Name: the optical fractionator technique to estimate cell numbers in a rat model of electroconvulsive therapy
Uploaded: 2017-07-09T13:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy at JoVE.com

نشكر سوزان سورنسن على المساعدة التقنية الماهرة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة فيلوكس؛ مؤسسة جاشا. مؤسسة آيس وإجنار دانيلسنس؛ مؤسسة هارتمان براذرز؛ مدير جاكوب مادسن وزوجة أولغا مادسنز مؤسسة؛ الطبيب سوفوس كارل اميل فريس وزوجة دوريس فريس &#39;الثقة؛ مؤسسة 1870؛ توربين ومؤسسة أليس فريمودتس ومؤسسة البحوث العصبية. تم إجراء تحرير المخطوطة بواسطة إنجلوود بيوميديكال إديتينغ.

<ol>
	<li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+Introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to stereology. 2012 (8), 843-851 (2012).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+methods+for+estimating+the+total+number+of+neurons+and+synapses:+issues+of+precision+and+bias.">Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias.</a> Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).</li><li>Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+hippocampal+structural+changes+following+electroconvulsive+seizure+treatment+in+a+rat+model+of+depression.">Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression.</a> Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).</li><li>Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+electroconvulsive+seizures+increase+the+total+number+of+synapses+in+adult+male+rat+hippocampus.">Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Ki&#235;u, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+-+reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered.</a> J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+based+stereological+methods+for+estimating+the+total+number+of+objects+in+histological+material.">Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material.</a> Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).</li><li>Olesen, M. V., W&#246;rtwein, G., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroconvulsive+stimulation,+but+not+chronic+restraint+stress,+causes+structural+alterations+in+adult+rat+hippocampus+-+a+stereological+study.">Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study.</a> Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).</li><li>Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroconvulsive+stimulation+results+in+long-term+survival+of+newly+generated+hippocampal+neurons+in+rats.">Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats.</a> Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).</li><li>Madsen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+neurogenesis+in+a+model+of+electroconvulsive+therapy.">Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy.</a> Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).</li><li>Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+produces+a+large+pool+of+new+granule+cells+in+the+dentate+gyrus.">Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.</a> J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size.">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).</li><li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+straightforward+and+rigorous+methods+of+counting+neurons+based+on+a+computer+simulation+approach.">Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach.</a> J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1986).</li><li>Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+determination+and+long-term+persistence+of+adult-generated+new+neurons+in+the+hippocampus+of+mice.">Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice.</a> Development. 130 (2), 391-399 (2003).</li><li>Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+maternal+separation+on+adult+mouse+behaviour+and+on+the+total+neuron+number+in+the+mouse+hippocampus.">The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus.</a> Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+and+neuron+number+of+the+lateral+geniculate+nucleus+in+schizophrenia+and+mood+disorders.">Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders.</a> Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).</li><li>Eriksen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+stereological+estimates+in+patients+with+severe+head+injuries+using+CT+and+MR+scanning+images.">Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images.</a> Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).</li><li>Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereology:+the+fast+lane+between+neuroanatomy+and+brain+function--or+still+only+a+tightrope?.">Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope?.</a> Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

باستخدام إكس كمنهج للحث على تكوين الخلايا العصبية، نجد زيادة فورية من 260٪ في تشكيل الخلايا العصبية إيجابية بردو جديدة في الحصين. في هذه المجموعة من الخلايا العصبية ولدت بشكل حاد وجدنا 40٪ الاستنزاف من يوم 1 إلى ثلاثة أشهر، مع ما يقرب من 50٪ من الخلايا العصبية التي شكلت حديثا على قيد الحياة بعد 12 شهرا على الأقل بعد العلاج 10 ، 11 . وتبع فرز الخلايا العصبية التي تحمل اسم بردو مخطط أخذ عينات صارم، حيث تم تقطيع الحصين بالكامل إلى أقسام سميكة بسمك 80 ميكرون، يليها أخذ عينات فرعية من كل قسم 5 مع بدء أخذ العينات عشوائيا بين القسم الأول والجزء الخامس. يتم اختيار هذه الأقسام بطريقة عشوائية منهجية، وهذا هو طريقة ممتازة للحد من التباين في النتيجة النهائية، دون عد شامل 1 . هذا مخطط أخذ العينات سمح لنا لحساب الخلايا العصبية إيجابية بردو في متوسط ​​12 (8-16) هيبوكامبآل أقسام في كل دماغ الفئران، مع الدقة النهائية من 9-11٪. عند استخدام طريقة الكسور، فمن الضروري أن تعرف جزء من ارتفاع القسم الذي يتم تنفيذ العد، منذ انكماش الأنسجة وتشوه يحدث في كثير من الأحيان أثناء معالجة النسيجية 14 . في الواقع، رأينا انكماش كبير في سمك في هذه الدراسة. وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن انكماش الأنسجة التفاضلية قد تحدث، كما هو موضح في دورف-بيترسن وآخرون. 2001. ومع ذلك، طالما أن هيكل كامل من الفائدة متاح للتحليل، وهذه القيود لا يؤدي إلى التحيز من العدد الإجمالي للجسيمات، أي الخلايا العصبية إيجابية بردو. في الدراسات حيث انكماش الأنسجة هو قضية معينة، فإنه ينبغي دائما أن يذكر أن يتم الحصول على النتائج في الأنسجة المشوهة. في هذه الدراسة، ونحن تحسب في ارتفاع كاشف من 10 ميكرون. كان لأقسام هذه الدراسة سمك متوسط ​​نهائي قدره 26 ميكرون، 5 ميكرونمنطقة الحراسة في الجزء العلوي و 11 ميكرون (متوسط) منطقة الحراسة في الجزء السفلي من القسم. هذه المعلمات مقبولة لأن مناطق الحراسة يجب أن تكون تقريبا قطر الجسيمات العينة. بعد تحديد غكل / سغز، تم وضع المتفجرات عشوائيا بشكل موحد داخل المنطقة المحددة. يجب أن يتم وضع المفتشين بطول خط ثابت يحسن من أخذ العينات والعد للحصول على تقديرات فعالة بدقة يحددها المحقق. يتم تحقيق الدقة المثلى عادة من خلال عد ما يصل إلى 150-200 الخلايا في كل هيكل من الفائدة 5 . في هذه الدراسة، عدنا متوسط ​​133 (المدى 33-372) الخلايا العصبية إيجابية بردو في كل الحصين الفئران. وبسبب انخفاض أعداد الخلايا في بعض حيوانات السيطرة، انخفضت أعدادنا من الخلايا العصبية الإيجابية بردو تحت العدد المقبول عموما من الخلايا المطلوبة للحصول على دقة مناسبة، مما أدى إلى قيم سي عالية نسبيا لتلك الحالات. Hكما أننا حصلنا على قيم سي أقل من نصف قيم السيرة الذاتية (انظر قسم نتائج الممثل) لم تكن هناك حاجة إلى أخذ العينات والعد إضافية. وتبين القيم العالية كف أن أكبر مساهم في الاختلاف الملحوظ ينبع من الاختلاف البيولوجي. في الواقع، يمكننا أن نؤكد أن متوسط ​​عدد الخلايا العصبية الإيجابية بردو في هذه الدراسة كان أعلى من اللازم. على سبيل المثال، في مجموعة واحدة من الفئران حققنا قيمة سي-9٪، ولاحظت قيمة كف-43٪. في هذه الحالة بالذات، كنا يمكن أن تهدف إلى دقة حوالي 20٪. وباختصار، فإن دقة العدد الإجمالي للخلايا العصبية إيجابية بردو في هذه الدراسة كافية في أنه يلتقط آثار العلاج الحقيقي على الأرقام الحقيقية للجسيمات. وبسبب التباين البيولوجي الكبير نوعا ما في مجموعات معينة من الحيوانات، كان من الممكن الحصول على التقديرات نفسها بدقة مقبولة، على الرغم من انخفاض الجهد المبذول. لا يمكن إلا أن الفروق البيولوجية العالية داخل المجموعاتيتم تعويضهم عن طريق زيادة عدد الحيوانات. يمكن للمرء أن يجادل بأن المعيار الذهبي للحصول على أرقام الخلايا الدقيقة يستتبع عد شامل لجميع الكائنات ذات الاهتمام. ومع ذلك، في معظم الدراسات من الدماغ هذا ليس احتمالا بسبب الأعداد الهائلة من الخلايا. على الرغم من أن أكثر كفاءة من العد الخلايا شاملة، وكسر اختياري هو مضيعة للوقت نسبيا بالمقارنة مع الفرز بسيطة من الاختلافات في أرقام الخلايا التي يفضل إذا كان عدد دقيق من الخلايا ليست ضرورية. ومن خبرتنا أن الاختلافات في أكثر من 20-30٪ يمكن الكشف عنها بحتة من خلال إجراءات الفرز. إذا أجريت بشكل صحيح، وأخذ العينات باستخدام علم التجميع القائم على التصميم يوفر تقديرات غير منحازة ودقيقة بطريقة فعالة 1 . الملكية غير منحازة من علم التنجيم تنتج التقديرات التي، عند تكرارها، تقريب المتوسط ​​السكاني الحقيقي، وتعزيز استنساختقدير 21 . في البداية، يجب الحصول على عينة تمثيلية من هيكل كامل من الفائدة (في هذه الدراسة الحصين غكل / سغز)، مما يسمح للتقدير في مجموعة فرعية صحيحة إحصائيا من الأقسام 4 . للحصول على عدد مناسب من الأقسام وتحقيقات العد نطبق سورس، مما يقلل من التباين مقارنة مع العينات العشوائية 8 . وعلاوة على ذلك، يضمن سورس أن الجسيمات ذات الاهتمام داخل الهيكل يتم أخذ العينات مع نفس الاحتمالات، بغض النظر عن حجمها وشكلها وتوجهها وتوزيعها في الهيكل. وینبغي أن یوصى بھذا التجسید بشدة عندما یكون الحصول على تقدیرات دقیقة وغیر منحازة جانبا محوريا من جوانب المشروع.

وقد يتطلب التحديد الكمي للخلايا في هيكل ثلاثي الأبعاد (3-D) الحصول على تقديرات تستند إلى مبادئ غير متحيزة. وحتى اليوم، كثيرا ما تستخدم الدراسات أساليب ثنائية الأبعاد (2-D) للإبلاغ عن بيانات الهياكل ثلاثية الأبعاد. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا تأخذ في الاعتبار الطبيعة غير المتجانسة للهيكل من حيث شكل وتوزيع الخلايا مما أدى إلى قيود منهجية؛ فإنها تجعل افتراضات حول هيكل 3-D من الفائدة والنتائج لا تشير إلى هيكل كامل. هذه القيود تقلل من حساسية ودقة الطرق وكذلك زيادة مخاطر الأخطاء 1 . التحيز في عد الخلايا يمكن تجنبها من خلال تطبيق علم التجميع القائم على التصميم، وهو أمر ذو أهمية عامة للحصول على معلومات كمية حول عدد الخلايا في نسيج معين أو هيكل معين. في حين أن علم التجسس كان سابقا طريقة تستغرق وقتا طويلا جدا، والتقدم في الإجراءات، لينةوير والتصوير، جعلت تصبح أكثر كفاءة وعلى نطاق واسع المعمول بها. ويستتبع علم التجسيم مبادئ أخذ العينات الإحصائية والنظرية الهندسية العشوائية لتوفير أدوات فعالة لتقدير الحجم ومساحة السطح والطول وعدد الأجسام في بنية ثلاثية الأبعاد عن طريق أخذ العينات في الأقسام 2 -D 2 . وهكذا، يسمح علم التجسيم واحد للحصول على بيانات كمية غير منحازة على التغييرات الهيكلية في أقسام الأنسجة، والتي تعطي متوسط ​​تقديرات الأرقام الحقيقية، دون تحليل شامل 1 . ويعرف علم التجسس بأنه الاستدلال الإحصائي للمعلمات الهندسية من المعلومات المأخوذة من العينات. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق أخذ عينات غير منحازة، أي أخذ العينات العشوائية المنهجية، من الأقسام وكذلك قواعد العد التي تضمن أن جميع الكائنات لها احتمالات متساوية للعد 3 . في حين أن النتائج المجسمة يمكن أن يكون درجات متفاوتة من الدقة كما هو مبين من معامل الخطأ (سي)، وهذا يمكن أن يكون الإعلانمبرر لتناسب التباين البيولوجي المتأصل (معامل التباين (كف)) عن طريق ضبط كمية العينات كما هو مطلوب 4 ، 5 . وقد درس عدد قليل من الدراسات المجسمة السابقة الآثار على المدى القصير من التحفيز الكهربائي (إكس) على اللدونة الحصين في القوارض 6،7 . البيانات من هذه الدراسات تظهر زيادة أولية في العدد الإجمالي للخلايا العصبية وكذلك ارتفاع التمايز متشابك بعد إكس المتكررة. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات لا تقدر تكوين الخلايا العصبية مباشرة، لأنها لا تستخدم علامات محددة لانتشار الخلايا. هنا نقدم تطبيق طريقة مجسمة، تقنية الكسور البصرية 8 ، 9 ، لقياس العدد الإجمالي للخلايا العصبية التي شكلت حديثا في الفئران الحصين طبقة الخلايا الحبيبية (غكل)، بما في ذلك منطقة شبه الحبيبية (سغز) وكذلك كما طويلة الأجل sبرف 10 ، 11 . اخضعنا الفئران لجدول زمني السريرية ذات الصلة من إكس (ثلاث مرات في الأسبوع لمدة 3 أسابيع)، والتي هي واحدة من المحفزات أقوى من الخلايا العصبية 12 . تم التعامل مع الحيوانات السيطرة باستخدام نفس الإجراء، ولكن من دون تمرير الحالي. في كل من 21 يوما من التجارب، تم حقن جميع الفئران داخل البريتون مع 5 برومو-2`-ديوكسيوريدين (بردو) الذي يدمج في الحمض النووي بدلا من ثيميدين خلال انقسام الخلايا 13 . بعد التجارب، تم الحفاظ على الفئران لمدة أربع فترات زمنية مختلفة (24 ساعة، 3 أشهر، 6 أشهر و 12 شهرا). باستخدام مبدأ الكسور، حصلنا على جزء معروف من الحصين من خلال أخذ العينات العشوائية موحدة من المقاطع، وتطبيق ديساكتورس البصرية (3-D تحقيقات) لأقسام الأنسجة سميكة و إمونوستيند. ومن الملاحظ بوجه خاص أن المقاطع المجمدة عادة ما تنهار في محور z أثناء العملية، وأنه ينبغي استخدام أجهزة الكشف البصرية استنادا إلى سمك القسم المتوسط ​​المرجح في هذه الحالة بالذات 14 . كما تم نقل الطائرة البؤرية من أجهزة الكشف البصرية مسافة معروفة أسفل من خلال القسم، وحصبت الخلايا العصبية إيجابية بردو عندما تم التعرف على سمة من سماتها بوضوح. في مجال علم التجسيم هناك بعض الجدل حول العدد الإجمالي للجسيمات التي ينبغي أن تحسب 15 ؛ وعادة ما تحسب 150-200 الخلايا العصبية في هيكل الفائدة للحصول على دقة كافية أي معامل 7-8٪ 8 . تم الانتهاء من التهم العصبية إيجابية بردو باستخدام البرمجيات المجسمة مع التصوير من قبل المجهر القياسية مجهزة الكاميرا والأهداف التالية: 2X، 4X و 10X وكذلك 100X الهدف الغمر النفط (فتحة العددية = 1.40)، ومرحلة الآلية . تم قياس الحركات في الاتجاه Z مع ميكروكاتور الرقمية. التكبير النهائيكان 3000X.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-bromo-2&#39;deoxyuridine - BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>19-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td>Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoprotectant</td>
			<td>Capital Region Pharmacy, DK</td>
			<td>861334</td>
			<td>Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M);&#160; ethylenglycol; demineralized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Capital Region Pharmacy, DK</td>
			<td>817205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine &#8211; DAB</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision-HRP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K4001</td>
			<td>Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 70 %</td>
			<td>Plum A/S</td>
			<td>201098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 96 %</td>
			<td>Plum A/S</td>
			<td>201104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 99.9 %</td>
			<td>Plum A/S</td>
			<td>201111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>BI-04-003-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 30%</td>
			<td>Capital Region Pharmacy, DK</td>
			<td>896456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>6081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-anti-BrdU</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>347580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Capital Region Pharmacy, DK</td>
			<td>853436</td>
			<td>pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28,794,295</td>
			<td>pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer&#160;</td>
			<td>Capital Region Pharmacy, DK</td>
			<td>866533</td>
			<td>0.1 mol/l, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid drying mounting medium</td>
			<td>Histolab Products AB</td>
			<td>801</td>
			<td>Pertex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Tetraborate</td>
			<td>Merck A/S</td>
			<td>1,063,080,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck A/S</td>
			<td>1,076,515,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck A/S</td>
			<td>1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28,973,363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td>24x50 mm #0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microcator</td>
			<td>Heidenhain</td>
			<td>VRZ 401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dishes</td>
			<td>Brain Resaerch Laboratories</td>
			<td>1256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>SuperFrost+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>H101A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidish Containers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6315-1CS</td>
			<td>&#160;Nuclon 12-wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New-Cast software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td>ver. 4.5.6.440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 2x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan UW 2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Fluor 4X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 10x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Fluor 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100x oil immersion</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil</td>
			<td>Numerical aperture 1.40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Gemini BV</td>
			<td>CM-9</td>
			<td>Sarstedt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide rack</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dishes</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14037008637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining nets</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>2512</td>
			<td>25-wells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the optical fractionator technique to estimate cell numbers in a rat model of electroconvulsive therapy

تم تصميم الطرق المجسمة لوصف المعلمات الكمية دون افتراضات حول حجم وشكل وتوجيه وتوزيع الخلايا أو الهياكل. وكانت هذه الأساليب ثورية للتحليل الكمي للدماغ الثدييات، حيث السكان الخلية الحجمي مرتفعة جدا للعد يدويا، وعلم التجسيم هو الآن الأسلوب المفضل كلما تقديرات الكميات ثلاثية الأبعاد تحتاج إلى أن تستخرج من القياسات على ثنائي الأبعاد أقسام. جميع الأساليب المجسمة هي من حيث المبدأ غير منحازة. ومع ذلك، فإنها تعتمد على المعرفة المناسبة حول هيكل الفائدة وخصائص الأنسجة. ويستند علم التجسس على منهجية عشوائية عشوائيا أخذ العينات (سورس)، مع تعديل أخذ العينات إلى المستوى الأكثر كفاءة فيما يتعلق الدقة، وتوفير معلومات موثوقة وكمية عن هيكل كامل من الفائدة. هنا نقدم الكسور البصرية بالتزامن مع بردو المناعية تيo تقدير إنتاج وبقاء الخلايا العصبية التي شكلت حديثا في طبقة الخلايا الحبيبية (بما في ذلك المنطقة الفرعية الحبيبية) من الحصين الفئران التالية التحفيز الكهربائي، الذي هو من بين المحفزات أقوى من الخلايا العصبية. تم تصميم تقنية الكسور البصرية لتوفير تقديرات من إجمالي عدد الخلايا من أقسام سميكة عينات من الهيكل الكامل. أقسام سميكة توفر الفرصة لمراقبة الخلايا في كامل 3-D مدى وبالتالي، تسمح لتصنيف الخلايا سهلة وقوية على أساس المعايير المورفولوجية. عندما تنفذ بشكل صحيح، وحساسية وكفاءة المفرق البصري يوفر تقديرات دقيقة مع دقة ثابتة ومحددة سلفا.

معايير أخذ العينات من خلال تحليل توزيع Z في دراسة تجريبية ( الشكل 3 )، وجدنا توزيع موحد للخلايا العصبية إيجابية بردو في ارتفاع المفتش. تم قياس انكماش الأقسام. وكان متوسط ​​سمك النهائي 26.4 ميكرون (19.0-32.0 ميكرون) في أقسام قطع أصلا في 80 ميكرون. استنادا إلى سمك الأنسجة وتوزيع بردو المسمى الخلايا العصبية تم تعيين ارتفاع المشبك إلى 10 ميكرون، والمناطق الحرس في الجزء العلوي والسفلي من القسم تم تعيين إلى 5 ميكرون و4-17 ميكرون على التوالي. اعتمادا على كثافة الخلايا، كانت مساحة إطارات العد 1414 أو 5210 ميكرون 2 . كان طول الخطوة 220 ميكرون في كل من الاتجاهين س و ص وتم إجراء عد الخلايا في معدل 12 (نطاق 8-16) أقسام لكل حيوان. أدت هذه المعلمات أخذ العينات في المتوسط ​​من 133 (مجموعة 33-372) بردوخلايا -positive تحسب في 173 (107-204) ديساكتورس في كل نصف الكرة المخ. على سبيل المثال، حصلنا على القيم التالية كف و سي ل بردو إيجابية تقديرات الخلايا العصبية في إكس الجرذان تعامل: 24 ساعة: كف = 0.59، سي = 0.11؛ 3 أشهر: كف = 0.34، سي = 0.12؛ 6 أشهر: كف = 0.43، سي = 0.09؛ 12 شهرا: كف = 0.22، سي = 0.09. نحن كميا العدد الإجمالي للخلايا العصبية التي شكلت حديثا والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل في الحصين الفئران التالية إكس باستخدام الكسور البصرية بالتزامن مع تقنية تلطيخ بردو 10 ، 11 . وأظهرت النتائج النهائية وجود الخلايا العصبية القاعدية في المجموعات الأربع من الحيوانات السيطرة، والتي لم تختلف اختلافا كبيرا بوصفها وظيفة من الوقت البقاء على قيد الحياة ( الشكل 3 ). وعلاوة على ذلك، تسببت إكس زيادة كبيرة في العدد الإجمالي للخلايا العصبية إيجابية بردو في 24(259٪، p &lt;0.0001)، 3 (229٪، p &lt;0.001)، 6 (152٪، p &lt;0.05) و 12 شهرا (162٪، p &lt;0.05) بعد التجريب، بالمقارنة مع حيوانات التحكم. <img alt="الشكل 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55737/55737fig3.jpg" /> الشكل 3: البيانات الكمية من العدد الإجمالي للخلايا العصبية إيجابية بردو في غكل / سغز من الحصين الفئران 10 ، 11 . وتمثل الحانات الأفقية القيم المتوسطة. الاختصارات: غكل، طبقة الخلايا الحبيبية؛ سغز، المنطقة الفرعية الحبيبية. ساعة، ساعات؛ م، أشهر. **** p &lt;0.0001، *** p &lt;0.001 و * p &lt;0.05 مقابل السيطرة (ن = 11-12 لكل مجموعة). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55737/55737fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy at JoVE.com

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

هنا، نقدم طريقة مجسمة، المجزئ البصري، وتستخدم لتحديد تشكيل الخلايا العصبية الجديدة، وبقائهم على قيد الحياة، في الحصين الفئران التالية التحفيز إليكتركونفولزيف. عندما تنفذ بشكل صحيح، حساسية وكفاءة الطرق المجسمة يضمن تقديرات دقيقة مع دقة ثابتة محددة سلفا.

تقنية الكسور البصرية لتقدير أرقام الخلايا في نموذج الجرذ من العلاج إليكتروكونفولزيف

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

تطبيق المواصلة NMDA مستقبلات الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط ​​الجرذ الدوبامينية باستخدام تقنية المشبك الحيوي

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

البصري مستدعى تسجيل المحتملين في نموذج الفئران التجريبية العصب البصري إزالة الميالين

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

استخدام الاشراط الكلاسيكي اييبلينك تتبع لتقييم هيبوكامبال الخلل في نموذج الفئران من اضطرابات طيف الكحول الجنيني

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

ستيريولوجيكال تقدير عدد الخلايا العصبية تتميز في أسود الدماغ الماوس باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ومعدات مجهرية القياسية

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

Biodegradable Magnesium Stent Treatment of Saccular Aneurysms in a Rat Model - Introduction of the Surgical Technique

العلاج تركيب دعامات المغنيسيوم للتحلل من الكييس تمدد الأوعية الدموية في نموذج الفئران-الأخذ بالأسلوب الجراحي

The steady progess in the armamentarium of techniques available for endovascular treatment of intracranial aneurysms requires affordable and reproducable ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

جراحة الأعصاب الوجه في نموذج الفئران لدراسة تثبيط أكسونال وتجديد

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

نهج Benchtop لموقع محدد فتح حاجز الدم الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة في نموذج الفئران

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...