Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Vi vill tacka Pierre Bourdoncle och Thomas Guilbert i Cochin Imaging anläggningen (Institut Cochin, Paris) för råd och hjälp med Mikroskop. Detta arbete var stöds delvis genom bidrag från det franska Ligue Nationale contre le Cancer, av CARPEM (Cancer Research för personlig medicin), genom den Fondation de France och Europeiska unionens programmet Horisont 2020 forskning och innovation under lån avtal nr 667980 (CARAT).

Mänskliga tumörer erhölls med överenskommelsen av den franska etiska kommittén och av den hjälp Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) i ansökan med artikeln L.1121-1 i den franska lagen. Ett skriftligt informerat samtycke erhölls från patienterna före införandet i studien.
1. att få mänskliga lungtumörer
<ol>
	<li>Erhålla färsk lung tumörprover från patienter med stadium I-III icke-småcellig lungcancer som genomgick en komplett kirurgisk resektion av sin lungcancer tumörer4.</li>
	<li>Transportera icke fasta färska tumören i 15 mL koniska rör innehållande iskall Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) medium. Arealuttag på is för 30 min tills steg 2,7. Obs: När tumörer tas emot på eftermiddagen, placera dem vid 4 ° C över natten och processen följande dag. I detta fall komplettera RPMI-1640 media med 5% fetalt bovint serum (FBS).</li>
</ol>
2. Agarens inbäddning och vibratome skivning av mänskliga lungtumörer
Obs: Utföra alla steg fram till 2.10 under sterila förhållanden.
<ol>
	<li>Förbereda 5% agaros lösning för inbäddning av upplösning 1 g låg-smältande punkt agaros i 20 mL steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) utan kalcium och magnesium. Mikrovågsugn denna lösning tills Agarens är helt upplöst. Tillåta Agarens svalna vid 37 ° C genom att placera lösningen i en inkubator vid 37 ° C i 5 min.</li>
	<li>I en vävnadskultur huva, förbereda komplett RPMI-1640 medium (utan fenolrött) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 4 mM L-glutamin och 1 x penicillin och streptomycin.</li>
	<li>Lägg till 1,1 mL komplett RPMI-1640 medium per brunn till en 6-väl cell kultur tallrik och placera en 30 mm cell kultur infoga i varje brunn. Avsätta plattan i en inkubator vid 37 ° C i 30 min tills steg 2.12.</li>
	<li>Plats steriliseras rostfritt stål platta brickor (inre diameter på 5 mm, utanför diameter 10 mm och tjocklek av 1 mm) i en 35 mm plast skål fylld med RPMI komplett medium. Brickor används ytterligare koncentrera antikropparna på vibratome-cut skiva.</li>
	<li>Placera tumör biopsi i en 10-cm plast skålen och skär tumören med en vass kniv i liten kub form fragment av cirka 5 x 5 mm längd.</li>
	<li>Ta ut Agarens från inkubatorn och Häll lösningen i en 35 mm plast maträtt.</li>
	<li>Använd ett par pincett noggrant överföra tumör fragment till en vävnad torka bort överskottet av medium. Infoga fragment i Agarens och placera dem på botten av plast skålen. Lämna agarosgel på is för 5 min att stelna.</li>
	<li>När Agarens stelnar, Invertera plast skålen och använda en spatel för att släppa hela gelen.</li>
	<li>Använd en vass kniv för att trimma överflödigt Agarens kring tumören fragmentet, lämnar 3-5 mm gel runt vävnaden.</li>
	<li>Montera varje agaros block på disken exemplar av vibratome med en droppe giftfri butyl cyanoakrylat vävnad lim. Fyll vibratome buffertbrickan med steril iskall PBS och installera preparatet skivan i facket.</li>
	<li>Cut Agarens inbäddade vävnad i 350 µm tjocka skivor. Justera vibratome med en långsam utbud hastighet (0,2-0,3 mm/s) och svängningsfrekvensen på en medellång räckvidd (1,5 mm).</li>
	<li>Med fin pincett, noggrant samla tumörer skivor som de skärs och placera dem platt på cell kultur skär 6-well platta (steg 2.3). Överföra 1 skiva på varje insats. Använd stor omsorg vid hantering skivor som de lätt kan skadas.</li>
	<li>Använd fina pincett för att placera rostfria brickor på varje enskild skiva. Kontrollera brickor är väl positionerade på Agarens omgivande tumörvävnad.</li>
	<li>Upprätthålla kultur plattan vid 37 ° C i en 5% CO2 befuktade inkubator för 10 min. Fortsätt till immunfärgning.</li>
</ol>
3. immunfärgning av bosatta CD8 T-celler och tumörceller
<ol>
	<li>Späd antikropparna (slutlig koncentration 10 µg/mL) och nukleära färgämnet (slutliga koncentrationen 1 µg/mL) i RPMI-1640 media utan fenolrött. Obs: Använd fluorescently-kopplade anti-CD8 (murina IgG, klona SK1) och anti-EpCAM (epitelial cell adhesion molekylen) (murina IgG HEA-125) antikroppar mot etikett CD8 T-lymfocyter och tumör epitelceller, respektive. Använd fluorescently-kopplade anti-CD90/Thy1 (murina IgG, klon 5E10) antikroppar mot etikett fibroblaster och aktiverade endotelceller. Använda 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) för att namnge kärnan av celler med en komprometterad plasma membran för att bedöma vävnad livskraft.</li>
	<li>Ta bort kultur plattorna från inkubatorn och Använd en pipett för att aspirera vätska inuti den rostfria brickor. Ta inte bort 1,1 mL RPMI-1640 media placeras under cell kultur skären (steg 2.3).</li>
	<li>Utan att röra biten och använda en pipettspetsen, tillsätt 40 µL av lösningen innehållande antikroppar mot varje tumör skiva.</li>
	<li>Inkubera plattan vid 37 ° C i 15 min att tillåta antikropp färgning.</li>
	<li>Med fin pincett, ta bort brickorna, ta ut skivor och doppa dem 10 s i RPMI-1640 media utan fenolrött. Placera tillbaka skivor på cell kultur skären och Lägg en droppe av phenol red-gratis RPMI-1640 medium på varje enskild skiva. Upprätthålla plattan vid 37 ° C i 10 min. Fortsätt till imaging.</li>
</ol>
4. imaging och analysera bosatt CD8 T cellmigration inom human lung tumör skivor
Obs: Mikroskopet confocal används i detta protokoll är en upprätt spinning disk utrustad med en 25 x vatten nedsänkning mål (25 x / 0,95 N.A.).
<ol>
	<li>Förbereda Mikroskop setup<ol>
		<li>Ställa in temperaturen på mikroskopet värme-avdelningen vid 37 ° C ett par timmar innan bildsession.</li>
		<li>Ställ in ett system för att ständigt BEGJUTA tumör skivor med syresatt (5% CO2, 95% O2) phenol red-gratis RPMI medium (figur 1). Använd en Peristaltisk pump att flöda perfusion media in i imaging kammaren och aspirera lösningen till en avfallsinsamling kolv.</li>
		<li>Kör den peristaltiska pumpen för att tillåta syresatt lösningen att gå igenom perfusion rören.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Med fin pincett, ta ut skiva från 6-väl plattan och överföra den till 35 mm plast skålen fylld med fenolrött-fri RPMI medium. Immobilisera på segmentet med en 19,7 mm diameter skiva ankare med 2 mm radavstånd-trådar. Placera petriskål på imaging scenen av mikroskopet. Anslut inlopp och utlopp tips av perfusion systemet. Slå på systemet perfusion och Ställ in media flödet till 0,8 mL/min.</li>
	<li>Lägre nedsänkning i vatten målet till segmentet. Fokusera på toppen av segmentet med ljusa fält ljus.</li></ol>Använda lämpliga fluorescerande ljus, Välj en region av intresse som innehåller CD8 T-celler, tumör holmar (positiv för EpCAM) och ett stroma område (positiv för CD90). Kontrollera livskraft hos celler inom segmentet genom att bedöma DAPI färgning på snittytan och djupare in i vävnaden. Obs: En hälsosam skiva innehåller endast en minoritet av DAPI positiva celler på flera mikrometer från snittytan.
	<li>Ange en bildsession med följande åtgärder.<ol>
		<li>Beroende på intensiteten av fluorescerande signalen av de 3 fluorophores, ställa in exponeringstiden mellan 50 till 800 ms och laser intensitet mellan 20 till 40%.</li>
		<li>Välj z stack tjocklek till bilden inom tumör segmentet. Obs: Här, 10-12 optiska flygplan som spänner över djup 60-70 µm i dimensionen z tillfångatogs.</li>
		<li>Välj startposition vid ca 10 µm nedanför de första märkt CD8 T-cellerna.</li>
		<li>Definiera tidsintervallet mellan varje z-stack bild mellan 10 till 30 s och den totala inspelningstiden mellan 10 till 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analysera bosatt CD8 T cellmigration som beskrivs i referens4.<ol>
		<li>När du har importerat data till en spårningsprogramvara, skapa ställen för varje CD8 T-cell i fältet. Justera diametern på cellerna och tröskeln för identifiering enligt på avbildad fluorescerande celler.</li>
		<li>Inspektera spåren och ta bort alla irrelevanta spår genom att ta bort dem. Rätt spår genom att ansluta och koppla från olika spår och olika tidpunkter på samma spår. Exportera data (spår hastighet, deplacement spårlängd) till ett kalkylprogram.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

Inga intressekonflikter förklarade.

En enkel, snabb och robust teknik för att generera mänskliga lung tumör skivor och bedömning av dynamiska beteende av bosatta CD8 T-celler i en bevarad tumör miljö med confocal Mikroskop beskrivs. Detta protokoll är en förfining av en tidigare JoVE artikel som beskriver övervakning av pläterad T-celler på murina lymfkörtel skivor2.
Blekning av fluorescerande färgämnen måste beaktas särskilt med första generationen färgämnen som fluorescein isotiocyanat och fykoerytrin. Vi hittade att en uttalad fotoblekning direkt kopplade antikroppar inträffat med en två-foton Mikroskop. Däremot var minimal fotoblekning märkt med confocal Mikroskop, särskilt med ljusa fluorescerande färger helt nyligen.
Antikroppar är relativt stora molekyler och deras penetration in i vävnaden kan därför vara svårt. Detta steg kan förbättras genom att öka inkubationstiden. Dessutom färgning att använda en mindre reagenser såsom direkt kopplade Fab fragment av antikroppar utgör ett bra alternativ.
Alla antikroppar som beskrivs i detta protokoll har tidigare validerats och kända för att producera ljus färgning4. Därför krävs inte isotypen kontroller. Dock om ändringar till den här metoden använder andra antikroppar önskas, rekommenderas då användningen av isotypen kontroll antikroppar.
Detta experimentella system utgör några begränsningar. Förfarandet för styckning kommer att skada vävnaden, vilket kan påverka beteendet hos CD8 T-celler, speciellt nära den skurna ytan. Dessutom kan ett antal lösliga faktorer (t.ex. chemokiner) instrumental i att kontrollera migreringen av T-celler förloras. Ett sätt att kringgå dessa problem är genom att övervaka T-celler som ligger på flera tiotals mikrometer från ytan i förmodligen friskare regioner i vävnaden. Publicerade experiment visar att T-celler lokaliserad djupt in i vävnaden migrerar mer aktivt än T-celler som lokaliserade nära den skurna ytan4. Vi har använt confocal Mikroskop för våra studier men det är troligt att två-foton Mikroskop kommer att öka den rumsliga upplösningen i djup.
Denna strategi bygger på användning av fluorescently-kopplade antikroppar som inte är neutrala molekyler. Full storlek antikroppar är mottagliga för påverka den normala funktionen av T-celler på olika sätt. Första kan anti-CD8 antikroppar förändra T cellmigration genom att utlösa en Intracellulär signalering kaskad kan påverka cytoskelettet av lymfocyt. Andra anti-CD8 antikroppar kan modulera samspelet mellan CD8 och MHC klass I molekyler, ett viktigt steg i processen antigen erkännande. Tredje, intakt antikroppar kan binda till Fc receptorer uttrycks av många myeloida celler distribuerade i tumören och därför mottagliga att öka den icke-specifik signalen. Vi har inget som tyder på att sådant problem påverkas vår data, förmodligen eftersom Fc receptorer av bosatta myeloida celler är, till skillnad från celler i kultur, mättad med immunglobuliner närvarande inom den tumör miljön. Tillägg av serum under förfarandet för märkning, en process som kallas att blockera gratis Fc-receptorer, förändrades faktiskt inte immuno-färgningen. Trots Fab fragment av antikroppar, saknar Fc-regionen, samt antikroppar muterad i deras Fc-regionen och kameldjur-derived antikropp fragment8 representerar andra alternativa strategier för att spåra bosatt celler med fluorescerande spårämnen.
Under de senaste årtiondena, har flera modellsystem utvecklats och används för realtid bildtagning av T-lymfocyter. Dessa inkluderar in vitro- beredningar av T celler tidigare renat och odlade med antigen-presenterande celler. Sådana preparat har gjort anmärkningsvärda framsteg i att definiera mekanismer antigen erkännande och lyhördhet. De saknar dock komplexiteten i vävnad miljön. Andra preparat har fastställts att mer noggrant efterlikna strukturen av en infödd vävnad. För exempel, tredimensionella kollagen gel matriser där renat T-celler har inbäddade, liksom kultur av reaggregated vävnad fragment har använts för att övervaka dynamiska beteende av T-lymfocyter med fluorescerande avbildningstekniker9 . Dessa system presentera fördelen av en arkitektur nära infödda vävnaden, men de saknar andra viktiga cellulära och lösliga faktorer. I mus, har två-photon intravital mikroskopi varit anställd att spåra T-celler i verkligt fysiologiska miljön av en intakt orgel10. Sådant tillvägagångssätt är dock tekniskt svårt att ställa upp. Dessutom visar musmodeller anmärkningsvärda skillnader med människans fysiologi.
Tekniken som beskrivs i detta protokoll representerar en komplexa flercelliga tumör-miljö som är unikt positionerat för att fungera som en viktig länk mellan Co kulturstudier och djurmodeller.
Protokollet beskrivs häri kan också användas för att spåra motiliteten i andra celler än CD8 T-lymfocyter som antikroppar har genererats. Dessutom kan tekniken anpassas till andra mänskliga och murina tumörer och vävnader. Vi har exempelvis kunnat bild i realtid dynamiken i B-celler märkta med en anti-CD19 antikropp i färska mänskliga tonsiller.
Tekniken som beskrivs i detta protokoll kan skärmen för terapeutiska molekyler kontrollera T cell motilitet i vävnader. Tillgängligheten till kultur systemet tillstånd att tillämpa vissa farmakologiska reagenser och testa deras konsekvenser på T-cellmigration. Det är nu accepterat att i växande tumörer, CD8 T-celler uppvisar en låg migration och reducerade kontakter med tumör celler11. Ännu viktigare, knappa förekomsten av T-celler i tumören cell regioner är associerade med ett dåligt resultat och anses vara en av resistensmekanismer till T cell-baserad cancer immunoterapi. Flera hinder begränsar T-celler från att migrera i tumörer har identifierats inklusive en tät extracellulärmatrix. I detta avseende utgör identifiering av molekyler kan återställa T cell motilitet och interaktion med maligna celler ett viktigt steg i cancer immunoterapi. I en tidigare studie fann vi att en partiell nedbrytning av kollagen med kollagenas, akut tillämpas på mänskliga lung skivor, förbättrar kontakten av T-celler med tumörceller.
Slutligen, möjligheten att hålla mänskliga tumör skivor i kulturen för upp till flera dagar7,12,13 erbjuder ett antal lovande tillämpningar i termen av T-celler och immunterapi.Stabiliteten i modell systemet under lång sikt kultur är dock en viktig parameter som måste bedömas noggrant.
Att få fräsch och frisk vävnad är en kritisk faktor att producera kvalitet skivor med bra immunfärgning av CD8 celler, tumörceller och stromal element. Att hålla tumören biopsi vid 4 ° C före behandling är avgörande.
Hantering av skivor med fin pincett representerar ett annat viktigt steg i detta protokoll. Detta bör utföras med omsorg eftersom Agarens lätt kan skadas. En sänkning av Agarens kommer att äventyra sigill gjort av rostfritt stål bricka vilket resulterar i läckage av antikropp innehållande lösningar.

CD8 T-celler spelar en nyckelroll i kampen mot cancer. Dock hindra många immunhämmande mekanismer T-lymfocyter från döda maligna celler. De senaste åren har har flera lovande strategier som lossa bromsarna på T-celler utvecklats och används i kliniken5. De två tillvägagångssätt att behålla stor uppmärksamhet är immun checkpoint-targeting antikroppar, såsom anti-PD-1 och adoptiv T cellterapi. Ändå, trots senaste framgångar, endast en delmängd av patienter nytta av dessa behandlingar6. En stor utmaning är att identifiera mekanismer för resistens mot cancer immunterapi för att utveckla effektivare behandlingar. En annan utmaning är att utveckla modellsystem som roman terapier kan kännetecknas och testade för deras styrka och säkerhet. Hittills har baseras de flesta av dessa analyser på in vitro- kultur cellsystem som dåligt efterliknar komplexiteten i tumörvävnad.
Ex vivo vävnad skivor är en lovande teknik, eftersom det bevarar den ursprungliga vävnad mikromiljö7. Genom åren har vi satt upp denna strategi att följa dynamiken i T-lymfocyter i olika vävnader. Våra resultat tyder på att fluorescently märkt T-celler som lagt till ovanpå murina lymfkörtel skivor migrera in i vävnaden och svara på deras lämpliga microenvironmental cues1,2. T-lymfocyter som överlagras på människans lung tumör skivor rekryteras på samma sätt snabbt in den tumör stroma3. Med denna teknik, har vi identifierat den extracellular matrisen som en viktig del i kontrollen av distribution och migrering av T-celler inom mänskliga tumörer3,4. Eftersom beteendet hos ex vivo renas och guldpläterade T-celler inte nödvändigtvis återspeglar beteendet hos bosatta intratumoral T-lymfocyter, har vi nyligen förfinat denna metod4.
Här beskriver vi ett protokoll för att spåra bosatt T-lymfocyter inom skivor tillverkade av färska mänskliga lungtumörer. De olika stegen består av utarbetandet av mänskliga lung tumör skivor (inklusive agaros inbäddning och vibratome snittning av inbäddade vävnad), färgningen av endogena T-celler med fluorescerande antikroppar i färsk tumör segment och övervakning av dessa celler med en confocal Mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

CD8 T-cell är nyckelaktörer i kampen mot cancer. För CD8 T-celler att döda tumörceller behöver de in i tumören, migrera inom den tumör närmiljön och svara adekvat på tumör antigener. Den senaste utvecklingen av förbättrade bildgivande metoder, såsom 2-foton mikroskopi, och användningen av kraftfull mus tumör modeller har belyst några av de mekanismer som reglerar anti-tumor T cell aktiviteter. Sådana system har lämnat värdefulla insikter, de inte alltid förutse människors reaktioner. I mänskliga kommer vår kunskap inom främst från en beskrivning av fasta tumörprover från mänskliga patienter som in vitro- studier. Dock in vitro- modeller saknar den komplexa tredimensionella tumör miljön och, därför, är ofullständiga approximationer av in vivo T cell aktiviteter. Färska skivor tillverkade av explanterad vävnad representerar en komplexa flercelliga tumör-miljö som kan fungera som en viktig länk mellan Co odlade studier och djurmodeller. Ursprungligen inrättades i murina lymfkörtlar1 och tidigare beskrevs en JoVE artikel2, har detta tillvägagångssätt nu införlivats till mänskliga tumörer att undersöka dynamiken i guldpläterad3 såväl som bosatt T celler4.
Här, beskrivs ett protokoll för beredning av mänskliga lung tumör skivor, immunfärgning av bosatta CD8 T och tumör celler och spårning av CD8 T-lymfocyter inom den tumör närmiljön med konfokalmikroskopi. Detta system är unikt lämpade att skärmen för romanen immunterapi agenter gynnar T cellmigration i tumörer.

Mänskliga lungtumörer är oftast starkt infiltrerade i CD8 T-celler som finns företrädesvis i stroma3,4. Genom att följa detta protokoll bör man förvänta sig att visualisera ett stort antal immunostained CD8 T i människans lung tumör skivor. En samtidig märkning med anti-EpCAM och anti-CD90 antikroppar bör tillåta för att avgränsa tumören kobbar och stromal områden. Fibrillar kollagen, rikligt i tumör stroma, kan visualiseras utan exogena färgning med hjälp av harmoniska understödjautvecklingen på en två-foton Mikroskop3,4. Observera att vissa människors lungtumörer uppvisa ingen tydlig åtskillnad mellan tumör kobbar och stroma. Sådana tumörer ska kasseras samt preparatet presentera stora områden av cell nekros identifieras av icke-specifik bindning av antikroppar och DAPI färgning. Konsekvent med publicerade resultat i människans lung- och äggstockscancer carcinom, bosatt CD8 T-celler är mer koncentrerad i stroma jämfört med tumör holmar4. Ett representativt exempel på CD8 T cell fördelning i förhållande till tumörceller och CD90 visas i figur 2.
Slice analysen möjliggör analys av bosatt T cell motilitet i olika tumör regioner. Användbara kriterier för att jämföra CD8 T cell motilitet i olika regioner har den genomsnittliga hastigheten (sökvägens längd dividerat med den varaktighet som ingick i urvalet) och deplacement längden (vektorn mellan början och slutet av ett spår). Trots knappa i tumör holmar, migrerar CD8 T-celler mer aktivt i kupén jämfört stroma (figur 3). I genomsnitt bör den genomsnittliga hastigheten av enskilda CD8 T-celler nära 4 µm/min i tumör stroma med hög intra- och Inter tumör variabilitet4. I tumör stroma, är motiliteten av bosatt T-celler starkt influerad av täthet och läggning av extracellulärmatrix fibrer3,4. Ett lyckat experiment kommer att resultera i mindre närvarande i tät matris områden jämfört med lös matrix regioner, konsekvent med publicerade resultat3,4T-celler.
Observera att vissa människors lungtumörer uppvisar en mycket hög nivå av autofluorescens utgör hinder för avbildning av bosatt T-celler. Sådan funktion observeras snabbt i början av bildsession. Autofluorescent tumörer ska kasseras. Ett representativt exempel på bosatt CD8 T-celler i en autofluorescent tumör visas i figur 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
Figur 1: fotografier av perfusion systemet. (A) phenol red-gratis RPMI lösningen är berikad i 5% C02, 95% O2. (B) lösningen är sedan perfusion av en Peristaltisk pump. (C) RPMI lösningen går in kultur skålen via inloppet. Vid utloppet, är lösningen aspirerade av pumpen från kammaren i en avfallsbehållare. Notera att aspiration spetsen ligger på en nivå att bestämma lösning höjd. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
Figur 2: fördelning av bosatta CD8 T-celler i en human lung tumör. Representativ bild av en mänsklig lung tumör skiva färgas för CD8 (grön), EpCAM (blå) och CD90 (röd). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
Figur 3: motilitet bosatt CD8 t-celler i en human lung tumör. Banor av enskilda bosatt CD8 T-celler i stromaceller (röd) och tumör cell (blå) regioner för en human lung carcinom slice. Segmentet var målat med de angivna antikropparna och avbildas i 20 min med en confocal Mikroskop. Fibrillary kollagen upptäcktes i slutet med harmoniska understödjautvecklingen (SHG) på ett två-foton Mikroskop. Spår är färgkodade enligt CD8 T cell deplacement längd. Denna bild har ändrats från 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
Figur 4: representativ bild av en autofluorescent human lung tumör. Tumör segmentet var färgas för CD8 (grön) och EpCAM (blå). SHG signalen är i rött. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Det här protokollet beskriver en metod för att bilden bosatt tumör-infiltrera CD8 T-celler märkta med fluorescently kopplat antikroppar inom human lung tumör skivor. Denna teknik tillåter realtid analyser av CD8 T cellmigration med konfokalmikroskopi.

Ex Vivo Avbildning av bosatta CD8 T-lymfocyter i Human Lung tumör skivor med konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklid-fluorescens Reporter gen Imaging för att spåra tumör Progression i gnagare tumör modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus för tumör-riktade immunmodulering: Design och utvärdering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8+ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Upptäckt av lungtumörprogression hos möss av ultraljudsavbildning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Mätning i realtid läkemedelsrespons i organotypiska tumörvävnad skivor

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analys av lungmetastasering efter lateral svansveninjektion av tumörceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...