Name: systemic delivery of microrna using recombinant adeno-associated virus serotype 9 to treat neuromuscular diseases in rodents
Uploaded: 2018-08-10T12:30:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents at JoVE.com

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt. Vi takker SignaGen laboratorier (Rockvile, MD, USA) for AAV9 virus produktion. Denne forskning blev støttet af murene forskningsprogrammet af NINDS, NIH. Philip R. Lee blev støttet af midler fra Division af murene forskning af NICHD. Carlo Rinaldi blev støttet af et stipendium fra Association Française contre les myopatier (AFM).

Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med de nationale institutter sundhed Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr (8. ed., nationale akademier Press, revideret 2011), og er blevet godkendt af NINDS dyr efterbehandling udvalget.
1. AAV9-miRNA design strategi og miRNA udvalg
<ol><li>Brug miRWalk prædiktive database til at vælge kandidat miRNAs, der interagerer med mRNA 3' UTR region af target-genet. 15 Bemærk: Begrænse minimum frø længde af miRNA sekvens til mindst 7 nukleotider. Vælg andre etablerede miRNA forudsigelse programmer (miRanda, miRDB, Targetscan) for sammenlignende analyse. Baseret på disse udvælgelseskriterier, her, blev miR-185, miR-298, miR-873 og miR-877 udvalgt til yderligere vurdering.</li>
	<li>Hente sekvensen af den valgte miRNA fra miRBase (http://www.mirbase.org/).</li>
	<li>Klon pri-mir (60-70 nts) og dens 250-300 nts flankerende genomisk sekvens på begge sider, eller en mock sekvens, i den relevante AAV cis vektor. Bemærk: De flankerende sekvens er nødvendig for korrekt pri-mir udtryk og modne mikroRNA behandling. Vælg en dual-promotor rAAV cis vektor med en udtryk kassette bestående for eksempel af en menneskelig brudforlængelse faktor-1 alpha (EIF1α) promotor efterfulgt af den valgte miRNA eller mock sekvens, og menneskelige cytomegalovirus (CMV) promotor efterfulgt af cDNA kodning normal god landbrugspraksis fluorescerende tag. EIFα arrangøren blev valgt, fordi det sikrer stabil og ensartet udtryk, med minimal risiko for genhæmning. Væv specifikke eller betinget initiativtagere kan bruges, afhængigt af specifikke programmer.</li>
	<li>Forberede, rense og titreres AAV, følgende publicerede protokoller. 16 Bemærk: Her, kloning af pri-mir i AAV vektor og viral produktion blev udført af en ekstern producent.</li>
</ol>2. hale vene injektion af AAV-miRNA Plasmid
Bemærk: Dette trin kræver justering efter mål-genet og alder og vægt af mus. Brug retningslinjerne for institutionelle og Animal Care og brug udvalg (IACUC) til at bestemme dosis rækkevidde, volumen og bedste administrationsvej baseret på alder og vægt af mus. Normal god landbrugspraksis fluorescens signal og miRNA udtryk niveauer i målvæv forventes at peak begynder 2 uger efter injektionen. Følgende protokol refererer til mandlige mus i den tidlige voksenalder. AAV skal håndteres som en biohazard under retningslinjer for Biosikkerhed niveau 1.
<ol><li>Opdele AAV-miRNA plasmid lager i 100-200 µL delprøver indeholdende en viral belastning af 1010-1011 viral genomer pr. mL (vg/mL) ved hjælp af steril fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Laboratoriet biohazard personlige værnemidler skal bruges til at håndtere AAV løsning. Bemærk: Når en alikvot er optøet det kan opbevares ved 4 ° C i op til to uger. Viral materiel kan være gemt i-80 ° C fryser.</li>
	<li>Dy musen i kommercielt tilgængelig restrainers såsom plast eller koniske plastfolie tube af korrekt størrelse.</li>
	<li>Ren overfladen af halen med 70% alkohol klude.</li>
	<li>Holde en varm pad (28-30 ° C) under halen at øge vasodilation for 30 s. Alternativt, varm dyr ved hjælp af en rød varmelampe (i en afstand af 2-3 fødder) eller ved at dyppe hale i varmt vand.</li>
	<li>
Startende fra den distale del af halen, indsætte nålen (27-30 G) lastet med den virale alikvot, facet, 15° fra halen ind i venen. Før injektion, sikre nålen er indsat korrekt.
	<ol>
<li>Hvis modstand er følte under injektion, eller hævelse vises under huden, stoppe proceduren. Fjern nålen og re-indsætte nålen over tidligere injektionsstedet. Bemærk: Alternativt, dette kan opnås ved forsigtigt sugning nålen og observere blod. Hårde aspiration kan skjule hale vene. Hvis venen blanches under injektion, er nålen indsat korrekt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efter Indsprøjtningen er afsluttet, vent et par sekunder før at hæve nålen.</li>
	<li>Observere injektionsstedet til blødning. Anvend moderat pres ved hjælp af to fingre på webstedet indtil blødningen standser.</li>
	<li>Returnere dyret til sit bur.</li>
</ol>3. adfærdsmæssige Assays
Bemærk: Alle eksperimenter blev udført blindt af en tredjepart med fortielse af behandlinger af unikt farvekodede hætteglas. Rækkefølgen af behandlinger blev randomiseret. Når du udfører de prøvninger, der er beskrevet nedenfor, bør forsøgsbetingelser (type rum) og tid af dagen styres for at reducere variation. Denne test skal udføres på mus ældre end fire uger at opnå pålidelige resultater. Musen undergik adfærdsmæssige vurdering en gang før viral injektion på 5 uger for at opnå baseline af normale ydeevne. Efter viral injektion, var mus vurderes en gang om ugen begynder 48 timer efter injektion, op til 40 ugers alder.
<ol><li>Bringe musen injiceres med AAV til et roligt, mørkt rum, der er fri for støj eller andre forstyrrelser i mindst 30 min før start test. Forstyr ikke dyrene i denne periode af akklimatisering.</li>
	<li>Akklimatisere musen til det nye rum i 30 min og derefter starte de følgende adfærdsmæssige assays (trin 3.3 og 3.4). Holde en afstand på 10 min i mellem hver adfærdsmæssige assay.</li>
	<li>
Hængende wire test Bemærk: Denne test overvåger muskelstyrke og motor dysfunktion.<ol>
<li>Bruge en polstring ark til at fungere som en pude. Afhente musen af halen og placere den på midten af wire gitter rack. Rejse at rack 15-20 inches over overfladen og langsomt vende skærmen for at tillade, at dyr til at justere sit greb på skærmen.</li>
		<li>Når rack er fuldstændig omvendt, start timeren, og registrere den tid til at falde. Bemærk: Mus vil hænge med fire lemmer på et gitter. Hvis wiren er indstillet for lavt kan musene ikke hænge. Hvis mus falde nettet før 60 s, læg dem tilbage på nettet, nulstille timeren, og Gentag denne procedure op til to yderligere prøver. Registrere den bedste ydeevne.</li>
		<li>Når fristen på 60 s er nået, returnerer de dyr tilbage til buret.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mund udskrive assay Bemærk: Den absorberende ark skal være en smal bane ca 70 cm lange og 5 cm bred med 5 cm høje mure.<ol>
<li>Hold musen forsigtigt med én hånd og anvende rødt blæk på forreste ben og blåt blæk til bagpoterne med en børste.</li>
		<li>Placer den absorberende ark på gulvet i en smal bane.</li>
		<li>Tillad musen til at gå eller løbe over en absorberende ark i en lige linje i landingsbanen fra ende til anden.</li>
		<li>Gentag processen to gange mere med musen med en frisk absorberende ark.</li>
		<li>Måle afstanden mellem to på hinanden følgende trin i bevægelse fremad. Ikke omfatte første og sidste par fodspor, hvor dyret netop indlede og afslutte sit løb.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. aktiv dødshjælp og væv høst
<ol><li>Bruge en aktiv dødshjælp kammer eller en glasklokke. Hvis du bruger en glasklokke, udføre proceduren under et stinkskab.</li>
	<li>Soak bomuld med isofluran og placere den i glasklokke. Bruge en fysisk separator for at holde dyret fra fysisk kontakt med anæstesi materiale. Placere dyret i krukken umiddelbart efter dette trin. Bemærk: Glasklokke bør ikke være pre-opladet med isofluran at undgå muligheden for hypoxæmi i dyrene.</li>
	<li>Fortsætte isofluran eksponering indtil 30 s efter vejrtrækningen stopper.</li>
	<li>Umiddelbart efter at fjerne musen fra krukken, aflive af cervikal dislokation. Bemærk: Dette trin bør finde sted så hurtigt som muligt for at undgå forringelse af væv.</li>
	<li>
Høst af spinal ledning først og derefter de quadriceps skeletmuskulatur.
	<ol>
<li>At høste rygmarven, udsætte bagsiden af musen og lave fire arme og ben på siden til en dissektion bestyrelse.</li>
		<li>Vaske stedet af dissektion med 70% ethanol.</li>
		<li>Udføre cervikal dislokation ved hjælp af en skarp saks.</li>
		<li>Gøre et snit i huden i den midterlinie. Fjerne pelt af enten skære eller forsigtig rives af huden i tværplan, efterfulgt af at trække pelt op og over hovedet. Fjerne hovedet ved at skære med saks under skulderbladene og på regionen C1-2 i kolonnen (fundet støder op til bunden af kraniet).<ol>
<li>Skære bugvæggen muskulatur på den ventrale side og fortsætte sideværts, én retning ad gangen, indtil rygsøjlen er nået.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Brug en skarp saks Fjern ryghvirvler startende fra den cervikale rygmarv. Fjerne de laterale dele af ryghvirvler af opskæring på tværs af vertebrale buer på begge sider.</li>
		<li>Efter fjernelse af hele ryghvirvler frigive rygmarven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Snap fryse de høstede væv i pre kølet 2-methylbutane ved hjælp af følgende metode:
	<ol>
<li>Halvdelen fylde en rustfrit stål skål med 2-methylbutane og nedsænkes nederste fjerdedel af skålen i en container fyldt med flydende kvælstof.</li>
		<li>Pre chill 2-methylbutane i flydende nitrogen for 1-2 min.</li>
		<li>Placer den skeletmuskulatur med pincet i 2-methylbutane, indtil det bliver hvidt. Straks overføre væv for at tøris og derefter gemme det ved-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rygmarven immunfarvning, integrere vævet i paraffinblokke ved stuetemperatur før snap frysning som beskrevet. 17
</li>
	<li>Til biokemiske analyser og miRNA kvantificering,1 placere den høstede væv i en cryovial og fryse i flydende kvælstof. Opbevare prøver ved-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+therapeutics.">miRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104-1110 (2011).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nat Rev Genet. 12, 861-874 (2011).</li><li>Pickering, B. M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+implications+of+structured+5'+untranslated+regions+on+translation+and+disease.">The implications of structured 5' untranslated regions on translation and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 39-47 (2005).</li><li>Bilen, J., Liu, N., Burnett, B. G., Pittman, R. N., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+pathways+modulate+polyglutamine-induced+neurodegeneration.">MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration.</a> Mol Cell. 24, 157-163 (2006).</li><li>Lee, Y., Samaco, R. C., Gatchel, J. R., Thaller, C., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-19,+miR-101+and+miR-130+co-regulate+ATXN1+levels+to+potentially+modulate+SCA1+pathogenesis.">miR-19, miR-101 and miR-130 co-regulate ATXN1 levels to potentially modulate SCA1 pathogenesis.</a> Nat Neurosci. 11, 1137-1139 (2008).</li><li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-34+modulates+ageing+and+neurodegeneration+in+Drosophila.">The microRNA miR-34 modulates ageing and neurodegeneration in Drosophila.</a> Nature. 482, 519-523 (2012).</li><li>Ebner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+skeletal+muscle+targeting+in+drug+discovery.">Strategies for skeletal muscle targeting in drug discovery.</a> Curr Pharm Des. 10, 1327-1336 (2015).</li><li>Giorgetti, E., Lieberman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+androgen+receptor-mediated+neuromuscular+disease.">Polyglutamine androgen receptor-mediated neuromuscular disease.</a> Cell Mol Life Sci. 73, 3991-3999 (2016).</li><li>Grunseich, C., Rinaldi, C., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+and+bulbar+muscular+atrophy:+pathogenesis+and+clinical+management.">Spinal and bulbar muscular atrophy: pathogenesis and clinical management.</a> Oral Dis. 20, 6-9 (2014).</li><li>La Spada, A. R., Wilson, E. M., Lubahn, D. B., Harding, A. E., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+gene+mutations+in+X-linked+spinal+and+bulbar+muscular+atrophy.">Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy.</a> Nature. 352, 77-79 (1991).</li><li>Katsuno, M., Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., Sobue, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testosterone+reduction+prevents+phenotypic+expression+in+a+transgenic+mouse+model+of+spinal+and+bulbar+muscular+atrophy.">Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy.</a> Neuron. 35, 843-854 (2002).</li><li>Boissonneault, V., Plante, I., Rivest, S., Provost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-298+and+microRNA-328+regulate+expression+of+mouse+beta-amyloid+precursor+protein-converting+enzyme+1.">MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1.</a> J Biol Chem. 284, 1971-1981 (2009).</li><li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+central+nervous+system+gene+transfer+and+silencing+after+systemic+delivery+of+novel+AAV-AS+vector.">Widespread central nervous system gene transfer and silencing after systemic delivery of novel AAV-AS vector.</a> Mol Ther. 24, 726-735 (2016).</li><li>Pourshafie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-298+counteracts+mutant+androgen+receptor+toxicity+in+spinal+and+bulbar+muscular+atrophy.">MiR-298 counteracts mutant androgen receptor toxicity in spinal and bulbar muscular atrophy.</a> Mol Ther. 24, 937-945 (2016).</li><li>Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRWalk--database:+prediction+of+possible+miRNA+binding+sites+by+&amp;#34;walking&amp;#34;+the+genes+of+three+genomes.">miRWalk--database: prediction of possible miRNA binding sites by &amp;#34;walking&amp;#34; the genes of three genomes.</a> J Biomed Inform. 44, 839-847 (2011).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Stuard, D. A., Oorschot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding,+sectioning,+immunocytochemical+and+stereological+methods+that+optimise+research+on+the+lesioned+adult+rat+spinal+cord.">Embedding, sectioning, immunocytochemical and stereological methods that optimise research on the lesioned adult rat spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 61, 5-14 (1995).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-25+alleviates+polyQ-mediated+cytotoxicity+by+silencing+ATXN3.">miR-25 alleviates polyQ-mediated cytotoxicity by silencing ATXN3.</a> FEBS Lett. 588, 4791-4798 (2014).</li><li>Kuhn, D. E., Martin, M. M., Feldman, D. S., Terry, A. V., Nuovo, G. J., Elton, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+miRNA+targets.">Experimental validation of miRNA targets.</a> Methods. 44, 47-54 (2008).</li><li>Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+viral+and+nonviral+delivery+systems+for+microRNA.">An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA.</a> Int J Pharm Investig. 5, 179-181 (2015).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Front Mol Neurosci. 7, 50 (2014).</li><li>Foust, K. D., Nurre, E., Montgomery, C. L., Hernandez, A., Chan, C. M., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li><li>Wang, Z., Ma, H. -. I., Li, J., Sun, L., Zhang, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Therapy. 10, 2105-2111 (2003).</li><li>Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neonatal+blood-brain+barrier+is+functionally+effective,+and+immaturity+does+not+explain+differential+targeting+of+AAV9.">The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9.</a> Nat Biotechnol. 27, 804-805 (2009).</li><li>Boudreau, R. L., Spengler, R. M., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+therapeutic+siRNAs:+minimizing+off-targeting+potential+to+improve+the+safety+of+RNAi+therapy+for+Huntington&#8217;s+disease.">Rational design of therapeutic siRNAs: minimizing off-targeting potential to improve the safety of RNAi therapy for Huntington&#8217;s disease.</a> Mol Ther. 19, 2169-2177 (2011).</li><li>Duque, S., Joussemet, B., Riviere, C., Marais, T., Dubreil, L., Douar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons.">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).</li><li>Lowenstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+rubicon.">Crossing the rubicon.</a> Nat Biotechnol. 27, 42-44 (2009).</li><li>Sibley, C. R., Seow, Y., Curtis, H., Weinberg, M. S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Parkinson's+disease-associated+genes+with+artificial+mirtron+mimics+of+miR-1224.">Silencing of Parkinson's disease-associated genes with artificial mirtron mimics of miR-1224.</a> Nucleic Acids Res. 40, 9863-9875 (2012).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Her viser vi en meget effektiv og tilgængelig metode til at vælge og levere via hale indsprøjtning en miRNA bruger rAAV9 som en viral vektor til at målrette skeletmuskulatur og motoriske neuroner i mus. 14 i forhold til andre RNAi strategier, er miRNAs mindre giftige og mindre immunogen. 18 derudover deres beskedne størrelse gør dem velegnet til begrænset emballage kapacitet af virale vektorer. 2 beregningsmæssige algoritmer og forudsigelse værktøjer giver mulighed for identifikation af formodede miRNA-mRNA mål. Når identificeret, skal miRNA virkninger på målet genekspression verificeres. En fælles tilgang er at overexpress en given miRNA in vitro- og opdage mål protein udtryk niveauer ved hjælp af vestlige analyse. 14 , 19
Forskellige undersøgelser har brugt viral og ikke-virale strategier til at levere miRNAs. 13 her vi brugte adeno-associeret virus (AAV) som en gene levering værktøj. Sammenlignet med andre virale vektorer, AAV fremkalder lave immunogenicitet, tillader langsigtede genoverførsel, og har et bredt spektrum af tropisme i dividere og ikke-dividere celler. 18 denne leveringsmetode kan også omgå behovet for kemisk ændring, der kan påvirke funktionaliteten og specificitet af RNA-molekyle. Der er flere serotyper af AAV, som for det meste bestemmes af sammensætningen af kapsid proteiner. Disse serotyper adskiller sig i deres tropisme og transduce forskellige celletyper. Det er nødvendigt at vælge den korrekte serotype, når de overvejer målvæv. Vi valgte rAAV9, på grund af sin høje transduktion effektivitet i centralnervesystemet og skeletmuskulatur efter perifer administration19,20. Denne tilgang har vist større transduktion effekt på neonatale dyr sammenlignet med voksne dyr, sandsynligvis på grund af forskelle i ekstracellulær matrix sammensætning, neuron til glia forhold og modenhed af blod-hjerne-barrieren. 21 , 22
Et vigtigt skridt i denne protokol er designet af udtryk vektor. Sammenlignet med bicistronic vektorer, som er hæmmet af lavere udtryk for det andet gen sammenlignet med den første gen ud for arrangøren, dobbelt promotor vektor giver mulighed for en back-to-back-konfiguration giver høj udtryk for både miRNA og EGFP, således at tillade lokalisering af miRNA i mus væv ved immunfluorescens.
Intravenøs injektion af AAV9 resulterede i høj effektivitet og homogen transduktion i målvæv, skeletmuskulatur og motoriske neuroner. Denne rute injektion giver mulighed for den administrerede dosis til at nå systemisk cirkulationen og krydse hjernen blod barriere, hvilket er vigtigt for behandlingsformer rettet mod det centrale nervesystem. Derudover er det en ikke-invasiv metode til levering til CNS. MiR-298 udtryk steg i rygmarv og muskler efter 2-4 uger med en enkelt perifere injektion på 5 uger gammel. Hvornår bruger enkeltstrenget genom AAV vektorer, de novo -syntesen af andet DNA streng kan udgøre for de forsinkede transduktion. 23
Niveauer af menneskelig miR-298 blev målbart i behandlede mus 20 uger efter en enkelt indgift, tyder på at flere injektioner for kroniske sygdomme, kan være forpligtet til at opnå en terapeutisk effekt. MiRNA nedbrydning over tid kan være begrænsende når en livslang gentagen administration er påkrævet. Derudover kan adaptiv immunitet til AAV vektorer danne en anden barriere for en vellykket gen levering. 24 således generation af AAV vektorer, der er immunologisk inert er afgørende for gentagen administration og opnå langsigtede virkninger med denne lovende levering system. 25
En begrænsning af brugen af miRNA som en terapeutisk strategi er risikoen for off-target effekter. MiRNAs kan interagere gennem incomplementary base parring med andre gen afskrifter, der udgør en fare for sikkerheden med denne tilgang. Forbedret design af RNAi-sekvenser, herunder brug af ikke-kanoniske miRNAs, såsom mirtrons, som omgå mikro-processor kompleks og omfattende sikkerheden og tolerabiliteten langtidsstudier er kritiske før omsætte denne strategi i en sikker og effektiv terapi. 26 , 27 , 28
Metoden beskrevet her blev oprindeligt udviklet til miRNA overekspression, men det kan også udnyttes til miRNA hæmning terapi ved hjælp af antagomirs.

MiRNAs ikke-kodende RNA'er, 21-23 nukleotider i længde, der spiller en vigtig rolle i reguleringen af genekspression og kontrol af forskellige cellulære og metaboliske veje. 1 genekspression er primært reguleret ved at inducere post-transcriptional gene silencing eller mRNA nedbrydning. 2 MiRNAs er normalt supplerer den 3' utranslaterede region (UTR) kodning gener, selv om bindende til 5' UTR og kodende regioner af målet mRNA er også blevet beskrevet. 3
Da den nuværende forståelse af rollerne som miRNA i patogenesen af menneskelige sygdomme udvider, bliver farmakologiske graduering af individuelle miRNAs eller miRNA familier stadig en levedygtig mulighed for terapeutisk. Sammenlignet med andre RNA hæmning strategier, miRNAs har mange fordele: miRNAs er mindre giftige og mindre immunogen og nemt kan leveres i celler på grund af deres lille størrelse. 4 , 5 , 6 MiRNAs har typisk mange mål inden for mobilnetværk, derfor potentielle off target effekter og sikkerhed bekymringer skal tages i betragtning, sammen med effektiv levering til målvæv.
Neuromuskulære sygdomme er erhvervet eller nedarvet forhold, der påvirker muskel og motoriske neuroner. Målretning af narkotika til skeletmuskulatur er et spirende område for forskning, hvor den største udfordring er at opnå omfattende udbredelse inden for det terapeutiske vindue. 7 motoriske neuroner er vanskeligere at målrette, hovedsagelig fordi narkotika adgang er udelukket af blod-hjerne barrieren.
Celle kultur og mus modeller af spinal og bulbar muskelatrofi (SBMA) blev anvendt i denne undersøgelse. SBMA er en neuromuskulær sygdom forårsaget af en giftig gevinst funktion mekanisme, hvor både muskel og motoriske neuroner er berørt. 8 , 9 SBMA (Kennedys sygdom; OMIM #313200) er en X-linked sygdom, karakteriseret ved muskelsvaghed og atrofi, forårsaget af CAG gentages ekspansion i AR genet, som koder en længere polyglutamin tarmkanalen i AR protein. 10 ingen sygdomsmodificerende behandling er i øjeblikket tilgængelig for denne lidelse. Den transgene musemodel, der anvendes i denne undersøgelse indeholder funktionerne i sygdom, herunder køn specificitet, motor-neuron patologi og progressiv muskelatrofi. 11
I denne undersøgelse, bestræbelserne fokuseret på at identificere en miRNA som direkte downregulates udtryk af mutant AR transgenet og på at designe en sikker og effektiv tilstand af levering af miRNA til rygmarven og skeletmuskulatur af vores sygdom musemodel.
Her identificeret vi en forholdsvis uncharacterized miRNA, miRNA-298 (stammesamlingsnummer MIMAT0004901),12 til direkte reducere mutant AR udtryk i SBMA modeller. For at opnå levering af miR-298 til målvæv, brugte vi en viral strategi, med rekombinant adeno-associeret virus serotype 9 (rAAV9). rAAV9 er i stand til at krydse blod-hjerne barrieren og mægle langsigtede genekspression i ikke-dividere celler, herunder neuroner. 13 en enkelt systemisk administration af AAV9-miR-298 resulteret i vedvarende udtryk for miRNA, effektiv transduktion af muskel og motoriske neuroner, ned-regulering af AR udtryk og en forbedring af sygdom fænotype i SBMA mus. 14 denne metode kan bruges til at give miRNA eller antagomirs overekspression i vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Purification of miRNA and total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>snoRNA202 Primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1232</td>
			<td>Taqman miRNA control assay in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miR-298 Primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2190</td>
			<td>Taqman miRNA-298 assay in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red ink pad</td>
			<td>Dovecraft Essentials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue ink pad</td>
			<td>Dovecraft Essentials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-GFP vector</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100840</td>
			<td>Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmu-miR-298-5p</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MC12525</td>
			<td>mirVana miRNA mimic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP</td>
			<td>Vector Biosystems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systemic delivery of microrna using recombinant adeno-associated virus serotype 9 to treat neuromuscular diseases in rodents

RNA-interferens via den endogene miRNA pathway regulerer genekspression ved at kontrollere proteinsyntesen gennem post-transcriptional genhæmning. I de seneste år, har miRNA-medieret genregulering vist potentiale til behandling af neurologiske lidelser forårsaget af en giftig gevinst funktion mekanisme. Effektiv levering til målvæv har imidlertid begrænset dens anvendelse. Vi brugte her en transgene musemodel for spinal og bulbar muskelatrofi (SBMA), en neuromuskulær sygdom forårsaget af polyglutamin ekspansion i androgen receptor (AR), til at teste genhæmning af en nyligt identificerede AR-targeting miRNA, miR-298. Vi overexpressed miR-298 ved hjælp af en rekombinant adeno-associeret virus (rAAV) serotype 9 vektor for at lette transduktion af ikke-dividere celler. En enkelt hale-vene injektion i SBMA mus induceret vedholdende og udbredte overekspression af miR-298 i skeletmuskulatur og motoriske neuroner og resulterede i en forbedring af den neuromuskulære fænotype i mus.

En viral belastning af 1011 vg af AAV9-miR-298 var injiceres gennem en enkelt indsprøjtning af hale-vene i 5 uger gamle SBMA mus. Disse mus bære menneskelige AR transgenet med unormalt udvidede polyglutamin tarmkanalen i AR (AR97Q) og udvikle tegn på neuromuskulære sygdomme af 10 ugers alder (vægttab, krum ryg og muskelatrofi). 11 lumbal rygmarven og quadriceps muskler er høstet på 2, 4, 8 og 12 uger efter administration for miRNA kvantificering, biokemiske assay og Immunhistokemi (figur 1). Administration af behandlingen og de efterfølgende analyser blev udført af blindede efterforskere.
qRT-PCR Analysen viste miR-298 udtryk i den skeletmuskulatur og rygmarven to uger og fire uger efter behandling henholdsvis med peak udtryk niveauer på 8 uger i den skeletmuskulatur og 12 uger i rygmarven efter injektion (figur 2 ). Ved hjælp af et mikroskop (Axiovert 100 M), blev grønne fluorescens signal opdaget i muskelvæv og spinal motor neuroner ved co lokalisering af normal god landbrugspraksis og motoriske neuron markør cholin acetyltransferase (ChAT) 10 uger efter behandling, når musene begynder at vise sygdom manifestationer (figur 2).
Bruger den samme dosis regime, blev en kohorte af SBMA mus randomiseret til at modtage enten miR-298 eller håne på 7 uger gammel via hale vene indsprøjtning til biokemiske analyser og funktionel karakterisering. Injektion blev efterfulgt af ugentlige vægt og adfærdsmæssige vurdering til 40 ugers alder. qRT-PCR Analysen viste at miR-298 behandling reducerer niveauet af mutant AR i berørte væv (figur 3), og øget kropsvægt og forbedret motor ydeevne (figur 4) starter ved 10 uger efter injektionen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig1.jpg"> Figur 1: skematisk af forsøgsdesign. For at øge udtryk niveauer af miR-298 in vivo sprøjtet vi SBMA mus med (A) dual promotor AAV vektor plasmid udtryk for normal god landbrugspraksis og enten miR-298 eller mock. (B) mus blev injiceret via en enkelt hale-forgæves injektion 7 uger gamle (pre symptomatisk fase). Rygmarven og quadriceps muskler blev indsamlet fra en kohorte af SBMA mus på forskellige tidspunkter for væv distribution analyse (grøn). En kohorte af SBMA mus blev behandlet og ofret på 16 uger gammel til biokemiske analyser (rød). Vægt og adfærdsmæssige assays blev udført ugentligt op til 40 ugers alder for funktionelle karakterisering (blå). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig2.jpg"> Figur 2: AAV9-miR-298 levering i mus. Mus bruger metoden beskrevet her, har modtaget enten AAV9-miR-298-NGL eller AAV9-mock-NGL gennem intravenøs injektion. Samlede miRNA blev indsamlet fra lumbal rygmarven og quadriceps muskler på 2,4,8 og 12 uger efter injektionen. qRT-PCR blev udført for at vurdere udtryk niveau af miR-298 i (A) quadriceps muskler (n = 5) (B) lumbal spinal cord (n = 5, P < 0,01). Alle data er rapporteret som middel ± standardafvigelse middelværdi. Den udbredte transduktion af AAV vektor i væv høstet på 10 uger efter behandlingen blev bekræftet ved lokalisering af farvning for normal god landbrugspraksis i (C) quadriceps muskler (oprindelige forstørrelse, 10 X. Skalalinjen = 100 µm) og (D) motoriske neuroner i lumbal spinal cord (oprindelige forstørrelse, 40 X. Skalalinjen = 10 µm. normal god landbrugspraksis (grøn), ChAT (rød) og DAPI (blå). Tallet er blevet ændret fra doi: 10.1038/mt.2016.13. 14 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig3.jpg"> Figur 3: MiRNA-298 overdrevne udtryk downregulates mutant AR i rygmarven og quadriceps muskler i mus. qRT-PCR blev udført for at vurdere udtryk niveauer af AR mRNA i (A) lumbal rygmarven og (B) quadriceps muskler er behandlet med AAV9-miR-298-NGL eller AAV9-mock-normal god landbrugspraksis. Udskrift niveauer var normaliseret til snoRNA202 (n = 5 per behandling). * P < 0,05, ** P < 0,01. Alle data er rapporteret som middel ± standardfejl. Tallet er blevet ændret fra doi: 10.1038/mt.2016.13. 14
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig4.jpg"> Figur 4: MiR-298 overdrevne udtryk forbedrer motorik og reducerer vægttab. Adfærdsmæssige vurdering blev udført en gang om ugen (w), mellem uge 5-40. Body vægt (venstre) og hængende wire (højre) udførelsen af mus (n = 15 pr. gruppe). Alle data er rapporteret som middel ± standardfejl. Tallet er blevet ændret fra doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Watch this Scientific Journal Video about Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents at JoVE.com

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Her beskriver vi levering af mikroRNA ved hjælp af en rekombinant adeno-associeret virus serotype 9 i en musemodel af neuromuskulære sygdomme. En enkelt perifere administration i mus resulteret i vedvarende miRNA overekspression i muskel og motoriske neuroner, giver mulighed for undersøgelse miRNA funktion og terapeutiske potentielle in vivo.

Systemisk levering af mikroRNA ved hjælp af rekombinante Adeno-associeret Virus Serotype 9 til behandling af neuromuskulære sygdomme i gnavere

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Tilfældig mutagenese ved anvendelse histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Påvisning af mikroRNA ekspression i peritoneal membran af rotter ved hjælp af kvantitativ real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekventering: Supplerende DNA bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af Formalin-fast Paraffin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forstærkning af nær fuld længde HIV-1 provirus for næste Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Ved hjælp af Ustilago maydis som en trojansk hest for i Situ levering af majs proteiner

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering af mRNA fra fuldblod ved hjælp af Nanopmalm sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

En in vitro-protokol til evaluering af MicroRNA-niveauer, funktioner og tilknyttede Målgener i tumor celler

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

En Bioinformatik rørledning til præcist og effektivt at analysere MicroRNA Transkriptomes i planter

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Levering af modificeret mRNA i en myokardieinfarkt musemodel

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...