Name: systemic delivery of microrna using recombinant adeno-associated virus serotype 9 to treat neuromuscular diseases in rodents
Uploaded: 2018-08-10T12:30:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents at JoVE.com

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح. ونحن نشكر "مختبرات سيجناجين" (روكفيلي، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية) لإنتاج فيروس AAV9. وأيد هذا البحث "برنامج بحوث داخلية" NINDS، المعاهد الوطنية للصحة. وأيد الأموال من شعبة البحوث الداخلية من NICHD فيليب ر. لي. وأيد رينالدي كارلو على زمالة من "الرابطة الفرنسية" مكافحة ليه ميوباثيس (فؤاد).

نفذت جميع الإجراءات وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الطبعة الثامنة، الصحافة الأكاديميات الوطنية، نقح 2011)، وقد وافقت عليه "اللجنة العناية بالحيوان نيندس".
1-AAV9-ميرنا تصميم الاستراتيجية وميرنا التحديد
<ol><li>استخدام ميروالك قاعدة البيانات التنبؤية لتحديد ميرناس المرشحة التي تتفاعل مع مرناً 3 ' المنطقة UTR الجينات المستهدفة. 15 ملاحظة: تقييد طول البذور الحد الأدنى من تسلسل ميرنا النيوكليوتيدات 7 على الأقل. حدد برامج التنبؤ ميرنا الثابتة الأخرى (ميراندا، ميردب، تارجيتسكان) للتحليل المقارن. استناداً إلى معايير الاختيار هذه، هنا، مير-185، مير-298، مير-873، ومير-877 اختيرت لمزيد من التقييم.</li>
	<li>استرداد تسلسل ميرنا مختارة من ميرباسي (http://www.mirbase.org/).</li>
	<li>استنساخ pri-مير (60-70 nts) ولها تي إس 250-300 المرافقة تسلسل الجينوم على كلا الجانبين، أو تسلسل صورية، متجهة إلى إف المناسبة رابطة الدول المستقلة. ملاحظة: تسلسل ترافقه مطلوب للتعبير الصحيح pri-مير وتجهيز microRNA ناضجة. حدد متجه رابطة الدول المستقلة راف المزدوج-المروج مع كاسيت تعبير يتكون على سبيل المثال من مروج 1 عامل ألفا (EIF1α) استطالة بشرية متبوعاً ميرنا المحدد أو تسلسل صورية، والمروج الفيروس المضخم للخلايا البشرية (CMV) متبوعاً بترميز كدنا علامة نيون التجارة والنقل. واختير المروج EIFα لأنه يضمن التعبير مستقرة ومتجانسة، مع الحد الأدنى من المخاطر لإسكات. يمكن استخدام أنسجة محددة أو الشرطي المروجين، اعتماداً على تطبيقات محددة.</li>
	<li>إعداد وتنقية تيتراتي إف، البروتوكولات المنشورة التالية. 16 ملاحظة: هنا، استنساخ للحزب الثوري المؤسسي-مير إلى إف النواقل وإنتاج الفيروسية أجريت بإحدى الشركات مصنعة خارجية.</li>
</ol>2-حقن الوريد الذيل من بلازميد إف-ميرنا
ملاحظة: هذه الخطوة احتياجات التكيف وفقا للجينات المستهدفة والعمر والوزن للفئران. استخدام المبادئ التوجيهية المؤسسية ورعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إياكوك) لتحديد مدى الجرعة ووحدة التخزين وأفضل طريق للإدارة على أساس العمر والوزن من الفئران. بروتينات فلورية خضراء fluorescence إشارة وميرنا التعبير في الأنسجة المستهدفة المتوقع أن مستويات الذروة ابتداء من 2 أسابيع بعد الحقن. البروتوكول التالي يشير إلى الفئران الذكور في سن البلوغ المبكر. ينبغي التعامل معها إف اقية بموجب المبادئ التوجيهية 1 مستوى السلامة الأحيائية.
<ol><li>تقسيم الأسهم بلازميد إف-ميرنا في 100-200 ميليلتر مختبرين المحتوية على حمل فيروسي من 1010-1011 الجينوم الفيروسي كل مل (vg/mL) باستخدام الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS). ينبغي استخدام مختبر واقية معدات الحماية الشخصية للتعامل مع الحل إف. ملاحظة: حالما يتم إذابة قاسمة يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. ويمكن تخزين الأسهم الفيروسية في الثلاجة-80 درجة مئوية.</li>
	<li>كبح جماح الماوس في ريسترينيرس المتاحة تجارياً مثل أنبوب البلاستيك أو مدبب الفيلم البلاستيك للحجم المناسب.</li>
	<li>تنظيف سطح الذيل مع مناديل الكحول 70%.</li>
	<li>عقد وسادة دافئة (28-30 درجة مئوية) تحت الذيل لزيادة توسع الأوعية عن 30 س. بدلاً من ذلك، الحارة الحيوانات باستخدام مصباح حرارة الحمراء (على مسافة من 2-3 أقدام) أو عن طريق غمس الذيل في المياه الدافئة.</li>
	<li>
بدءاً من الجزء الأعلى من الذيل، إدراج الإبرة (27-30 ز) محملة بقاسمه الفيروسية، مجسم مشطوف الحواف، 15° من الذيل، في هذا السياق. قبل الحقن، ضمان الإبرة يتم إدراجها بشكل صحيح.
	<ol>
<li>إذا هو شعر المقاومة خلال الحقن، أو يظهر تورم تحت الجلد، وقف هذا الإجراء. إزالة الإبرة وإعادة إدراج إبرة الحقن السابقة أعلاه. ملاحظة: بدلاً من ذلك، وهذا يمكن أن تحققه بلطف يسفط الإبرة ومراقبة الدم. يمكن طي تطلع الثابت على المنوال الذيل. إذا بلانتشيس الوريد أثناء الحقن، يتم إدراج الإبرة بشكل صحيح.</li>
	</ol>
</li>
	<li>بعد إتمام الحقن، انتظر بضع ثوان قبل رفع الإبرة.</li>
	<li>مراقبة موقع الحقن للنزيف. تطبيق ضغط معتدل باستخدام اصبعين للموقع حتى يتوقف النزف.</li>
	<li>إرجاع الحيوان إلى قفصة.</li>
</ol>3-السلوكية فحوصات
ملاحظة: جميع التجارب التي أجريت عمياء طرف ثالث مع إخفاء علاجات بقارورة ترميز فريد. كانت التجارب المعشاه ذات ترتيب علاجات. عند إجراء الاختبارات المبينة أدناه، ينبغي أن تتم مراقبة الظروف التجريبية (نوع الغرفة) والوقت من اليوم للحد من التباين. وينبغي إجراء هذا الاختبار على الفئران التي مضى عليها أكثر من أربعة أسابيع للتوصل إلى نتائج يمكن الاعتماد عليها. وخضع الماوس التقييم السلوكي مرة واحدة قبل الحقن الفيروسية في 5 أسابيع عمر للحصول على خط الأساس للأداء العادي. وقيمت الفئران بعد الحقن الفيروسية، مرة كل أسبوع ابتداء من 48 ساعة بعد الحقن، يصل إلى 40 أسبوعا من العمر.
<ol><li>جعل الماوس حقن إف إلى غرفة مظلمة هادئة، وأن يخلو من الضوضاء أو غيرها الاضطرابات على الأقل 30 دقيقة قبل بدء الاختبارات. لا تخل هذه الحيوانات خلال هذه الفترة للتأقلم.</li>
	<li>التأقلم الماوس إلى غرفة جديدة لمدة 30 دقيقة ثم قم بتشغيل الاختبارات السلوكية التالية (الخطوات 3.3 و 3.4). تبقى فجوة 10 دقيقة بين كل التحليل السلوكي.</li>
	<li>
اختبار أسلاك معلقة ملاحظة: هذا الاختبار ترصد قوة العضلات والخلل في السيارات.<ol>
<li>استخدم ورقة حشو بمثابة وسادة. التقاط الماوس بذيله ووضعه في مركز رف شبكة الأسلاك. رفع الرف 15-20 بوصة فوق السطح وبطء عكس الشاشة للسماح للحيوان لضبط قبضتها على الشاشة.</li>
		<li>مرة واحدة هو مقلوب تماما على الرف، بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت، وسجل الوقت سقوط. ملاحظة: سيتم إنهاء الفئران مع أطرافه الأربعة على شبكة. إذا تم تعيين الأسلاك منخفضة جداً قد لا إنهاء الفئران على. إذا كانت تسقط الفئران الشبكة قبل 60 ثانية، وضعها مرة أخرى على الشبكة وإعادة تعيين جهاز ضبط الوقت، وكرر هذا الإجراء ما يصل إلى اثنين من يحاول أكثر. سجل أداء أفضل.</li>
		<li>عند تحديد الوقت 60 s هو الذي تم التوصل إليه، والعودة ظهر الحيوان إلى القفص.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
فحص القدم الطباعة ملاحظة: ينبغي أن تكون ورقة ماصة على مدرج ضيق حوالي 70 سم طويلة وواسعة مع الجدران 5 سم ارتفاع 5 سم.<ol>
<li>أمسك الماوس برفق من جهة وتطبيق الحبر الأحمر على آثار أقدام الجبهة والحبر الأزرق لآثار أقدام هند مع فرشاة.</li>
		<li>ضع ورقة ماصة على أرضية المدرج الضيقة.</li>
		<li>تسمح الماوس للمشي أو دهس ورقة ماصة في خط مستقيم في المدرج من واحدة من نهاية إلى أخرى.</li>
		<li>كرر العملية اثنين مرات أكثر مع الماوس استخدام ورقة ماصة طازجة.</li>
		<li>قياس المسافة بين خطوتين متتاليتين في الحركة إلى الأمام. لا تشمل أولاً وأخيراً أقدام قليلة حيث الحيوان مجرد البدء والانتهاء تشغيل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-القتل الرحيم والحصاد الأنسجة
<ol><li>استخدام دائرة القتل رحيم أو جرة بيل. في حالة استخدام جرة بيل، قم بتنفيذ الإجراء تحت غطاء دخان.</li>
	<li>نقع القطن مع isoflurane ووضعه في جرة بيل. استخدام فاصل مادية للحفاظ على هذا الحيوان من الاتصال المادي مع مواد التخدير. ضع الحيوان في الجرة فورا بعد هذه الخطوة. ملاحظة: لا ينبغي جرة بيل مشحونة مسبقاً مع إيسوفلوراني تجنب احتمال نقص تاكسج الدم في الحيوانات.</li>
	<li>تواصل التعرض isoflurane حتى 30 ثانية بعد توقف عن التنفس.</li>
	<li>فورا بعد إزالة الماوس من الجرة، euthanize بخلع عنق الرحم. ملاحظة: هذه الخطوة ينبغي أن يتم بأسرع ما يمكن لتجنب تدهور الأنسجة.</li>
	<li>
الحصاد الحبل الشوكي أولاً، ثم الهيكل العظمى والعضلات في الفخذ.
	<ol>
<li>لحصاد الحبل الشوكي وفضح المؤخر الماوس وإصلاح أطرافه الأربعة على الجانب على لوحة تشريح.</li>
		<li>أغسل موقع تشريح مع الإيثانول 70%.</li>
		<li>أداء التفكك عنق الرحم باستخدام مقص حاد.</li>
		<li>إجراء شق في الجلد في خط الوسط. إزالة بلت بقطع أو تمزق حذراً من الجلد في الطائرة عرضية، متبوعاً بسحب قذف لأعلى وعلى رأسه. إزالة الرأس بالقطع مع المقص تحت ريش الكتف وفي منطقة C1-2 في العمود (وجدت المتاخمة لقاعدة الجمجمة).<ol>
<li>قطع عضلات جدار البطن في الجانب البطني ومواصلة جانبياً، اتجاه واحد في كل مرة، حتى يتم التوصل إلى العمود الفقري.</li>
		</ol>
</li>
		<li>استخدام فقرات إزالة مقص حاد بدءاً من الحبل الشوكي عنق الرحم. إزالة الأجزاء الجانبية للفقرات بالقطع عبر الأقواس الفقرية في كلا الجانبين.</li>
		<li>بعد إزالة فقرات كاملة الإفراج عن الحبل الشوكي.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
الأداة الإضافية تجميد الأنسجة المقطوع في 2-ميثيلبوتاني مبردة مسبقاً باستخدام الأسلوب التالي:
	<ol>
<li>نصف ملء وعاء فولاذ المقاوم للصدأ مع 2-ميثيلبوتاني، وتغرق في الربع السفلي من الوعاء في حاوية مليئة بالنيتروجين السائل.</li>
		<li>قبل chill 2-ميثيلبوتاني في النتروجين السائل لمدة 1-2 دقيقة.</li>
		<li>مكان في الهيكل العظمى والعضلات بالملقط في 2-ميثيلبوتاني حتى يتحول اللون الأبيض. نقل على الفور الأنسجة الجليد الجاف وثم تخزينها في-80 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ل immunostaining الحبل الشوكي، تضمين الأنسجة في كتل البارافين في درجة حرارة الغرفة قبل الأداة التجميد كما هو موضح. 17
</li>
	<li>لتحليل الكيمياء الحيوية، والتقدير الكمي ميرنا،1 مكان الأنسجة المقطوع في كريوفيال وتجميد في نيتروجين سائل. تخزين العينات في-80 درجة مئوية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+therapeutics.">miRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104-1110 (2011).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nat Rev Genet. 12, 861-874 (2011).</li><li>Pickering, B. M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+implications+of+structured+5'+untranslated+regions+on+translation+and+disease.">The implications of structured 5' untranslated regions on translation and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 39-47 (2005).</li><li>Bilen, J., Liu, N., Burnett, B. G., Pittman, R. N., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+pathways+modulate+polyglutamine-induced+neurodegeneration.">MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration.</a> Mol Cell. 24, 157-163 (2006).</li><li>Lee, Y., Samaco, R. C., Gatchel, J. R., Thaller, C., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-19,+miR-101+and+miR-130+co-regulate+ATXN1+levels+to+potentially+modulate+SCA1+pathogenesis.">miR-19, miR-101 and miR-130 co-regulate ATXN1 levels to potentially modulate SCA1 pathogenesis.</a> Nat Neurosci. 11, 1137-1139 (2008).</li><li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-34+modulates+ageing+and+neurodegeneration+in+Drosophila.">The microRNA miR-34 modulates ageing and neurodegeneration in Drosophila.</a> Nature. 482, 519-523 (2012).</li><li>Ebner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+skeletal+muscle+targeting+in+drug+discovery.">Strategies for skeletal muscle targeting in drug discovery.</a> Curr Pharm Des. 10, 1327-1336 (2015).</li><li>Giorgetti, E., Lieberman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+androgen+receptor-mediated+neuromuscular+disease.">Polyglutamine androgen receptor-mediated neuromuscular disease.</a> Cell Mol Life Sci. 73, 3991-3999 (2016).</li><li>Grunseich, C., Rinaldi, C., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+and+bulbar+muscular+atrophy:+pathogenesis+and+clinical+management.">Spinal and bulbar muscular atrophy: pathogenesis and clinical management.</a> Oral Dis. 20, 6-9 (2014).</li><li>La Spada, A. R., Wilson, E. M., Lubahn, D. B., Harding, A. E., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+gene+mutations+in+X-linked+spinal+and+bulbar+muscular+atrophy.">Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy.</a> Nature. 352, 77-79 (1991).</li><li>Katsuno, M., Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., Sobue, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testosterone+reduction+prevents+phenotypic+expression+in+a+transgenic+mouse+model+of+spinal+and+bulbar+muscular+atrophy.">Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy.</a> Neuron. 35, 843-854 (2002).</li><li>Boissonneault, V., Plante, I., Rivest, S., Provost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-298+and+microRNA-328+regulate+expression+of+mouse+beta-amyloid+precursor+protein-converting+enzyme+1.">MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1.</a> J Biol Chem. 284, 1971-1981 (2009).</li><li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+central+nervous+system+gene+transfer+and+silencing+after+systemic+delivery+of+novel+AAV-AS+vector.">Widespread central nervous system gene transfer and silencing after systemic delivery of novel AAV-AS vector.</a> Mol Ther. 24, 726-735 (2016).</li><li>Pourshafie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-298+counteracts+mutant+androgen+receptor+toxicity+in+spinal+and+bulbar+muscular+atrophy.">MiR-298 counteracts mutant androgen receptor toxicity in spinal and bulbar muscular atrophy.</a> Mol Ther. 24, 937-945 (2016).</li><li>Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRWalk--database:+prediction+of+possible+miRNA+binding+sites+by+&amp;#34;walking&amp;#34;+the+genes+of+three+genomes.">miRWalk--database: prediction of possible miRNA binding sites by &amp;#34;walking&amp;#34; the genes of three genomes.</a> J Biomed Inform. 44, 839-847 (2011).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Stuard, D. A., Oorschot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding,+sectioning,+immunocytochemical+and+stereological+methods+that+optimise+research+on+the+lesioned+adult+rat+spinal+cord.">Embedding, sectioning, immunocytochemical and stereological methods that optimise research on the lesioned adult rat spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 61, 5-14 (1995).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-25+alleviates+polyQ-mediated+cytotoxicity+by+silencing+ATXN3.">miR-25 alleviates polyQ-mediated cytotoxicity by silencing ATXN3.</a> FEBS Lett. 588, 4791-4798 (2014).</li><li>Kuhn, D. E., Martin, M. M., Feldman, D. S., Terry, A. V., Nuovo, G. J., Elton, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+miRNA+targets.">Experimental validation of miRNA targets.</a> Methods. 44, 47-54 (2008).</li><li>Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+viral+and+nonviral+delivery+systems+for+microRNA.">An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA.</a> Int J Pharm Investig. 5, 179-181 (2015).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Front Mol Neurosci. 7, 50 (2014).</li><li>Foust, K. D., Nurre, E., Montgomery, C. L., Hernandez, A., Chan, C. M., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li><li>Wang, Z., Ma, H. -. I., Li, J., Sun, L., Zhang, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Therapy. 10, 2105-2111 (2003).</li><li>Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neonatal+blood-brain+barrier+is+functionally+effective,+and+immaturity+does+not+explain+differential+targeting+of+AAV9.">The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9.</a> Nat Biotechnol. 27, 804-805 (2009).</li><li>Boudreau, R. L., Spengler, R. M., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+therapeutic+siRNAs:+minimizing+off-targeting+potential+to+improve+the+safety+of+RNAi+therapy+for+Huntington&#8217;s+disease.">Rational design of therapeutic siRNAs: minimizing off-targeting potential to improve the safety of RNAi therapy for Huntington&#8217;s disease.</a> Mol Ther. 19, 2169-2177 (2011).</li><li>Duque, S., Joussemet, B., Riviere, C., Marais, T., Dubreil, L., Douar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons.">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).</li><li>Lowenstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+rubicon.">Crossing the rubicon.</a> Nat Biotechnol. 27, 42-44 (2009).</li><li>Sibley, C. R., Seow, Y., Curtis, H., Weinberg, M. S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Parkinson's+disease-associated+genes+with+artificial+mirtron+mimics+of+miR-1224.">Silencing of Parkinson's disease-associated genes with artificial mirtron mimics of miR-1224.</a> Nucleic Acids Res. 40, 9863-9875 (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

هنا نظهر منهجية كفاءة عالية والوصول تحديد وتقديم عن طريق حقن ذيل ميرنا استخدام rAAV9 كناقل فيروسي لاستهداف الهيكل العظمى والعضلات والخلايا العصبية الحركية في الفئران. 14 مقارنة بغيرها من استراتيجيات [رني]، ميرناس أقل سمية وأقل مكسبه. 18 بالإضافة إلى ذلك، صغر حجمها يجعلها ملائمة تماما لقدرة التعبئة المحدودة النواقل الفيروسية. 2 الخوارزميات الحسابية وأدوات التنبؤ يسمح بتحديد الأهداف المفترضة ميرنا-مرناً. وبمجرد تحديد، يجب التحقق من آثار ميرنا على التعبير الجيني المستهدف. نهج مشترك هو أوفيريكسبريس ميرنا معين في المختبر والكشف عن مستويات التعبير البروتين المستهدفة باستخدام تحليل الغربية. 14 , 19
واستخدمت مختلف الدراسات استراتيجيات فيروسية وغير فيروسية لإيصال ميرناس. 13 هنا استخدمنا الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) كأداة لتوصيل جينات. مقارنة بسائر النواقل الفيروسية، يتسبب إف الاستمناع منخفضة، يتيح نقل الجينات الطويلة الأجل، وطائفة واسعة من انتحاء في تقسيم وعدم تقسيم الخلايا. 18 يمكن التحايل طريقة التسليم هذه على أيضا الحاجة إلى تعديل المواد الكيميائية التي قد تؤثر على الأداء الوظيفي وخصوصية من جزيء الحمض النووي الريبي. وهناك عدة اللقاح من إف، التي تتحدد أساسا بتكوين بروتينات قفيصه. هذه اللقاح تختلف في انتحاء بهم وترانسدوسي أنواع مختلفة من الخلايا. من الضروري تحديد النمط المصلي المسيطر الصحيح عند النظر في النسيج المستهدف. نحن نخبة من rAAV9، بسبب كفاءتها توصيل عالية في الجهاز العصبي المركزي والعضلات الهيكلية بعد الإدارة الطرفية19،20. هذا النهج قد أظهرت كفاءة توصيل أكبر في الحيوانات الأطفال حديثي الولادة مقارنة بالكبار الحيوانات، احتمالاً بسبب الاختلافات في تكوين المصفوفة خارج الخلية، ونسبة الخلايا العصبية لإطلاق ونضج الدماغ حاجز الدم. 21 , 22
خطوة هامة في هذا البروتوكول هو تصميم ناقلات التعبير. مقارنة مع ناقلات بيسيسترونيك، والتي يعوقها انخفاض التعبير عن الجين الثاني مقارنة مع الجين الأول بجوار المروج، ناقل المروج مزدوج يسمح تكوين التعاقب الغلة التعبير ارتفاع كل من ميرنا واجفب، وهكذا يسمح التعريب لميرنا في الأنسجة الماوس من الفلورة.
الحقن الوريدي من AAV9 أدى إلى كفاءة عالية وتوصيل متجانسة في الأنسجة المستهدفة، والهيكل العظمى والعضلات والخلايا العصبية الحركية. ويسمح هذا الطريق من حقن الجرعة المعطاة للتوصل إلى تعميم الجهازية وعبور حاجز الدم في الدماغ، وهام للعلاجات التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي. وعلاوة على ذلك، وطريقة غير الغازية للتسليم للجهاز العصبي المركزي. زيادة التعبير مير-298 في الحبل الشوكي والعضلات بعد 2-4 أسابيع مع حقنه واحدة هامشية في 5 أسابيع عمر. عند استخدام ناقلات إف الجينوم واحد-الذين تقطعت بهم السبل، توليف حيثياته حبلا الحمض النووي الثاني قد الحساب لتوصيل المتأخر. 23
وكانت مستويات البشرية مير-298 غير قابل للكشف في الفئران المعالجة 20 أسبوعا بعد إدارة واحدة، مما يوحي بأن حقنات متعددة للأمراض المزمنة، وقد يكون مطلوباً للوصول إلى فائدة علاجية. ومع ذلك، يمكن الحد تدهور ميرنا على مر الزمن عندما يتطلب الأمر وجود إدارة متكررة مدى الحياة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تشكل مناعة التكيفية لناقلات إف حاجزاً آخر إلى تسليم جينات ناجحة. 24 وبالتالي توليد نواقل إف تصبح خاملة مناعي أمر حاسم للإدارة المتكررة وتحقيق الآثار الطويلة الأجل مع نظام التسليم هذا يبشر بالخير. 25
حد من الاستخدام ميرنا كاستراتيجية علاجية من خطر الآثار خارج الهدف. ميرناس قد تتفاعل من خلال الأقران قاعدة إينكومبليمينتاري مع سائر النصوص الجينات، التي تشكل خطرا سلامة مع هذا النهج. تحسين تصميم تسلسل [رني]، بما في ذلك استخدام ميرناس غير مقبول، مثل ميرترونس، الذي تجاوز المجمع المعالج الصغير ودراسات مستفيضة من السلامة وقابلية التحمل الطويلة الأجل الحاسمة قبل ترجمة هذه الاستراتيجية إلى مكان أمن و العلاج الفعال. 26 , 27 , 28
الأسلوب الموصوفة هنا وضعت أصلاً لميرنا أوفيريكسبريشن، بل أنها يمكن أن تستخدم أيضا لميرنا تثبيط العلاج باستخدام أنتاجوميرس.

ميرناس هي غير الترميز الكشف، 21-23 النيوكليوتيدات في الطول، والتي تلعب دوراً هاما في تنظيم التعبير الجيني والسيطرة على مختلف مسارات الخلوي والتمثيل الغذائي. 1 يخضع التعبير الجيني أساسا الذي يحفز الجين بوستترانسكريبشونال تدهور إسكات أو مرناً. 2 ميرناس متكاملان عادة إلى 3 'غير مترجمة المنطقة (UTR) لترميز الجينات، على الرغم من أن الربط إلى 5' UTR وترميز المناطق المستهدفة أيضا قد وصف مرناً. 3
كما يوسع الفهم الحالي لدور ميرنا في الآلية المرضية للأمراض التي تصيب الإنسان، يزداد التشكيل الدوائية ميرناس الفردية أو الأسر ميرنا خياراً علاجية. بالمقارنة مع غيرها من الاستراتيجيات تثبيط الحمض النووي الريبي، ميرناس لها العديد من المزايا: ميرناس هي أقل سمية وأقل مكسبه ويمكن أن يتم تسليم إلى الخلايا بسهولة بسبب صغر حجمها. 4 , 5 , 6 ميرناس وعادة ما يكون العديد من الأهداف داخل الشبكات الخلوية، وللآثار المحتملة خارج الهدف وشواغل السلامة التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار، إلى جانب التسليم الفعال للأنسجة المستهدفة.
يتم الحصول على الأمراض العصبية العضلية أو الموروثة من الظروف التي تؤثر على العضلات والخلايا العصبية الحركية. استهداف الأدوية للهيكل العظمى والعضلات هو مجالاً ناشئاً من البحوث، حيث يتمثل التحدي الرئيسي لتحقيق التوزيع على نطاق واسع داخل الإطار العلاجي. 7 الخلايا العصبية الحركية أكثر صعوبة لاستهداف، أساسا لأنه يمنع وصول المخدرات بحاجز الدم في الدماغ.
واستخدمت نماذج الثقافة والماوس الخلية من ضمور العضلات الشوكي والصلبيه (سبما) في هذه الدراسة. سبما من أمراض العصبية العضلية الناجمة عن مكسب سامة إليه وظيفة، التي تتأثر العضلات والخلايا العصبية الحركية. 8 , 9 سبما (المرض كينيدي؛ OMIM #313200) هو الأمراض المرتبطة بالعاشر، تتميز بضعف العضلات وضمور، الناجمة عن توسيع المساعدة النقدية تكرار في الجينات AR، الذي يشفر المسالك polyglutamine موسعة في البروتين ع . 10 لا يوجد علاج المرض--تعديل متوفر حاليا لهذا الاضطراب. ويجمل الطراز الماوس المعدلة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسة ملامح هذا المرض، بما في ذلك خصوصية بين الجنسين، وعلم الأمراض العصبية الحركية، وضمور العضلات تدريجيا. 11
في هذه الدراسة، وتركيز جهودنا على تحديد ميرنا التعبير دوونريجولاتيس مباشرة من التحوير ع متحولة وعلى تصميم طريقة آمنة وفعالة لإيصال ميرنا إلى الحبل الشوكي والعضلات الهيكلية لنموذجنا الماوس المرض.
هنا حددنا ميرنا أونتشاراكتيريزيد نسبيا، ميرنا-298 (رقم الانضمام MIMAT0004901)،12 مباشرة الحد من التعبير ع المسخ في نماذج سبما. من أجل تحقيق تسليم مير-298 إلى الأنسجة المستهدفة، استخدمنا استراتيجية فيروسية، مع النمط المصلي المسيطر المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة 9 (rAAV9). rAAV9 قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغ، والتوسط للتعبير الجيني طويلة الأجل في عدم تقسيم الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية. 13 إدارة منهجية واحدة من AAV9-مير-298 أسفرت عن التعبير المطرد لميرنا، توصيل كفاءة العضلات والخلايا العصبية الحركية، والتنظيم لأسفل للتعبير ع، وتحسين النمط الظاهري المرض في الفئران سبما. 14 يمكن أن تستخدم هذه المنهجية لتوفير ميرنا أو أنتاجوميرس أوفيريكسبريشن في فيفو.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Purification of miRNA and total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>snoRNA202 Primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1232</td>
			<td>Taqman miRNA control assay in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miR-298 Primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2190</td>
			<td>Taqman miRNA-298 assay in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red ink pad</td>
			<td>Dovecraft Essentials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue ink pad</td>
			<td>Dovecraft Essentials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-GFP vector</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100840</td>
			<td>Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmu-miR-298-5p</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MC12525</td>
			<td>mirVana miRNA mimic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP</td>
			<td>Vector Biosystems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systemic delivery of microrna using recombinant adeno-associated virus serotype 9 to treat neuromuscular diseases in rodents

تدخل الجيش الملكي النيبالي عبر المسار ميرنا الذاتية ينظم التعبير الجيني عن طريق التحكم في تخليق البروتين من خلال إسكات الجينات بوستترانسكريبشونال. في السنوات الأخيرة، أظهرت تنظيم الجينات ميرنا بوساطة محتملة لعلاج الاضطرابات العصبية الناجمة عن مكسب سامة إليه وظيفة. ومع ذلك، محدودة التسليم الفعال للأنسجة المستهدفة تطبيقه. هنا استخدمنا نموذج الفأر وراثيا لضمور العضلات الشوكي والصلبيه (سبما)، أمراض العصبية العضلية الناجمة عن التوسع polyglutamine في مستقبلات الاندروجين (ع)، لاختبار إسكات الجينات التي حديثا ميرنا ع-الأهداف المحددة، مير-298. ونحن أوفيريكسبريسيد مير-298 استخدام ناقل النمط المصلي المسيطر 9 المؤتلف فيروسات المرتبطة بالغدة (راف) لتسهيل توصيل غير تقسيم الخلايا. حقنه الوريد ذيل واحد في الفئران سبما المستحث overexpression مستمرة وعلى نطاق واسع من مير-298 في الهيكل العظمى والعضلات والخلايا العصبية الحركية وأدت إلى تحسين النمط الظاهري العضلية في الفئران.

تم حقن الفيروسي من 1011 vg من AAV9-مير-298 من خلال حقن الوريد ذيل واحد في الأسبوع 5 القديمة سبما الفئران. هذه الفئران إجراء التحوير ع البشرية مع المسالك polyglutamine الموسعة انخفاضا غير عادي في ع (AR97Q)، ووضع علامات على الأمراض العصبية العضلية قبل 10 أسابيع عمر (وفقدان الوزن والظهر التحدبي وضمور العضلات). 11 القطني من النخاع الشوكي والعضلات الفخذ كانت تحصد في 2، 4، 8 و 12 بعد أسابيع من الإدارة للقياس الكمي ميرنا والمقايسة البيوكيميائية وإيمونوهيستوتشيميستري (الشكل 1). إدارة العلاج والتحاليل اللاحقة كانت تؤديها المحققين أعمى.
وأظهر تحليل qRT PCR مير-298 التعبير في الهيكل العظمى والعضلات والنخاع الشوكي أسبوعين وأربعة أسابيع بعد العلاج على التوالي، مع ذروة مستويات التعبير في 8 أسابيع في العضلات الهيكلية و 12 أسبوعا في الحبل الشوكي بعد الحقن (الشكل 2 ). استخدام مجهر (أكسيوفيرت 100 متر)، إشارة الفلورية الخضراء اكتشفت في أنسجة العضلات والخلايا العصبية الحركية العمود الفقري قبل التعريب المشارك للتجارة والنقل و acetyltransferase الكولين ماركر الحركية (دردشة) 10 أسابيع بعد العلاج، عندما تبدأ الفئران لإظهار مظاهر المرض (الشكل 2).
استخدام نظام الجرعة نفسها، كانت عشوائية فوج فئران سبما تلقي أما مير-298 أو وهمية في 7 أسابيع عمر عن طريق حقن الوريد الذيل للتحاليل الكيميائية الحيوية وتوصيف وظيفي. حقن تبع الوزن الأسبوعية والتقييم السلوكي إلى 40 أسبوعا من العمر. وأظهر تحليل qRT PCR أن مير-298 العلاج يقلل من مستويات المسخ ع في الأنسجة المتأثرة (الشكل 3)، وزيادة وزن الجسم وتحسين أداء المحرك (الشكل 4) ابتداء من الساعة 10 أسابيع بعد الحقن.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig1.jpg"> رقم 1: التخطيطي لتصميم الدراسة. لزيادة مستويات التعبير مير-298 المجراة، نحن حقن الفئران سبما بلازميد (A) ناقل إف المروج المزدوج يعبر عن التجارة والنقل، وأما مير-298 أو وهمية. تم حقن الفئران (ب) عن طريق حقنه واحدة ذيل عبثا في 7 أسابيع عمر (مرحلة ما قبل عرضاً من أعراض). الحبل الشوكي والعضلات الرباعية جمعت من مجموعة فئران سبما عند نقاط زمنية مختلفة لتحليل توزيع الأنسجة (أخضر). كان تعامل مجموعة فئران سبما والتضحية بها في 16 أسبوعا عمر للتحاليل الكيميائية الحيوية (أحمر). الوزن والسلوكية فحوصات أجريت أسبوعيا يصل إلى 40 أسبوعا من العمر لتوصيف وظيفي (أزرق). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig2.jpg"> رقم 2: AAV9-مير-298 التسليم في الفئران. باستخدام الطريقة الموضحة هنا، تلقت الفئران AAV9-مير-298-التجارة والنقل أو AAV9-موك-التجارة والنقل عن طريق الحقن الوريدي. وجمعت ميرنا مجموع من الحبل الشوكي القطني وعضلة الفخذ في 2,4,8 و 12 أسبوعا بعد الحقن. وأجرى qRT-بكر لتقدير مستوى التعبير عضلة الفخذ مير-298 في (أ) (n = 5) الحبل الشوكي القطني (ب) (n = 5، ف < 0.01). وترد جميع البيانات كوسيلة ± الخطأ القياسي الوسط. توصيل واسع النطاق لناقل إف في الأنسجة التي تحصد في 10 أسابيع بعد العلاج وأكد التعريب من تلطيخ للتجارة والنقل في عضلة الفخذ (ج) (التكبير الأصلي، 10 X. شريط المقياس = 100 ميكرومتر) و (د) الخلايا العصبية الحركية في الحبل الشوكي القطني (التكبير الأصلي، 40 س. شريط المقياس = 10 ميكرون. التجارة والنقل (الأخضر)، DAPI (أزرق) والدردشة (أحمر). تم تعديل الرقم من doi: 10.1038/mt.2016.13. 14 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig3.jpg"> الشكل 3: ميرنا-298 التعبير المفرط دوونريجولاتيس المسخ ع في الحبل الشوكي والعضلات الفخذ في الفئران. وأجرى qRT-بكر لتقدير مستويات التعبير مرناً ع في الحبل الشوكي القطني (A) وعضلة الفخذ (ب) تعامل مع AAV9-مير-298-التجارة والنقل أو AAV9-موك-التجارة والنقل. تم تطبيع مستويات نسخة إلى snoRNA202 (n = 5 كل معاملة). * ف < 0.05، * * ف < 0.01. وترد جميع البيانات كوسيلة ± الأخطاء المعيارية. تم تعديل الرقم من doi: 10.1038/mt.2016.13. 14
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig4.jpg"> الشكل 4: مير-298 التعبير المفرط يحسن وظيفة المحرك ويقلل من الوزن. وأجرى التقييم السلوكي مرة واحدة في أسبوع (w)، بين الأسبوع 5 إلى 40. الجسم الوزن (يسار) ومعلقة الأداء سلك (يمين) من الفئران (n = 15 كل مجموعة). وترد جميع البيانات كوسيلة ± الأخطاء المعيارية. تم تعديل الرقم من doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Watch this Scientific Journal Video about Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents at JoVE.com

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

هنا يصف لنا إيصال ميكرورنا باستخدام النمط المصلي المسيطر المؤتلف فيروسات المرتبطة بالغدة 9 في نموذج الفأر الأمراض العصبية العضلية. إدارة واحدة طرفية في الفئران أسفرت overexpression ميرنا المطرد في العضلات والخلايا العصبية الحركية، مما أتاح فرصة لدراسة ميرنا الدالة والعلاجية المحتملة في فيفو.

منهجية تقديم ميكرورنا باستخدام النمط المصلي المسيطر المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة 9 لعلاج الأمراض العصبية العضلية في القوارض

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

الكشف عن التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني من الفئران باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي ير

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

تسلسل ميكرورنا أثر رجعي: الحمض النووي التكميلية المكتبة إعداد بروتوكول باستخدام عينات الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الحمض النووي الريبي

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

استخدام مايديس Ustilago كحصان طروادة "إيصال بروتينات الذرة في الموقع"

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

بروتوكول في المختبر لتقييم مستويات MicroRNA، وظائف، والجينات المستهدفة المرتبطة بها في الخلايا السرطانية

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحليل بدقه وكفاءه الناسخ ميكرورنا في النباتات

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

تسليم مرنا معدلة في نموذج الماوس احتشاء مايدق

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...