Name: systemic delivery of microrna using recombinant adeno-associated virus serotype 9 to treat neuromuscular diseases in rodents
Uploaded: 2018-08-10T12:30:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents at JoVE.com

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים. אנו מודים SignaGen מעבדות (Rockvile, MD, ארצות הברית) עבור הייצור וירוס AAV9. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר מגזר NINDS, NIH. פיליפ ר. לי נתמכה על ידי בכספי החלוקה של מגזר מחקר של NICHD. קרלו Rinaldi נתמכה על ידי התחברות מ- les חדר מרווח וחדיש האגודה הצרפתית Myopathies (AFM).

כל ההליכים בוצעו על פי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (8 עורך, העיתונות הלאומי באקדמיות, מתוקן 2011), ואת אושרו על ידי ועדת אכפת NINDS חיה.
1. AAV9-miRNA עיצוב אסטרטגיה, miRNA הבחירה
<ol><li>השתמש miRWalk חזוי של מסד הנתונים כדי לבחור miRNAs המועמד המקיימים אינטראקציה עם ה-mRNA 3' UTR האזור של הגן היעד. 15 הערה: להגביל את הזרע מינימלי אורך miRNA רצף נוקלאוטידים לפחות 7. בחר תוכניות חיזוי אחרות miRNA הוקמה (מירנדה, miRDB, Targetscan) לניתוח השוואתי. בהתבסס על קריטריוני הבחירה האלה, כאן, מיר-185, מיר-298, מיר – 873 ו miR-877 נבחרו להערכה נוספת.</li>
	<li>לאחזר את רצף miRNA שנבחר miRBase (http://www.mirbase.org/).</li>
	<li>לשכפל את פרי-מיר (60-70 nts) nts שלה 250-300 איגוף רצף גנומית משני צידי הדף, או רצף מעושה, לתוך AAV המתאים cis וקטוריים. הערה: רצף איגוף נדרש עבור הביטוי הנכון pri-מיר ועיבוד microRNA בוגרת. בחר וקטור cis כפול-יזם rAAV עם קלטת הביטוי המורכב לדוגמה מקדם אלפא מקדם-1 (EIF1α) התארכות האנושי ואחריו את miRNA שנבחר או רצף מעושה, האמרגן cytomegalovirus אנושי (CMV) ואחריו cDNA קידוד תגית פלורסנט GFP. האמרגן EIFα נבחר כי זה מבטיח ביטוי אחידה ויציבה, עם סיכונים מינימליים של שתיקת. היזמים רקמות ספציפיות או מותנה יכול לשמש, בהתאם יישומים ספציפיים.</li>
	<li>היכונו, לטהר, titrate את AAV, בפרוטוקולים הבאים שפורסמו. 16 הערה: כאן, שכפול של פרי-מיר לתוך AAV וקטור וייצור ויראלי בוצעו על-ידי יצרן חיצוני.</li>
</ol>2. הזנב הזרקה לווריד של פלסמיד AAV-miRNA
הערה: שלב זה צריך התאמה על פי הגן היעד ואת גיל משקל של העכברים. השתמש בקווים המנחים גופים מוסדיים, טיפול בעלי חיים, שימוש הוועדה (IACUC) כדי לקבוע את טווח המינון, נפח ואת המסלול המתאים ביותר של המינהל בהתבסס על גיל משקל של העכברים. GFP פלורסצנטיות אות ו miRNA רמות הביטוי ברקמות היעד צפויים שיא החל 2 שבועות לאחר ההזרקה. הפרוטוקול הבא מתייחס עכברים זכרים בבגרות המוקדמת. AAV צריך להיות מטופל כמו במצב אזהרה ביולוגית תחת הנחיות אבטחה ברמה 1.
<ol><li>לחלק מניות פלסמיד AAV-miRNA של 100-200 µL aliquots המכיל עומס נגיפי של נגיפי-הגנום 10 של10-1011 , לכל mL (vg/mL) באמצעות תמיסת מלח סטרילית פוספט buffered (PBS). ציוד מגן אישי הביולוגי מעבדה אמור לשמש כדי להתמודד עם הפתרון AAV. הערה: ברגע מופשר הוא aliquot זה יכול להיות מאוחסנים ב 4 ° C עד שבועיים. מניות נגיפי ניתן לאחסן במקפיא-80 ° C.</li>
	<li>לרסן את העכבר restrainers זמינים מסחרית כמו שפופרת פלסטיק או מחודדות הסרט פלסטיק בגודל המתאים.</li>
	<li>לנקות את השטח של הזנב עם מגבונים אלכוהול 70%.</li>
	<li>מחזיק כרית חמה (28-30 מעלות צלזיוס) מתחת לזנב להגדיל vasodilation ב-30 s. לחלופין, לחמם את החיות באמצעות מנורת חימום אדום (ממרחק של 2-3 מטר) או על-ידי טבילה הזנב לתוך מים חמים.</li>
	<li>
החל החלק הדיסטלי של הזנב, הכנס את המחט (27-30 גר') טעון עם aliquot ויראלי, מסגרת משופעת, 15° לכיוון הזנב, לווריד. לפני זריקה, ודא שהמחט מוחדרת כראוי.
	<ol>
<li>אם התנגדות מורגשת במהלך ההזרקה, או נפיחות מופיע מתחת לעור, להפסיק את ההליך. הסר את המחט והכנס מחדש את המחט מעל האתר הזרקת הקודם. הערה: לחלופין, זה יכולה להיות מושגת על ידי בעדינות כ רפה בעברית את המחט והתבוננות דם. השאיפה קשה ניתן לצמצם את הווריד הזנב. אם הווריד blanches במהלך ההזרקה, המחט מוחדרת כראוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר הזריקה הושלמה, המתן מספר שניות לפני העלאת את המחט.</li>
	<li>להתבונן ההזרקה דימום. הפעילו לחץ מתון באמצעות שתי אצבעות אל האתר עד הדימום מפסיק.</li>
	<li>להחזיר את החיה לכלוב שלו.</li>
</ol>3. מבחני התנהגות
הערה: כל הניסויים נערכו באופן עיוור על ידי צד שלישי עם הסתרה של טיפולים על ידי בקבוקונים מקודדת באופן ייחודי. סדר הטיפולים היה אקראי. בעת ביצוע הבדיקות המתוארות להלן, ניסיוני תנאים (סוג של החדר), שעות היום צריכה להיות נשלטת כדי להפחית את הווריאציה. בדיקה זו צריכה להתבצע על עכברים שגילן עולה על ארבעה שבועות כדי להשיג תוצאות אמינות. העכבר עברו הערכה התנהגותית פעם אחת לפני הזרקת ויראלי ב 5 שבועות של גיל כדי להשיג את הבסיס של הביצועים נורמלית. לאחר ההזרקה ויראלי, עכברים היו העריך פעם בשבוע מתחיל 48 שעות לאחר ההזרקה, עד גיל 40 שבועות.
<ol><li>להביא את העכבר הזריק AAV בחדר שקט, חשוך הינה ללא רעש או אחרים הפרעות לפחות 30 דקות לפני תחילת המבחנים. אל תפריעי לחיות בתקופה זו של הסתגלות.</li>
	<li>ואקלום העכבר לחדר החדש במשך 30 דקות ולאחר מכן להתחיל את מבחני התנהגות הבאות (שלבים 3.3 ו- 3.4). לשמור על פער של 10 דקות בין כל assay התנהגותית.</li>
	<li>
תלוי מבחן תיל הערה: בדיקה זו מנטרת את כוח השרירים ושיפור בתפקוד מוטורי.<ol>
<li>להשתמש סדין ריפוד לפעול כמו כרית. הרם את העכבר על-ידי זנבו ומניחים אותו על מרכז המדף רשת תיל. להעלות את ארון התקשורת 15-20 ס מ מעל פני השטח, לאט היפוך המסך כדי לאפשר את החיה להתאים את אחיזתו המסך.</li>
		<li>ברגע ארון התקשורת היא הפוכה לחלוטין, להתחיל את הטיימר, לרשום את הזמן ליפול. הערה: עכברים יבלו עם ארבעת הגפיים על רשת. אם החוט על ערך נמוך מדי עלול העכברים לא תחזיק מעמד. אם עכברים ליפול הרשת לפני 60 s, למקם אותם בחזרה על הרשת, לאפס את שעון העצר, חזור על הליך זה תלוי מניע עוד שני ניסיונות. לרשום את הביצועים הטובים ביותר.</li>
		<li>מתי הזמן להגביל של 60 s מתמלאת, לחזור האחורי חיות בכלוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
שיטת ההדפסה רגל הערה: הגיליון סופג צריך להיות מסלול צר, כ- 70 ס מ וגובהה 5 ס מ ברוחב 5 ס מ מוקף חומות גבוהות.<ol>
<li>החזק בעדינות את העכבר על ידי יד אחת, החלים דיו אדום על השלג דיו כחול כפות רגליו האחוריות עם מברשת.</li>
		<li>מקם את הגיליון סופג על הרצפה של מסלול צר.</li>
		<li>לאפשר את העכבר ללכת או לרוץ על גיליון סופג בקו ישר במסלול מקצה אחד לשני.</li>
		<li>חזור על התהליך שניים עוד פעמיים עם העכבר בעזרת סדין סופג טריים.</li>
		<li>למדוד את המרחק בין שני שלבים עוקבים בתנועה קדימה. לא לכלול ראשון ואחרון כמה עקבות איפה החיה רק ייזום, גימור מעוזם.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. המתת חסד ו רקמת הקציר
<ol><li>השתמש תא המתת חסד או צנצנת. אם משתמש צנצנת, בצע את ההליך ברדס fume.</li>
	<li>לטבול צמר גפן עם איזופלוריין והנח אותו במעבדה. השתמש מפריד הפיזי כדי לשמור את החיה ממגע פיזי עם חומר הרדמה. מקם את החיה הצנצנת מיד לאחר שלב זה. הערה: הצנצנת בל לא צריך להיות טעון מראש עם איזופלוריין כדי למנוע את האפשרות של hypoxemia את החיות.</li>
	<li>המשך החשיפה איזופלוריין עד גיל 30 s לאחר עוצר נשימה.</li>
	<li>מיד לאחר הסרת העכבר מצנצנת, המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם. הערה: שלב זה צריך לקחת את המקום במהירות האפשרית כדי למנוע השפלה רקמות.</li>
	<li>
קציר לחוט. השדרה הראשונה ולאחר מכן את השריר הארבע ראשי השלד.
	<ol>
<li>הקציר חוט השדרה, לחשוף את הישבן של העכבר ולתקן את ארבעת הגפיים בצד כדי קרש חיתוך.</li>
		<li>לשטוף את האתר של הקרע עם 70% אתנול.</li>
		<li>לבצע פריקה צוואר הרחם באמצעות מספריים חדות.</li>
		<li>לעשות חתך בעור בקו החציוני. הסר את הפרווה על ידי חיתוך או קורעים זהיר של העור ב מישור רוחבי, ואחריו משיכת הפרווה למעלה הראש. הסר את הראש על ידי גזירה במספריים מתחת השכמות, אזור C1-2 של העמודה (נמצא סמוך לבסיס הגולגולת).<ol>
<li>לחתוך את מערכת השרירים של דופן הבטן בצד הגחוני ולהמשיך רוחבית, כיוון אחד בכל פעם, עד עמוד השדרה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>באמצעות חוליות הסרה של מספריים חדות החל מחוט השדרה הצווארי. להסיר את החלקים לרוחב של החוליות על ידי חיתוך מעבר הקשתות בחוליות לעבר שני הצדדים.</li>
		<li>לאחר הסרת החוליות כולו שחרר חוט השדרה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הצמד להקפיא את רקמות שנקטפו ב- 2-methylbutane צוננות מראש באמצעות השיטה שלהלן:
	<ol>
<li>חצי למלא קערה נירוסטה עם 2-methylbutane ויציפו את הרבעון התחתון הקערה במיכל מלא עם חנקן נוזלי.</li>
		<li>מקררים מראש את methylbutane-2 בחנקן נוזלי למשך 1-2 דקות.</li>
		<li>מקם את שרירי השלד עם מלקחיים ב- 2-methylbutane עד שהוא הופך לבן. להעביר מיד את הרקמה כדי לייבש קרח ולאחר מכן אחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור immunostaining בחוט השדרה, להטביע את הרקמה בבלוקים פרפין בטמפרטורת החדר לפני snap קפוא כמתואר. 17
</li>
	<li>אנליזה ביוכימית, miRNA כמת,1 למקם את הרקמה שנקטפו cryovial ומקפיאים בחנקן נוזלי. לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Broderick, J. A., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+therapeutics.">miRNA therapeutics.</a> Gene Therapy. 18, 1104-1110 (2011).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nat Rev Genet. 12, 861-874 (2011).</li><li>Pickering, B. M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+implications+of+structured+5'+untranslated+regions+on+translation+and+disease.">The implications of structured 5' untranslated regions on translation and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 39-47 (2005).</li><li>Bilen, J., Liu, N., Burnett, B. G., Pittman, R. N., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+pathways+modulate+polyglutamine-induced+neurodegeneration.">MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration.</a> Mol Cell. 24, 157-163 (2006).</li><li>Lee, Y., Samaco, R. C., Gatchel, J. R., Thaller, C., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-19,+miR-101+and+miR-130+co-regulate+ATXN1+levels+to+potentially+modulate+SCA1+pathogenesis.">miR-19, miR-101 and miR-130 co-regulate ATXN1 levels to potentially modulate SCA1 pathogenesis.</a> Nat Neurosci. 11, 1137-1139 (2008).</li><li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-34+modulates+ageing+and+neurodegeneration+in+Drosophila.">The microRNA miR-34 modulates ageing and neurodegeneration in Drosophila.</a> Nature. 482, 519-523 (2012).</li><li>Ebner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+skeletal+muscle+targeting+in+drug+discovery.">Strategies for skeletal muscle targeting in drug discovery.</a> Curr Pharm Des. 10, 1327-1336 (2015).</li><li>Giorgetti, E., Lieberman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+androgen+receptor-mediated+neuromuscular+disease.">Polyglutamine androgen receptor-mediated neuromuscular disease.</a> Cell Mol Life Sci. 73, 3991-3999 (2016).</li><li>Grunseich, C., Rinaldi, C., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+and+bulbar+muscular+atrophy:+pathogenesis+and+clinical+management.">Spinal and bulbar muscular atrophy: pathogenesis and clinical management.</a> Oral Dis. 20, 6-9 (2014).</li><li>La Spada, A. R., Wilson, E. M., Lubahn, D. B., Harding, A. E., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+gene+mutations+in+X-linked+spinal+and+bulbar+muscular+atrophy.">Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy.</a> Nature. 352, 77-79 (1991).</li><li>Katsuno, M., Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., Sobue, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testosterone+reduction+prevents+phenotypic+expression+in+a+transgenic+mouse+model+of+spinal+and+bulbar+muscular+atrophy.">Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy.</a> Neuron. 35, 843-854 (2002).</li><li>Boissonneault, V., Plante, I., Rivest, S., Provost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-298+and+microRNA-328+regulate+expression+of+mouse+beta-amyloid+precursor+protein-converting+enzyme+1.">MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1.</a> J Biol Chem. 284, 1971-1981 (2009).</li><li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+central+nervous+system+gene+transfer+and+silencing+after+systemic+delivery+of+novel+AAV-AS+vector.">Widespread central nervous system gene transfer and silencing after systemic delivery of novel AAV-AS vector.</a> Mol Ther. 24, 726-735 (2016).</li><li>Pourshafie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-298+counteracts+mutant+androgen+receptor+toxicity+in+spinal+and+bulbar+muscular+atrophy.">MiR-298 counteracts mutant androgen receptor toxicity in spinal and bulbar muscular atrophy.</a> Mol Ther. 24, 937-945 (2016).</li><li>Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRWalk--database:+prediction+of+possible+miRNA+binding+sites+by+&amp;#34;walking&amp;#34;+the+genes+of+three+genomes.">miRWalk--database: prediction of possible miRNA binding sites by &amp;#34;walking&amp;#34; the genes of three genomes.</a> J Biomed Inform. 44, 839-847 (2011).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Stuard, D. A., Oorschot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding,+sectioning,+immunocytochemical+and+stereological+methods+that+optimise+research+on+the+lesioned+adult+rat+spinal+cord.">Embedding, sectioning, immunocytochemical and stereological methods that optimise research on the lesioned adult rat spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 61, 5-14 (1995).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-25+alleviates+polyQ-mediated+cytotoxicity+by+silencing+ATXN3.">miR-25 alleviates polyQ-mediated cytotoxicity by silencing ATXN3.</a> FEBS Lett. 588, 4791-4798 (2014).</li><li>Kuhn, D. E., Martin, M. M., Feldman, D. S., Terry, A. V., Nuovo, G. J., Elton, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+miRNA+targets.">Experimental validation of miRNA targets.</a> Methods. 44, 47-54 (2008).</li><li>Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+viral+and+nonviral+delivery+systems+for+microRNA.">An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA.</a> Int J Pharm Investig. 5, 179-181 (2015).</li><li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus.">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Front Mol Neurosci. 7, 50 (2014).</li><li>Foust, K. D., Nurre, E., Montgomery, C. L., Hernandez, A., Chan, C. M., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li><li>Wang, Z., Ma, H. -. I., Li, J., Sun, L., Zhang, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Therapy. 10, 2105-2111 (2003).</li><li>Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neonatal+blood-brain+barrier+is+functionally+effective,+and+immaturity+does+not+explain+differential+targeting+of+AAV9.">The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9.</a> Nat Biotechnol. 27, 804-805 (2009).</li><li>Boudreau, R. L., Spengler, R. M., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+therapeutic+siRNAs:+minimizing+off-targeting+potential+to+improve+the+safety+of+RNAi+therapy+for+Huntington&#8217;s+disease.">Rational design of therapeutic siRNAs: minimizing off-targeting potential to improve the safety of RNAi therapy for Huntington&#8217;s disease.</a> Mol Ther. 19, 2169-2177 (2011).</li><li>Duque, S., Joussemet, B., Riviere, C., Marais, T., Dubreil, L., Douar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons.">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).</li><li>Lowenstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+rubicon.">Crossing the rubicon.</a> Nat Biotechnol. 27, 42-44 (2009).</li><li>Sibley, C. R., Seow, Y., Curtis, H., Weinberg, M. S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Parkinson's+disease-associated+genes+with+artificial+mirtron+mimics+of+miR-1224.">Silencing of Parkinson's disease-associated genes with artificial mirtron mimics of miR-1224.</a> Nucleic Acids Res. 40, 9863-9875 (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנחנו מדגימים מתודולוגיה מאוד יעיל ונגיש לבחור ולהעביר באמצעות זריקת הזנב miRNA באמצעות rAAV9 כמו וקטור ויראלי למטרה שרירי השלד, מנוע הנוירונים בעכברים. 14 לעומת אחרים אסטרטגיות RNAi, miRNAs הם פחות רעילים פחות immunogenic. 18 . בנוסף, גודלם הקטן להפוך אותם המתאימה את קיבולת אריזה מוגבלת של וקטורים ויראלי. 2 אלגוריתמים חישובית כלי חיזוי מאפשרות זיהוי מטרות בשם miRNA-mRNA. ברגע לזיהוי, יש צורך לאמת את ההשפעות של miRNA על ביטוי גנים היעד. גישה משותפת היא overexpress של miRNA נתון במבחנה , לזהות רמות הביטוי של חלבון המטרה באמצעות ניתוח המערבי. 14 , 19
מחקרים שונים השתמשו אסטרטגיות ויראלי נגיפי להעברת miRNAs. 13 כאן השתמשנו adeno-הקשורים וירוס (AAV) ככלי המסירה הגן. לעומת אחרים וקטורים ויראלי, AAV מעורר immunogenicity נמוכות, מאפשר העברה גנטית לטווח ארוך, יש קשת רחבה של tropism חלוקת ללא חלוקת תאים. 18 שיטת העברה זו גם לעקוף את הצורך שינוי כימי שעשויים להשפיע על פונקציונליות וספציפיות של מולקולת ה-RNA. ישנם מספר אשר נגרמו מהזנים אליהם של AAV, אלה נקבעים בעיקר על ידי ההרכב של החלבונים capsid. אלה אשר נגרמו מהזנים אליהם נבדלים שלהם tropism, מגלי סוגי תאים שונים. זה הכרחי לבחור את serotype הנכון כאשר בוחנים את רקמת המטרה. בחרנו rAAV9, בגלל היעילות שלה התמרה חושית גבוהה במערכת העצבים המרכזית ואת שרירי השלד בעקבות ניהול היקפיים19,20. גישה זו הראו להתייעלות התמרה חושית בבעלי neonatal בהשוואה למבוגרים בעלי חיים, ככל הנראה בגלל הבדלים קומפוזיציה מטריצה חוץ-תאית, נוירון-כדי-עכשיו, דונלד יחס ובגרות של המחסום הדם-המוח. 21 , 22
צעד חשוב ב פרוטוקול זה הוא העיצוב של וקטור הביטוי. בהשוואה bicistronic וקטורים, אשר מונעים על ידי ביטוי התחתון של הגן השני לעומת הגן הראשון לצד ייצוג המקדם, הווקטור כפול המקדם מאפשרת תצורה גב אל גב מניב ביטוי גבוהה הן miRNA והן EGFP, ובכך המאפשר לוקליזציה של miRNA העכבר רקמה על-ידי immunofluorescence.
AAV9 תוך ורידיות הביא התמרה חושית הומוגנית ברקמות היעד, שרירי השלד ולאחר מוטורי לגלוקוז ויעילות גבוהה. המסלול של הזרקת מאפשר את המינון מנוהל להגיע את מחזור מערכתי, לחצות את מחסום הדם מוח, וזה חשוב עבור טיפולים מיקוד על מערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, היא שיטה לא פולשנית למסירה מערכת העצבים. MiR-298 הביטוי עלה ב חוט השדרה ואת שריר אחרי 2-4 שבועות עם זריקה אחת היקפיים רוב בגיל 5 שבועות. כאשר באמצעות גנום חד גדילי AAV וקטורים, סינתזה דה נובו של סטרנד DNA השני עשוי להסביר התמרה חושית מושהית. 23
רמות של מיר אנושי-298 היו בלתי מורגשת אצל עכברים שטופלו 20 שבועות לאחר ניהול יחידה, רומז כי למחלות כרוניות, זריקות מרובות עשוי להיות נדרש כדי להגיע יתרון טיפולית. עם זאת, להיות הגבלת miRNA השפלה לאורך זמן כאשר המינהל חוזרות ונשנות לכל החיים נדרשת. בנוסף, חסינות מסתגלת AAV וקטורים יכולים ליצור מחסום אחר משלוח גנים מוצלחים. 24 וכך דור של הווקטורים AAV שהם מבינים immunologically חיונית עבור מינהל חוזרות והשגת השפעות ארוכות טווח עם מערכת משלוח מבטיח זו. 25
הגבלה על השימוש של miRNA כאסטרטגיה טיפולית היא הסיכון של תופעות מחוץ-יעד. MiRNAs שדואגים דרך הבסיס incomplementary זיווג עם תעתיקים גנים אחרים, אשר מהווה סיכון בטיחות עם גישה זו. שיפור בעיצוב של הרצף RNAi, לרבות השימוש miRNAs קאנונית, כגון mirtrons, אשר לעקוף את המתחם מיקרו-מעבד, מקיף מחקרים ארוכי טווח הבטיחות והסבילות הם קריטיים לפני לתרגם אסטרטגיה זו כספת ו טיפול יעיל. 26 , 27 , 28
השיטה המתוארת כאן פותחה במקור עבור ביטוי miRNA, אבל זה גם יכול להיות מנוצל עבור miRNA עיכוב טיפול באמצעות antagomirs.

MiRNAs הם ללא קידוד RNAs, נוקלאוטידים 21-23 אורך, זה תפקיד חשוב ברגולציה של ביטוי גנים, בקרה של מסלולים מגוונים הסלולר וחילוף. 1 ביטוי גנים מוסדר בעיקר על ידי גרימת השפלה להשתיק או mRNA ג'ין post-transcriptional. 2 MiRNAs הם בדרך כלל משלים לאזור 3' לא מתורגם (UTR) של קידוד גנים, למרות כריכת 5' UTR וקידוד מחוזות המטרה ש-mrna גם תואר. 3
להבנת התפקידים של miRNA בפתוגנזה של מחלות האדם הנוכחי מתרחב, אפנון תרופתי miRNAs בודדים או משפחות miRNA הוא יותר ויותר אפשרות טיפולית מעשית. לעומת אחרים אסטרטגיות עיכוב RNA, miRNAs יש יתרונות רבים: miRNAs הינם רעילים פחות immunogenic פחות, ניתן בקלות להעביר לתוך תאים בשל גודלם הקטן. 4 , 5 , 6 MiRNAs בדרך כלל יש מטרות רבות בתוך הרשתות הסלולאריות, לכן תופעות מחוץ-יעד האפשריות, חששות בטיחות צריכים להילקח בחשבון, יחד עם משלוח יעיל לרקמות היעד.
מחלות נוירומוסקולריות נרכשים או ירש תנאים המשפיעים על שרירים ועל מוטורי לגלוקוז. כיוון התקפות על סמים כדי שרירי השלד הוא אזור המתעוררים של מחקר, איפה האתגר המרכזי כדי להשיג תפוצה נרחבת בתוך חלון טיפולי. 7 מוטורי לגלוקוז קשים יותר למטרה-בעיקר בגלל סמים גישה זו מנעה ידי מחסום הדם מוח.
תא תרבות ועכבר מודלים של ניוון שרירי עמוד השדרה ו- bulbar (SBMA) השתמשו במחקר זה. SBMA היא מחלה neuromuscular הנגרמת על ידי רווח רעילים של מנגנון פונקציה, שבו מושפעים שרירים והן מוטורי לגלוקוז. 8 , SBMA 9 (המחלה של קנדי; OMIM #313200) היא מחלה X-linked, המאופיינת חולשת שרירים ו ניוון, הנגרמת על ידי חטיבתי הרחבה אני חוזר בגן AR, שמקודד בדרכי polyglutamine המורחבת בהחלבון AR . 10 אין טיפול למחלות שינוי זמין כעת עבור הפרעה זו. המודל העכבר הטרנסגניים השתמשו במחקר זה recapitulates את התכונות של המחלה, לרבות ירידה לפרטים מגדר, מנוע-נוירון פתולוגיה, ניוון שרירים מתקדמת. 11
במחקר זה, המאמצים שלנו התמקדו בזיהוי של miRNA downregulates ביטוי ישירות את transgene AR מוטציה, על עיצוב מצב בטוח ויעיל של מסירת miRNA בחוט השדרה ואת שרירי השלד של המודל העכבר שלנו המחלה.
כאן אנחנו מזוהה יחסית uncharacterized miRNA, miRNA-298 (מספר גישה MIMAT0004901),12 לצמצום ישירות AR מוטציה, ביטוי SBMA מודלים. כדי להשיג את המסירה של מיר-298 לרקמות היעד, השתמשנו אסטרטגיה ויראלי, עם וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים serotype 9 (rAAV9). rAAV9 הוא מסוגל לחצות את מחסום הדם מוח, מתווכים גנים לטווח ארוך ללא חלוקת תאים, כולל נוירונים. 13 ניהול מערכתי יחידה של AAV9-מיר-298 הביא בביטוי מתמשכת של miRNA, התמרה חושית יעילה של שרירים, מוטורי לגלוקוז, למטה-רגולציה של הביטוי AR, amelioration של פנוטיפ המחלה בעכברים SBMA. 14 מתודולוגיה זו יכול לשמש כדי לספק miRNA או antagomirs ביטוי ויוו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Purification of miRNA and total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>snoRNA202 Primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1232</td>
			<td>Taqman miRNA control assay in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miR-298 Primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2190</td>
			<td>Taqman miRNA-298 assay in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red ink pad</td>
			<td>Dovecraft Essentials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue ink pad</td>
			<td>Dovecraft Essentials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-GFP vector</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100840</td>
			<td>Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmu-miR-298-5p</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MC12525</td>
			<td>mirVana miRNA mimic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP</td>
			<td>Vector Biosystems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systemic delivery of microrna using recombinant adeno-associated virus serotype 9 to treat neuromuscular diseases in rodents

התערבות ב RNA דרך השביל miRNA אנדוגני מסדיר ביטוי גנים על ידי שליטה סינתזה של חלבון באמצעות post-transcriptional ג'ין להחרשת. בשנים האחרונות, הכונה בתיווך miRNA הראו פוטנציאל לטיפול של הפרעות נוירולוגיות הנגרמת על ידי רווח רעילים של מנגנון פונקציה. עם זאת, משלוח יעיל לרקמות היעד מוגבל היישום שלה. כאן השתמשנו דגם העכבר הטרנסגניים עבור ניוון שרירי עמוד השדרה ו- bulbar (SBMA), מחלה neuromuscular הנגרמת על ידי הרחבת polyglutamine ב קולטן האנדרוגן (AR), לבחון את ג'ין להחרשת מאת החדש מזוהה פילוח AR miRNA, מיר-298. אנחנו overexpressed מיר-298 באמצעות וקטור serotype 9 וירוס adeno-הקשורים רקומביננטי (rAAV) כדי להקל על התמרה חושית של אי חלוקת תאים. זריקה אחת וריד הזנב בעכברים SBMA המושרה ביטוי נרחבת ומתמשכת של מיר-298 שרירי השלד, מוטורי לגלוקוז וכתוצאה amelioration של פנוטיפ neuromuscular בעכברים.

עומס נגיפי של vg 1011 של AAV9-מיר-298 הוזרק באמצעות זריקה אחת וריד הזנב לתוך עכברים SBMA 5 בן שבועיים. אלו עכברים לשאת את transgene AR האדם עם דרכי polyglutamine באופן חריג המורחבת ב- AR (AR97Q) והוא לפתח סימנים של מחלה התוקפת על-ידי 10 שבועות של גיל (ירידה במשקל, הגב הכפוף ו ניוון שרירים). 11 עמוד השדרה המותני, שריר הארבע ראשי נבצרו ב- 2, 4, 8 ו- 12 שבועות לאחר ניהול miRNA כמת, וזמינותו הביוכימי של אימונוהיסטוכימיה (איור 1). ניהול הטיפול ועל הבדיקות הבאים בוצעו על-ידי חוקרי עיוור.
ניתוח לרביעיית-PCR הראה מיר-298 ביטוי בשריר השלד ואת חוט השדרה שבועיים, ארבעה שבועות לאחר הטיפול בהתאמה, עם שיא רמות ביטוי בגיל 8 שבועות בשריר השלד ו- 12 שבועות בחוט השדרה לאחר הזריקה (איור 2 ). באמצעות מיקרוסקופ (Axiovert 100 מ'), קרינה פלואורסצנטית ירוק אות זוהה רקמת שריר, בעמוד השדרה מוטורי לגלוקוז על ידי שיתוף לוקליזציה של ה-GFP, את acetyltransferase כולין סמן מוטור נוירון (צ'אט) 10 שבועות לאחר הטיפול, כאשר העכברים מתחילים להראות ביטויים למחלה (איור 2).
עמית של דירקטוריון SBMA עכברים באמצעות משטר מינון זהה, היה אקראי לקבל גם מיר-298 או ללעוג בגיל שבעה שבועות של גיל באמצעות הזרקת וריד הזנב הביוכימי ניתוח ואפיון פונקציונאלי. הזרקת בעקבות הערכה התנהגותית והמשקל שבועי עד גיל 40 שבועות. ניתוח לרביעיית-PCR הראה כי טיפול מיר-298 מפחית את הרמות של מוטציה AR ברקמות המושפע (איור 3), גדל משקל הגוף, שיפור ביצועי מנוע (איור 4) החל מ- 10 שבועות לאחר ההזרקה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig1.jpg"> איור 1: סכימטי של תכנון המחקר. כדי להגדיל את רמות הביטוי של מיר-298 ויוו, הזרקנו SBMA עכברים עם פלסמיד (A) וקטור AAV יזם כפול לבטא GFP מיר-298 או מעושה. (B) עכברים הוזרקו באמצעות זריקת הזנב-שווא יחיד בגיל שבעה שבועות של גיל (שלב טרום סימפטומטי). חוט השדרה, שריר הארבע ראשי נאספו מעמית של דירקטוריון SBMA עכברים בנקודות זמן שונות עבור ניתוח והפצה רקמת (ירוק). עמית של דירקטוריון SBMA עכברים שטופלו, הקריב בן 16 שבועות של גיל עבור ניתוחים ביוכימי (אדום). משקל, מבחני התנהגות בוצעו מדי שבוע את 40 שבועות של גיל של אפיון פונקציונלי (כחול). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig2.jpg"> איור 2: משלוח AAV9-מיר-298 בעכברים. באמצעות השיטה המתוארת כאן, העכברים קיבלו AAV9-מיר-298-GFP או AAV9-מוק-GFP באמצעות הזרקה תוך ורידי. MiRNA סה כ נאסף מן השדרה המותני, שריר הארבע ראשי-2,4,8 ו- 12 שבועות לאחר ההזרקה. לרביעיית-PCR בוצע כדי להעריך את רמת הביטוי של שריר הארבע ראשי מיר-298 (A) (n = 5) בחוט השדרה המותני (B) (n = 5, P < 0.01). כל הנתונים ידווחו כפי שאומר ± שגיאת התקן אומר. התמרה חושית נרחבת של וקטור AAV ברקמות נקצרו 10 שבועות לאחר הטיפול אושר ע י לוקליזציה של צביעת עבור GFP בשריר הארבע ראשי (C) (הגדלה המקורי, 10 X. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר) ו- (ד) מוטורי לגלוקוז בחוט השדרה המותני (הגדלה המקורי, 40 X. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. GFP (ירוק), צ'אט (אדום) ודאפי (כחול). האיור השתנה מ doi: 10.1038/mt.2016.13. 14 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig3.jpg"> איור 3: MiRNA-298 ביטוי יתר downregulates מוטציה AR חוט השדרה, שריר הארבע ראשי בעכברים. לרביעיית-PCR בוצעה להערכת רמות הביטוי של AR mRNA השדרה המותני (A), שריר הארבע ראשי (B) שטופלו AAV9-מיר-298-GFP או AAV9-מוק-GFP. התעתיק רמות היו מנורמל ל snoRNA202 (n = 5 לכל טיפול). * P < 0.05, * * P < 0.01. כל הנתונים ידווחו כפי שאומר ± תקן שגיאות. האיור השתנה מ doi: 10.1038/mt.2016.13. 14
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig4.jpg"> איור 4: ביטוי יתר של מיר-298 משפר את תפקוד מוטורי ומפחית אובדן משקל. הערכה התנהגותית בוצע פעם בשבוע (w), בין שבוע 5-40. גוף משקל (משמאל), תליית חוט (מימין) ביצועים של עכברים (n = 15 לכל קבוצה). כל הנתונים ידווחו כפי שאומר ± תקן שגיאות. האיור השתנה מ doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Watch this Scientific Journal Video about Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents at JoVE.com

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

כאן נתאר את המסירה של microRNA באמצעות serotype של וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים 9 במודל של עכברים של מחלה עצב-שריר. ניהול היקפיים יחידה בעכברים כתוצאה miRNA מתמשכת ביטוי שריר, מוטורי לגלוקוז, מתן הזדמנות טיפולית פוטנציאל vivo בתוךותפקוד miRNA של המחקר.

משלוח מערכתית של MicroRNA באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-הקשורים Serotype 9 לטיפול מחלות נוירומוסקולריות אצל מכרסמים

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

בעזרת פחמון זקן התירס כמו סוס טרויאני ב באתרו משלוח של תירס חלבונים

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

צינור ביואינפורמטיקה לנתח באופן מדויק ויעיל את המייקרואורפה בצמחים

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

משלוח mRNA שונה במודל לעכבר אוטם שריר הלב

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...