Name: systemic delivery of microrna using recombinant adeno-associated virus serotype 9 to treat neuromuscular diseases in rodents
Uploaded: 2018-08-10T12:30:00
Duration: 6 min 51 s
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저자는 충돌의 관심을 선언합니다. 우리는 AAV9 바이러스 생산을 위한 SignaGen 연구소 (Rockvile, 메릴랜드, 미국) 감사합니다. 이 연구는 NIH NINDS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 필립 R. 리는 사단의 교내 연구의 NICHD에서 기금에 의해 지원 되었다. 카를로 Rinaldi 협회 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM)에서 장학금에 의해 지원 되었다.

모든 절차 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 국가 학회 건강 가이드에 따라 실시 했다 (8 에디션., 국가 아카데미 압박, 개정 2011), NINDS 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1. AAV9-미르 디자인 전략 및 미르 선택
<ol><li>MiRWalk 예측 데이터베이스를 사용 하 여 후보 miRNAs는 mRNA 3' UTR 지역 대상 유전자의 상호 작용을 선택. 15 참고: 최소 7 뉴클레오티드를 최소 씨 미르 시퀀스의 길이 제한 합니다. 비교 분석에 대 한 다른 설립된 미르 예측 프로그램 (미 란다, miRDB, Targetscan)를 선택 합니다. 이러한 선택 기준에 따라, 여기, 미르-185, 미르-298, 미르-873, 및 미르-877 선정 되었다 더 평가 위해.</li>
	<li>MiRBase (http://www.mirbase.org/)에서 선택 된 miRNA의 시퀀스를 검색 합니다.</li>
	<li>Pri-미르 복제 (60-70 국세청) 및 cis 적절 한 AAV에 측면에 서는 모두 양쪽 게놈 시퀀스 또는 모의 시퀀스의 250-300 국세청, 벡터. 참고: 측면에 서 순서는 올바른 pri-미르 표현과 성숙한 예측에 관한 처리에 필요 합니다. 예를 들어 선택한 미르 또는 모의 시퀀스, 인간 신장 요인 1 알파 (EIF1α) 발기인의 구성 된 식 카세트 듀얼 모터 rAAV cis 벡터를 선택 하 고 인간의 세포 (CMV) 발기인 cDNA 인코딩 뒤 GFP 형광 태그입니다. EIFα 모터는 안정적이 고 균질 식, 침묵의 최소한의 위험을 보장 하기 때문에 선택 되었다. 조직의 특정 또는 조건부 발기인, 특정 응용 프로그램에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>준비 하 고 정화, AAV, 다음 게시 프로토콜을 적정 하십시오. 16 참고: 여기는 AAV에 pri-미르의 클로닝 벡터와 바이러스 생산 수행 했다 외부 제조 업체에 의해.</li>
</ol>2. 꼬리 정 맥 주입 AAV 미르 플라스 미드의
참고:이 단계는 대상 유전자와 연령과 마우스의 무게 조정을 해야합니다. 복용량 범위, 볼륨, 나이 및 쥐의 체중에 따라 관리의 최적의 경로 결정 하는 기관 및 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침을 사용 합니다. GFP 형광 신호 및 미르 식 수준 대상 조직에 피크 시작 주사 후 2 주 예상 된다. 다음 프로토콜은 초기 성인 기에 남성 쥐를 말합니다. AAV는 Biosafety 수준 1 지침에 따라 생물 학적으로 처리 되어야 합니다.
<ol><li>버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)를 사용 하 여 (vg/mL) 당 1010-1011 바이러스 성 게놈의 바이러스 부하를 포함 하는 100-200 µ L aliquots에서 AAV 미르 플라스 미드 주식 분할. 실험실 생물 학적 개인 보호 장비는 AAV 솔루션을 처리 하기 위해 사용 되어야 한다. 참고: 한 약 수 해 동 되 면 그것은 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 주 동안. 바이러스 성 주식-80 ° C 냉동 실에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>적절 한 크기의 플라스틱 필름 플라스틱 또는 테이퍼 튜브 같은 상용 restrainers에 마우스를 제 지.</li>
	<li>70% 알코올 잎사귀와 꼬리의 표면 청소.</li>
	<li>30에 대 한 혈관 확장 증가 꼬리 아래 따뜻한 패드 (28-30 ° C)를 개최 또는 s., (2-3 피트의 거리)에 적 열 램프를 사용 하 여 동물을 따뜻한 또는 따뜻한 물으로 꼬리 찍기.</li>
	<li>
꼬리의 원심 부분에서 삽입 바늘 (27-30 G) 바이러스 약 수와 함께 로드, 정 맥으로, 꼬리에서 15 °, 경사. 주입 하기 전에 바늘이 제대로 삽입 확인 합니다.
	<ol>
<li>주입, 동안 저항을 느꼈다 또는 붓기 피부 아래에 나타납니다, 경우 절차를 중지 합니다. 바늘을 제거 하 고 다시 이전 주사 부 위에 바늘을 삽입. 참고: 또는,이 얻을 수 있습니다 부드럽게 바늘을 발음 하 고 혈액을 관찰 하 여. 하드 포부 꼬리 정 맥을 축소 수 있습니다. 정 맥 주입 하는 동안 blanches, 바늘 올바르게 삽입 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주입 완료 후 바늘을 발생 하기 전에 몇 초 동안 기다립니다.</li>
	<li>출혈에 대 한 사출 사이트를 관찰 합니다. 출혈이 중지까지 사이트에 두 손가락을 사용 하 여 적당 한 압력을 적용 합니다.</li>
	<li>그것의 감 금에 있는 동물을 반환 합니다.</li>
</ol>3. 행동 분석 실험
참고: 모든 실험은 맹목적으로 유일 하 게 코딩 된 튜브에 의해 치료의 은폐와 제 3 자에 의해 실시 했다. 치료의 순서를 무작위로 했다. 아래 설명 하는 테스트를 수행할 때 실험 조건 (방의 유형) 및 일의 시간 편차를 줄이기 위해 제어 해야 합니다. 이 테스트는 마우스 신뢰할 수 있는 결과 달성 하기 위해 4 주 이상에서 수행 되어야 합니다. 마우스의 정상적인 성능 기준선을 얻기 위해 나이의 5 주에 바이러스 주입 전에 행동 평가 받았다. 바이러스 주입 후 마우스는 최대 나이 40 주 48 h 주입 후 시작 일주일에 한 번 평가 됐다.
<ol><li>테스트를 시작 하기 전에 잡음 또는 다른 소요 적어도 30 분은 조용 하 고, 어두운 방에 AAV 주사 마우스를 가져와. 순응의이 기간 동안 동물을 방해 하지 마십시오.</li>
	<li>30 분을 위한 새로운 공간에 마우스를 순응 하 고 다음 행동 분석 실험 (3.3 및 3.4 단계)을 시작 합니다. 각 행동 분석 결과 사이 10 분의 간격을 유지 합니다.</li>
	<li>
와이어 테스트를 거 참고:이 테스트 근육 강도 및 모터 역 기능을 모니터링합니다.<ol>
<li>패딩 시트를 사용 하 여 쿠션 역할을. 그것의 꼬리에 의해 마우스를 선택 하 고 와이어 그리드 랙의 중앙에 놓습니다. 랙 표면 위에 15-20 인치를 천천히 조정 화면에 그것의 그립을 동물 수 있도록 화면을 반전.</li>
		<li>랙 완전히 반전 되 면 타이머를 시작 하 고가을 시간 기록. 참고: 마우스 눈금 4 개의 사지와 끊지 것 이다. 와이어는 너무 낮게 설정 되어 쥐 하지 만요 수 있습니다. 쥐 60 전에 그리드에서을 s, 눈금에 다시, 타이머, 리셋 및 2 개의 더 시도까지이 절차를 반복. 최상의 성능을 등록.</li>
		<li>60의 시간 제한 하는 때 s에 도달 하면, 감 금 소 동물 다시 돌아갑니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
발 인쇄 분석 결과 참고: 흡수 성 시트 길고 높은 벽을 5cm 폭 5 c m 좁은 활주로 약 70 cm 이어야 한다.<ol>
<li>한 손으로 마우스를 부드럽게 잡고 고 앞 발을 푸른 잉크 브러시와 뒷 발에 빨간 잉크를 적용 합니다.</li>
		<li>좁은 통로의 바닥에 흡수 성 시트를 놓습니다.</li>
		<li>산책 이나 활주로에 직선에서 흡수 성 시트 한쪽 끝에서 다른 실행 마우스를 수 있습니다.</li>
		<li>신선한 흡수 성 시트를 사용 하 여 마우스와 함께 과정 2 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>앞으로 운동에 두 개의 연속 단계 사이의 거리를 측정 합니다. 먼저 포함 그리고 마지막으로 몇 발자국 어디 동물은 단지 시작 하 고 그것의 실행을 완료 하지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 안락사와 조직 수확
<ol><li>사용 하 여 안락사 챔버 또는 벨 항아리. 벨 항아리를 사용 하는 경우 증기 두건 아래 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>벨 항아리에 배치와 isoflurane와 목화를 담근 다. 동물 마 취 자료와 물리적 접촉에서 유지 하는 물리적 구분 기호를 사용 합니다. 이 단계 후에 즉시 항아리에 동물을 배치 합니다. 참고: 벨 항아리는 미리 hypoxemia는 동물에서의 가능성을 피하기 위해 isoflurane로 기소 해서는 안 됩니다.</li>
	<li>30까지 isoflurane 노출 계속 호흡 중지 후 s.</li>
	<li>항아리에서 마우스를 제거 후 바로 자 궁 경부 전위에 의해 안락사. 참고:이 단계 일어나 야 한다 조직 저하를 피하기 위해 최대한 빨리.</li>
	<li>
척추 코드 처음 수확 한 다음 허벅지 근육 골격 근육.
	<ol>
<li>척수를 수확, 마우스의 뒷면을 노출 하 고 해 부 보드에 4 개의 사지를 수정 합니다.</li>
		<li>70% 에탄올과 해 부의 사이트를 씻어.</li>
		<li>자 궁 경부 전위 날카로운가 위를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
		<li>중간 라인에서 피부에 절 개를 확인 합니다. 절단 또는 피부 및 머리는 펠트를 당겨서 뒤 가로 평면에서의 주의 끊어지고 펠트를 제거 합니다. 양 어깨 아래와 (두개골의 기지에 인접 한 발견) 열 C1-2 지역에서가 위로 절단 하 여 머리를 제거 합니다.<ol>
<li>복 부 측에 복 벽 근육을 잘라내어 옆으로, 척추에 도달할 때까지 한 번에 한 방향으로 계속.</li>
		</ol>
</li>
		<li>자 궁 경부 척수에서 시작 날카로운가 위 제거 척추를 사용 하 여. 양쪽에서 척추 아치에서 절단 하 여 척추의 옆 부분을 제거 합니다.</li>
		<li>전체 척추를 제거 후 척수를 해제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스냅인에서 다음 방법을 사용 하 여 미리 냉장된 2-methylbutane 수확된 조직 고정:
	<ol>
<li>반 2-methylbutane와 스테인리스 그릇을 액체 질소로 채워진 컨테이너에서 그릇의 하단 분기 잠수함.</li>
		<li>중 2-1-2 분에 대 한 액체 질소에 methylbutane 진정.</li>
		<li>흰색 바뀌면 2-methylbutane에 집게와 골격 근육을 놓습니다. 즉시 전송 얼음을 건조 하 고 다음-80 ° c.에 그것을 저장 하는 조직</li>
	</ol>
</li>
	<li>척수 immunostaining에 대 한 설명 된 대로 동결 스냅 전에 실내 온도에 파라핀 블록에 조직을 포함 합니다. 17
</li>
	<li>생 화 확 적인 분석 및 미르 정량화에 대 한1 수확된 조직은 cryovial에 놓고 액체 질소에서 동결 합니다. -80 ° c.에 샘플 저장</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

여기 선택 골격 근육 및 모터 뉴런 쥐에서 바이러스 성 벡터로 rAAV9를 사용 하 여 미르 꼬리 주입을 통해 제공 하 고 접근 방법론을 설명 합니다. 14 다른 RNAi 전략에 비해, miRNAs는 적은 독성과 보다 적게 면역성 있습니다. 18 또한, 그들의 소형 그들 바이러스 성 벡터의 한정 된 포장 용량에 적합 확인 합니다. 2 계산 알고리즘 및 예측 도구 putative 미르 mRNA 표적 식별을 수 있습니다. 일단 확인, 대상 유전자 발현에 미르의 효과 확인 해야 합니다. 일반적인 방법은는 주어진된 미르에 생체 외에서 overexpress 서쪽 분석을 사용 하 여 대상 단백질 식 레벨을 감지 하는 것입니다. 14 , 19
다양 한 연구는 miRNAs 제공 하기 위한 바이러스 성 및 비 바이러스 성 전략을 사용 했습니다. 13 여기 우리가 사용 adeno 관련 바이러스 (AAV) 유전자 납품 공구로. 장기적인 유전자 전송을 허용 다른 바이러스 벡터에 비해, AAV elicits 낮은 immunogenicity 고 분할에 차 있는 굴곡 운동의 광범위 한 스펙트럼 및 비 분열 세포. 18 이 전달 방법 또한 기능 및 RNA 분자의 특이성에 영향을 미칠 수 있는 화학 수정에 대 한 필요를 우회할 수 있습니다. 있다 capsid 단백질의 구성에 의해 주로 결정 된다 AAV의 여러 serotypes. 이러한 serotypes과 그들의 차 있는 굴곡 운동에 다 다른 세포 유형 transduce. 그것은 대상 조직 고려할 때 올바른 serotype를 선택 해야 합니다. 우리는 rAAV9, 중앙 신 경계와 골격 근육 주변 관리19,20다음에 높은 변환 효율성으로 인해을 선택. 이 방법은 신생아 동물 세포 외 기질 성분, 신경 명과 비율 및 성숙 혈액 두뇌 방 벽의 차이로 인해 가능성이 성인 동물에 비해 큰 변환 효능을 보이고 있다. 21 , 22
이 프로토콜에서 중요 한 단계 식 벡터의 디자인입니다. 낮은 표현의 발기인 옆 첫 번째 유전자와 비교 하는 두 번째 유전자에 의해 방해는, bicistronic 벡터에 비해 듀얼 발기인 벡터 수 따라서 miRNA EGFP의 높은 식 저조한 다시 구성 면역 형광 검사 하 여 마우스 조직에는 미르의 지역화를 허용합니다.
AAV9의 정 맥 주입 고효율 및 대상 조직, 골격 근육, 그리고 모터 신경에 균질 성 변환 귀착되는. 주입의이 경로 전신 순환에 도달 하 고 교차 하는 중앙 신 경계를 대상으로 하는 치료를 위한 중요 한 뇌 혈액 장벽 관리 복용량을 수 있습니다. 또한, CNS에 배달에 대 한 비-침략 적 방법입니다. 미르-298 식 나이의 5 주에서 단일 주변 주입으로 2-4 주 후 척수와 근육에 증가 했다. 때 단일 가닥 게놈 AAV 벡터, 두 번째 DNA 가닥의 de novo 종합을 사용 하 여 지연된 변환에 대 한 계정 수 있습니다. 23
인간의 미르-298의 수준 아니었다 치료 쥐에서 감지 단일 관리, 만성 질환에 대 한 여러 주사 치료 혜택을 도달 하는 데 필요한 될 수 있습니다 그 제안 후 20 주. 그러나, 시간이 지남에 미르 저하 평생 반복된 관리 필요한 경우 제한 수 있습니다. 또한, AAV 벡터에 적응 면역 성공적인 유전자 배달에 다른 방 벽을 형성할 수 있다. 24 는 면역학 불활성 AAV 벡터의 따라서 세대 반복 행정과이 유망한 배달 시스템으로 장기 효과 달성에 결정적 이다. 25
치료 전략으로 miRNA의 사용에 제한 대상에서 효과의 위험입니다. MiRNAs는이 방식으로 안전 위험이 다른 유전자 녹취 록과 함께 incomplementary 기본 페어링 통해 상호 작용 수 있습니다. 마이크로 프로세서 복잡 한을 무시 하 고 광범위 한 장기 안전성 및 내성 연구는 중요 한 안전에이 전략을 번역 하기 전에 비 정식 miRNAs, mirtrons, 등의 사용을 포함 하 여 RNAi 시퀀스의 설계 개선 및 효과적인 치료입니다. 26 , 27 , 28
여기 설명 하는 방법을 미르 overexpression를 위해 원래 개발 되었다 그러나 그것은 또한 antagomirs를 사용 하 여 미르 억제 치료에 이용 될 수 있다.

MiRNAs는 비-코딩 RNAs, 21-23 뉴클레오티드 길이, 유전자 발현의 규칙 및 다양 한 셀룰러 및 대사 경로의 제어에 중요 한 역할을. 1 유전자 발현 post-transcriptional 유전자 침묵 또는 mRNA 분해를 유도 의해 주로 통제 된다. 2 MiRNAs는 일반적으로 3' 되지 않은 지역 (UTR) 5' UTR에 바인딩 하지만 유전자, 코딩 및 코딩 mRNA 설명도 대상의 영역을 보완. 3
현재 인간의 질병의 병 인에서 miRNA의 역할 이해 확장, 개별 miRNAs 또는 미르 가족의 약리 변조 가능한 치료 옵션 점점 되고있다. 다른 RNA 억제 전략에 비해, miRNAs는 많은 이점이 있다: miRNAs는 적은 독성과 보다 적게 면역성 및 전달 될 수 쉽게 셀에 그들의 작은 크기 때문에. 4 , 5 , 6 MiRNAs 일반적으로 있고 셀룰러 네트워크 내의 많은 대상 따라서 잠재적인 대상 오프 효과 고려 되어야, 효율적인 배달 대상 조직에 함께 하는 데 필요한 안전 관심사.
신경 근육 학 질병 인수 하거나 근육 및 모터 신경에 영향을 주는 조건을 상속 합니다. 골격 근육에 약물을 대상으로 한 신흥 지역 연구의 주요 과제 치료 창 내에서 광범위 한 배포를 달성 하기 위해입니다. 7 모터 신경은 주로 하기 때문에 마약 사용은 혈액 뇌 장벽에 의해 배제 대상, 더 어렵습니다.
척추과 안구 근육 위축 (SBMA)의 세포 문화와 마우스 모델은이 연구에 사용 되었다. SBMA 있는 근육과 운동 신경 영향을 받는 함수 메커니즘의 독성 증가 의해 발생 하는 신경 근육 학 질병 이다. 8 , 9 SBMA (케네디의 질병; OMIM #313200)는 X 연결 된 질병, 근육의 약점에 의해 특징 및 위축, 아칸소 단백질에 확장된 polyglutamine로 인코딩하는 AR 유전자의 CAG 반복 확장으로 인 한. 10 질병 수정 치료는 현재이 장애에 대 한 합니다. 이 연구에 사용 된 유전자 변형 마우스 모델이 질병, 성별 특이성, 모터 신경 병리학, 진보적인 근육 위축 등의 기능. 11
이 연구에서 우리의 노력에 초점을 맞춘 한 미르 식별을 직접 downregulates 식 돌연변이 아칸소 transgene의 및 척수에 미르의 배달 및 우리의 질병 마우스 모델의 골격 근육의 안전 하 고 효율적인 모드 설계에.
여기 우리는 비교적 새롭거나 미르, 미르-298 (승인 번호 MIMAT0004901), 직접 SBMA 모델에 돌연변이 아칸소 식을 줄이기 위해12 확인. 대상 조직에 미르-298의 납품을 달성 하기 위하여 우리는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9 (rAAV9)와 함께 바이러스 전략 사용. rAAV9는 혈액 두뇌 방 벽을 교차 하 고 신경 세포를 포함 하 여 분할 되지 않은 셀에 장기 유전자 발현을 중재 수 있습니다. 13 AAV9-미르-298의 단일 조직 행정 결과 미르, 근육 및 모터 신경의 효율적인 변환, 다운-아칸소 식의 규정과 SBMA 쥐에 있는 질병 표현 형의 개량의 지속적인된 표현. 14 미르 또는 antagomirs overexpression에서 vivo에서제공 하는이 방법을 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Purification of miRNA and total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>snoRNA202 Primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1232</td>
			<td>Taqman miRNA control assay in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miR-298 Primer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2190</td>
			<td>Taqman miRNA-298 assay in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td>Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red ink pad</td>
			<td>Dovecraft Essentials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue ink pad</td>
			<td>Dovecraft Essentials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-GFP vector</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100840</td>
			<td>Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmu-miR-298-5p</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MC12525</td>
			<td>mirVana miRNA mimic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP</td>
			<td>Vector Biosystems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systemic delivery of microrna using recombinant adeno-associated virus serotype 9 to treat neuromuscular diseases in rodents

내 생 미르 통로 통해 RNA 간섭 post-transcriptional 유전자 입을 통해 단백질 합성을 조절 하 여 유전자 발현을 통제 한다. 최근 몇 년 동안, 중재 하는 miRNA 유전자 규칙으로 기능 메커니즘의 독성 이득으로 인 한 신경 성 질환의 치료에 대 한 잠재적인 나타났습니다. 그러나, 대상 조직에 효율적인 배달 응용 프로그램을 제한 했다. 여기 우리 척추과 안구 근육 위축 (SBMA) 유전자 변형 마우스 모델 사용, 신경 근육 학 질병에에서 의해 발생 polyglutamine 확장 androgen 수용 체 (아칸소 주), 유전자 침묵에 의해 테스트 하는 새로 확인 된 아칸소 타겟팅 미르, 미르-298. 우리 overexpressed 미르-298 비 분할 셀의 변환 용이 하 게 하는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) serotype 9 벡터를 사용 하 여. SBMA 쥐에서 단일 꼬리 정 맥 주입 미르-298 골격 근육에 모터 신경의 지속적이 고 광범위 한 overexpression를 유도 하 고 쥐에서 신경 근육 학 형의 개량 결과.

AAV9-미르-298의 1011 vg의 바이러스 부하 5 주 된 SBMA 쥐로 단일 꼬리 정 맥 주사를 통해 주입 했다. 이러한 마우스 비정상적으로 확장 된 polyglutamine로 ar (AR97Q)와 인간의 아칸소 transgene 고 연령 (체중 감소, 돌출된 다시, 그리고 근육 위축) 10 주 신경 근육 학 질병의 징후를 개발. 11 요 추 척수 및 quadriceps 근육 미르 정량화, 생 화 확 적인 분석 결과 및 immunohistochemistry (그림 1)에 대 한 관리 후 2, 4, 8, 12 주에 수확 했다. 치료 및 후속 분석 관리는 멀게 조사자에 의해 수행 되었습니다.
qRT-PCR 분석 피크 식 레벨 골격 근육에서 및 척수 주사 (그림 2 후에 12 주 8 주에 각각, 골격 근육 및 척수 2 주와 4 주 치료 후에 미르-298 식 보였다 ). 현미경 (Axiovert 100 M)를 사용 하 여, 녹색 형광 신호 했다 척추 모터 신경 및 근육 조직에 의해 감지 GFP의 모터 신경 마커 콜린 acetyltransferase (채팅) 치료, 쥐 쇼 시작 후 10 주 공동 지역화 질병 발현 (그림 2)
동일한 복용량 처방을 사용 하 여, SBMA 마우스의 코 호트 중 미르-298를 받거나 생화학 분석 및 기능 특성에 대 한 꼬리 정 맥 주입을 통해 나이의 7 주에 모의를 무작위로 했다. 주입은 시대의 40 주 주간 체중 및 행동 평가에 선행 되었다. qRT-PCR 분석은 미르-298 치료 (그림 3), 영향을 받는 조직에 돌연변이 AR의 레벨을 감소 체중 증가 및 향상 된 모터 성능 (그림 4) 주사 후 10 주에 시작 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig1.jpg"> 그림 1: 연구 디자인의 도식. 미르-298 vivo에서 의 식 수준을 높이려면 우리 GFP 미르-298 및 모의 표현 (A) 이중 발기인 AAV 벡터 플라스 미드와 SBMA 쥐를 주입. (B) 마우스는 연령 (사전 증상 단계)의 7 주에 단일 꼬리 헛된 주사를 통해 주입 했다. 척추 및 quadriceps 근육 조직 분포 분석 (녹색)에 대 한 다른 시간 지점에서 SBMA 마우스의 코 호트에서 수집 되었다. SBMA 마우스의 코 호트 취급 하 고 생 화 확 적인 분석 (빨간색)에 대 한 나이의 16 주에 희생 되었다. 무게와 행동 분석 수행 했다 주간 최대의 기능적 특성 (파란색) 나이 40 주. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig2.jpg"> 그림 2: 쥐에 AAV9-미르-298 배달. 여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 마우스 받았다 AAV9-미르-298-GFP 또는 AAV9-모의-GFP 정 맥 주사를 통해. 총 미르 요 추 척수와 2,4,8 및 주입 후 12 주에 quadriceps 근육에서 수집 되었다. qRT-PCR 식 수준 (A) 미르-298 quadriceps 근육의 추정을 수행한 (n = 5) (B) 요 추 척수 (n = 5, P < 0.01). 모든 데이터는 ± 표준 오차 평균을 수단으로 보고 됩니다. 10 주 치료 (C) quadriceps 근육 (원래 확대, 10 X에에서 GFP에 대 한 얼룩의 지역화에 의해 확인 되었다 후에 수확 하는 조직에서 AAV 벡터의 광범위 한 변환. 눈금 막대 = 100 µ m)과 요 추 척수 (원래 확대, 40 X에에서 (D) 모터 신경. 눈금 막대 = 10 µ m. GFP (녹색), 채팅 (레드)와 DAPI (파란색). 그림도이에서 수정 되었습니다: 10.1038/mt.2016.13. 14 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig3.jpg"> 그림 3: 미르-298-식 downregulates 돌연변이 아칸소 척추 및 quadriceps 근육에 쥐에. qRT-PCR 추정 식 (A) 요 추 척수와 AAV9-미르-298-GFP 또는 AAV9-모의-GFP 치료 (B) quadriceps 근육에 아칸소 mRNA의 레벨에 수행 되었다. 대 본 수준 snoRNA202로 표준화 되었다 (n = 치료 당 5). * P < 0.05, * * P < 0.01. 모든 데이터는 ± 표준 오류를 수단으로 보고 됩니다. 그림도이에서 수정 되었습니다: 10.1038/mt.2016.13. 14
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig4.jpg"> 그림 4: 미르-298-식 모터 기능 향상과 체중 감소. 행동 평가 일주일에 한 번 (w), 주 5 ~ 40 사이 수행 되었다. 몸 무게 (왼쪽)와 거 쥐의 와이어 (오른쪽) 성능 (n = 그룹 당 15). 모든 데이터는 ± 표준 오류를 수단으로 보고 됩니다. 그림도이에서 수정 되었습니다: 10.1038/mt.2016.13. 14

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Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

여기는 신경 근육 학 질병 마우스 모델에서 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한의 배달에 설명 합니다. 쥐에서 단일 주변 관리 연구 미르 기능과 치료 가능성 비보수 있는 기회를 제공 하는 모터 신경 및 근육에 지속적인된 미르 overexpression 귀착되는.

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

연구

유전학

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

원래의 배달 옥수수 단백질에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 사용 하

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

식물의 MicroRNA 전사체를 정확하고 효율적으로 분석하는 생물정보학 파이프라인

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

심근 경색 마우스 모델에서 수정된 mRNA의 납품

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...