos tumores de pulmón humano muestran un nivel muy alto de Autofluorescencia que excluye la proyección de imagen de las células residentes. Tal característica se observa rápidamente al principio de la sesión de imágenes. Tumores autofluorescent deben ser desechados. Un ejemplo representativo de las células de T CD8 residente en un tumor autofluorescent se muestra en la figura 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
Figura 1: fotografías del sistema de perfusión de. A) la solución RPMI sin rojo de fenol se enriquece en 5% C02, 95% O2. B) la solución entonces es inundada por una bomba peristáltica. C) la solución RPMI entra en la placa de cultivo a través de la entrada. En la salida, la solución es aspirada por la bomba de la cámara en un recipiente de desechos. Tenga en cuenta que la punta de aspiración se encuentra en un nivel para determinar la altura de la solución. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
Figura 2: distribución de residentes T CD8 de las células en un tumor de pulmón humano. Imagen representativa de un trozo de tumor de pulmón humano había teñido para CD8 (verde), EpCAM (azul) y CD90 (rojo). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
Figura 3: movilidad de residente linfocitos T CD8 de las células en un tumor de pulmón humano. Trayectorias de las células T CD8 residentes individuales en el estroma (rojo) y regiones (azul) de la célula del tumor de una rebanada de carcinoma de pulmón humano. La rebanada de tinción con los anticuerpos indicados y fotografiada por 20 min con un microscopio confocal. El colágeno fibrilar fue detectado al final mediante el uso de segunda generación armónico (SHG) en un microscopio de dos fotones. Las pistas son codificadas por colores según la longitud de desplazamiento de la célula T CD8. Esta imagen ha sido modificada desde 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
Figura 4: imagen representativa de un tumor de pulmón humano autofluorescent. El segmento del tumor fue manchado para CD8 (verde) y EpCAM (azul). La señal SHG está en rojo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Este protocolo describe un método de imagen residente tumor-infiltración T CD8 células con anticuerpos fluorescente acoplados dentro de rebanadas de tumor de pulmón humano. Esta técnica permite el análisis en tiempo real de la migración de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

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