Name: the optical fractionator technique to estimate cell numbers in a rat model of electroconvulsive therapy
Uploaded: 2017-07-09T13:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy at JoVE.com

אנו מודים לסוזאן סורנסן על סיוע טכני מיומן. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן הקרן ולוקס; קרן יאשה; קרן Aase ו Ejnar Danielsens; קרן האחים הרטמן; הבמאי יעקב מדסן ואשתו אולגה מאדנס קרן; דוקטור סופוס קרל אמיל פריס ואשתו דוריס פריס &#39;אמון; קרן 1870; קרן Torben ו- Alice Frimodts והקרן למחקר נוירולוגי. עריכה של כתב היד בוצעה על ידי Inglewood Biomedical Editing.

<ol>
	<li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+Introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to stereology. 2012 (8), 843-851 (2012).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+methods+for+estimating+the+total+number+of+neurons+and+synapses:+issues+of+precision+and+bias.">Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias.</a> Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).</li><li>Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+hippocampal+structural+changes+following+electroconvulsive+seizure+treatment+in+a+rat+model+of+depression.">Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression.</a> Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).</li><li>Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+electroconvulsive+seizures+increase+the+total+number+of+synapses+in+adult+male+rat+hippocampus.">Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Ki&#235;u, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+-+reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered.</a> J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+based+stereological+methods+for+estimating+the+total+number+of+objects+in+histological+material.">Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material.</a> Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).</li><li>Olesen, M. V., W&#246;rtwein, G., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroconvulsive+stimulation,+but+not+chronic+restraint+stress,+causes+structural+alterations+in+adult+rat+hippocampus+-+a+stereological+study.">Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study.</a> Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).</li><li>Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroconvulsive+stimulation+results+in+long-term+survival+of+newly+generated+hippocampal+neurons+in+rats.">Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats.</a> Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).</li><li>Madsen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+neurogenesis+in+a+model+of+electroconvulsive+therapy.">Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy.</a> Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).</li><li>Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+produces+a+large+pool+of+new+granule+cells+in+the+dentate+gyrus.">Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.</a> J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size.">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).</li><li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+straightforward+and+rigorous+methods+of+counting+neurons+based+on+a+computer+simulation+approach.">Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach.</a> J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1986).</li><li>Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+determination+and+long-term+persistence+of+adult-generated+new+neurons+in+the+hippocampus+of+mice.">Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice.</a> Development. 130 (2), 391-399 (2003).</li><li>Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+maternal+separation+on+adult+mouse+behaviour+and+on+the+total+neuron+number+in+the+mouse+hippocampus.">The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus.</a> Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+and+neuron+number+of+the+lateral+geniculate+nucleus+in+schizophrenia+and+mood+disorders.">Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders.</a> Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).</li><li>Eriksen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+stereological+estimates+in+patients+with+severe+head+injuries+using+CT+and+MR+scanning+images.">Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images.</a> Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).</li><li>Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereology:+the+fast+lane+between+neuroanatomy+and+brain+function--or+still+only+a+tightrope?.">Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope?.</a> Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

באמצעות ECS כמתודולוגיה כדי לגרום neurogenesis, אנו מוצאים עלייה מיידית של 260% היווצרות של נוירונים חדשים BrdU חיובי בהיפוקמפוס. בבריכה זו של נוירונים שנוצר בחריפות מצאנו 40% שחיקה מיום 1 עד 3 חודשים, עם כמעט 50% של נוירונים שזה עתה נוצרו שורדים לפחות 12 חודשים לאחר הטיפול 10 , 11 . הספירה של נוירונים שכותרתו BrdU בעקבות ערכת הדגימה קפדנית, לפיה את כל ההיפוקמפוס נחתך לתוך חלקים עבה 80 מיקרומטר ואחריו תת דגימה של כל סעיף 5 עם התחלה דגימה אקראית בין סעיף 1 לבין סעיף 5. בחירת החלקים הללו נבחרת באופן אקראי ושיטתי, זוהי דרך מצוינת להפחתת השונות של התוצאה הסופית, ללא ספירה ממצה 1 . זו ערכת הדגימה אפשרה לנו לספור נוירונים BrdU חיובי בממוצע של 12 (8-16) hippocampאל חלקים בכל מוח חולדה, עם דיוק סופי של 9-11%. בעת שימוש בשיטה fractionator, חשוב לדעת את החלק של גובה הסעיף שבו ספירת מתבצע, מאז התכווצות רקמה דפורמציה מתרחשת לעתים קרובות במהלך עיבוד היסטולוגית 14 . ואכן, ראינו התכווצות ניכרת של עובי במחקר זה. יתר על כן, יש לציין כי הצטמקות רקמה דיפרנציאלית עשויה להתרחש, כפי שהוצג Dorph-Petersen et al. 2001. עם זאת, כל עוד המבנה המלא של הריבית זמין לניתוח, מגבלות אלה לא לגרום הטיה של המספר הכולל של חלקיקים, כלומר נוירונים BrdU חיובי. במחקרים בהם הצטמקות רקמות היא בעיה מסוימת, יש תמיד לציין כי התוצאות מתקבלות ברקמות מעוותות. במחקר זה, ספרנו בגובה של 10 מיקרומטר. לקטעים של המחקר הנוכחי היה עובי ממוצע סופי של 26 מיקרומטר, 5 מיקרומטראזור השמירה בחלק העליון ואת אזור 11 מיקרומטר (מתכוון) השומר בחלק התחתון של הקטע. פרמטרים אלה מקובלים מאז אזורי השמירה צריך להיות בערך קוטר של החלקיקים שנדגמו. לאחר התיחום של GCL / SGZ, דיקטורים היו ממוקמים באופן אקראי באופן אקראי בתוך השטח המסומן. יש להציב את הדיסקטורים באורך קבוע, הממטב את הדגימה והספירה כדי להשיג ביעילות אומדנים בדיוק כפי שנקבע על ידי החוקר. דיוק אופטימלי מושגת בדרך כלל על ידי ספירת עד 150-200 תאים בכל מבנה של עניין 5 . במחקר הנוכחי, ספרנו ממוצע של 133 (טווח 33-372) נוירונים חיוביים BrdU בכל היפוקמפוס חולדה. בשל מספר תאים נמוך בחלק מחיות הבקרה, הספירות של נוירונים חיוביים של BrdU נפלו מתחת למספר המקובל של התאים הנדרשים כדי להשיג דיוק מתאים, וכתוצאה מכך ערכי CE גבוהים יחסית עבור מקרים אלה. חעם זאת, כפי שקיבלנו ערכים CE של פחות ממחצית ערכי CV (ראה סעיף תוצאה נציג) דגימה נוספת לספור לא היה נדרש. ערכי CV הגבוהים מראים כי התורם הגדול ביותר לשינויים שנצפו מקורו בשינוי הביולוגי. ואכן, אנו עשויים לטעון כי המספר הממוצע של נוירונים חיוביים BrdU שנספרו במחקר הנוכחי היה גבוה מהנדרש. לדוגמה, בקבוצה אחת של חולדות השגנו ערך CE של 9%, וצפתה ערך CV של 43%. במקרה זה, היינו יכולים לכוון דיוק של כ 20%. לסיכום, הדיוק של המספר הכולל של נוירונים חיוביים BrdU במחקר הנוכחי הוא מספיק בכך שהוא לוכד השפעות טיפול אמיתי על המספרים האמיתיים של חלקיקים. בשל השונות הביולוגית הגדולה יחסית בקבוצות מסוימות של בעלי חיים, ניתן היה לקבל את אותן אומדנים בדייקנות מקובלת, למרות ההוצאות הנמוכות של מאמץ. שונות ביולוגית גבוהה בתוך הקבוצות יכולה רקלקבל פיצוי על ידי הגדלת מספר בעלי חיים. אפשר לטעון כי תקן הזהב לקבלת מספרי תאים מדויקים כרוך בספירה ממצה של כל האובייקטים של עניין. עם זאת, ברוב המחקרים של המוח זה לא אפשרי בשל המספרים העצומים של תאים. למרות יעילות הרבה יותר מאשר ספירת תאים ממצה, Fractator אופציונלי הוא זמן רב יחסית בהשוואה להקרנה פשוטה של ​​הבדלים במספרי תאים אשר העדיף אם המספר המדויק של תאים אינו חיוני. זה הניסיון שלנו כי הבדלים של יותר מ 20-30% ניתן לאתר אך ורק על ידי הליכי ההקרנה. אם נעשה בצורה נכונה, דגימה באמצעות stereology מבוסס עיצוב מספק הערכות משוחדת ומדויקת בצורה יעילה 1 . המאפיין הבלתי מוטה של ​​הסטריאולוגיה מייצר הערכות, שכאשר משוכפלים, מקורב לאוכלוסייה האמיתית, ומשפר את יכולת ההחזר שלאומדן 21 . בתחילה יש לקבל מדגם מייצג של כל מבנה העניין (במחקר זה את ה- GCL / SGZ בהיפוקמפוס), דבר המאפשר הערכה בתת-קבוצה תקפה מבחינה סטטיסטית של סעיפים 4 . כדי להשיג מספר מתאים של סעיפים וספירת בדיקות אנו מיישמים את SURS, דבר המקטין את השונות בהשוואה לדגימה אקראית 8 . יתר על כן, SURS מבטיח כי חלקיקים של עניין בתוך המבנה נדגמים עם הסתברויות אותו, ללא קשר לגודל שלהם, צורה, כיוון והפצה במבנה. כמו סטראולוגיה כזו היא להיות מומלץ מאוד כאשר קבלת הערכות מדויקות ולא משוחדות היא היבט מרכזי של הפרויקט.

כימות תאים במבנה תלת מימדי (3-D) עשוי לדרוש קבלת אומדנים המבוססים על עקרונות בלתי מוטים. גם כיום, מחקרים לעיתים קרובות להשתמש דו מימדי (2-D) שיטות לדווח על נתונים של מבנים 3-D. עם זאת, שיטות אלה לא רואים את האופי הטרוגני של המבנה במונחים של צורה והפצה של תאים וכתוצאה מכך מגבלות שיטתי; הם עושים הנחות על מבנה 3-D של עניין והתוצאות לא מתייחסים המבנה המלא. מגבלות אלה מקטינות את הרגישות והדיוק של השיטות וכן מגבירות את הסיכון לטעויות 1 . הטיה בספירת תאים ניתן להימנע על ידי יישום של עיצוב מבוסס stereology, אשר הוא בעל חשיבות כללית לקבלת מידע כמותי על מספר התאים ברקמות או מבנה נתון. בעוד stereology בעבר היה מאוד זמן רב, ההתקדמות נהלים, רךו הדמיה, הפך אותו להיות הרבה יותר יעיל ויישומי נרחב. הסטריאולוגיה כרוכה בעקרונות הדגימה הסטטיסטיים ובתאוריה הגיאומטרית הסטוכסטית על מנת לספק כלים יעילים להערכת נפח, שטח פני השטח, אורך ומספר אובייקטים במבנה תלת-ממדי על ידי דגימה בסעיפים 2-D. לפיכך, stereology מאפשר אחד כדי לקבל נתונים כמותיים משוחדת על שינויים מבניים בסעיפים רקמות, אשר נותנים הערכות הממוצע של המספרים האמיתיים, ללא ניתוח ממצה 1 . הסטריאולוגיה מוגדרת כהפרש סטטיסטי של פרמטרים גיאומטריים ממידע שנדגם. זה יכול להיות מושגת על ידי הדגימה משוחדת, כלומר דגימה אקראית שיטתית, של סעיפים, כמו גם ספירת כללים להבטיח כי לכל האובייקטים יש הסתברויות שוות להיות נספר 3 . בעוד תוצאות סטריאולוגיות יכולות להיות דרגות שונות של דיוק כפי שצוין על ידי מקדם השגיאה (CE), זה יכול להיות המודעהרק כדי להתאים את השונות הביולוגית הטבועה (מקדם השונות (CV)) על ידי התאמת כמות הדגימה כנדרש 4 , 5 . כמה מחקרים קודמים בסטריאולוגיה בחנו את ההשפעות קצרות הטווח של גירוי אלקטרו-פולסיבי (ECS) על הפלסטיות בהיפוקמפוס במכרסמים 6,7 . נתונים ממחקרים אלה מראים עלייה ראשונית במספר הכולל של נוירונים, כמו גם בידול סינפטי מוגבר בעקבות ECS חוזרת. עם זאת, מחקרים אלה לא מעריכים neurogenesis ישירות, שכן הם אינם משתמשים סמנים ספציפיים עבור התפשטות תאים. כאן אנו מציגים יישום של שיטה סטריאולוגית, הטכניקה Fractator אופטי 8 , 9 , לכימות המספר הכולל של נוירונים שנוצרו לאחרונה בשכבת התא גזענית בהיפוקמפוס תא (GCL), כולל אזור משנה גרגרי (SGZ), כמו גם כמו שלהם לטווח ארוך sאורוויה 10 , 11 . ערכנו חולדות על לוח זמנים קליני רלוונטי של ECS (שלוש פעמים בשבוע במשך 3 שבועות), שהוא אחד הגירויים החזקים ביותר של neurogenesis 12 . בעלי חיים בקרה טופלו באמצעות אותו הליך, אך ללא עובר הנוכחי. בכל אחד מ -21 ימי הניסויים, כל החולדות הוזרקו intraperitoneally עם 5-bromo-2 &#39;-deoxyuridine (BrdU) המשלבת לתוך DNA במקום תימידין במהלך חלוקת התא 13 . לאחר הניסוי נשמרו החולדות במשך ארבע תקופות זמן שונות (24 שעות, 3 חודשים, 6 חודשים ו -12 חודשים). באמצעות עקרון fractionator, השגנו חלק ידוע של ההיפוקמפוס באמצעות דגימה אקראית אחידה של סעיפים, והשתמש דיקטורים אופטיים (בדיקות 3-D) על דגימות רקמות עבה samosted ו immunostained. זה ציין במיוחד כי חלקים קפואים בדרך כלל להתמוטט ציר z במהלך התהליךIng, וכי דיקטורים אופטיים המבוססים על מספר משוקלל מתכוון מספר עובי יש להשתמש במקרה זה 14 . כאשר מטוס המוקד של הדיסקטורים האופטיים הועבר מרחק ידוע דרך החלק, נוירונים חיוביים BrdU נספרו כאשר התכונה שלהם עניין היה מוכר בבירור. בתחום הסטריאולוגיה יש ויכוח על המספר הכולל של חלקיקים שיש לספור 15 ; בדרך כלל 150-200 נוירונים נספרים במבנה של עניין כדי להשיג דיוק נאותה כלומר מקדם של 7-8% 8 . הספירות הנוירונאליות החיוביות של BrdU הושלמו באמצעות תוכנה סטריאולוגית עם הדמיה במיקרוסקופ סטנדרטי המצויד במצלמה ובמטרות הבאות: 2X, 4X ו- 10X וכן אובייקט טבילה של שמן 100X (צמצם מספרי = 1.40) ושלב ממונע . תנועות בכיוון z נמדדו בעזרת מיקרו-מקליט דיגיטלי. ההגדלה הסופיתהיה 3000X.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-bromo-2&#39;deoxyuridine - BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>19-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td>Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoprotectant</td>
			<td>Capital Region Pharmacy, DK</td>
			<td>861334</td>
			<td>Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M);&#160; ethylenglycol; demineralized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Capital Region Pharmacy, DK</td>
			<td>817205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine &#8211; DAB</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision-HRP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K4001</td>
			<td>Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 70 %</td>
			<td>Plum A/S</td>
			<td>201098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 96 %</td>
			<td>Plum A/S</td>
			<td>201104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - 99.9 %</td>
			<td>Plum A/S</td>
			<td>201111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>BI-04-003-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 30%</td>
			<td>Capital Region Pharmacy, DK</td>
			<td>896456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>6081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-anti-BrdU</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>347580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Capital Region Pharmacy, DK</td>
			<td>853436</td>
			<td>pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28,794,295</td>
			<td>pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer&#160;</td>
			<td>Capital Region Pharmacy, DK</td>
			<td>866533</td>
			<td>0.1 mol/l, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid drying mounting medium</td>
			<td>Histolab Products AB</td>
			<td>801</td>
			<td>Pertex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Tetraborate</td>
			<td>Merck A/S</td>
			<td>1,063,080,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck A/S</td>
			<td>1,076,515,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck A/S</td>
			<td>1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28,973,363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td>24x50 mm #0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microcator</td>
			<td>Heidenhain</td>
			<td>VRZ 401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dishes</td>
			<td>Brain Resaerch Laboratories</td>
			<td>1256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>SuperFrost+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>H101A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidish Containers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6315-1CS</td>
			<td>&#160;Nuclon 12-wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New-Cast software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td>ver. 4.5.6.440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 2x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan UW 2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Fluor 4X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 10x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Fluor 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 100x oil immersion</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil</td>
			<td>Numerical aperture 1.40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Gemini BV</td>
			<td>CM-9</td>
			<td>Sarstedt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide rack</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining dishes</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14037008637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining nets</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>2512</td>
			<td>25-wells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the optical fractionator technique to estimate cell numbers in a rat model of electroconvulsive therapy

שיטות סטריאולוגיות נועדו לתאר פרמטרים כמותיים מבלי לבצע הנחות לגבי גודל, צורה, כיוון והפצה של תאים או מבנים. שיטות אלה היו מהפכניות עבור ניתוח כמותי של המוח היונקים, שבו אוכלוסיות תאים volumetric גבוהים מדי כדי לספור באופן ידני, ו stereology עכשיו את הטכניקה של בחירה בכל פעם הערכות של כמויות תלת מימדיות צריך להיות מופק מדידות על דו מימדי סעיפים. כל השיטות הסטריאולוגיות אינן משוחדות כלל; עם זאת, הם מסתמכים על הידע הנכון על מבנה העניין ואת המאפיינים של הרקמה. הסטריאולוגיה מבוססת על דגימה אקראית אחידה שיטתית (SURS), תוך התאמה של הדגימה לרמה היעילה ביותר ביחס לדיוק, תוך מתן מידע אמין וכמותי על כל מבנה העניין. כאן אנו מציגים את fractionator אופטי בשיתוף עם אימונוהיסטוכימיה BrdU לאO להעריך את הייצור ואת ההישרדות של נוירונים שזה עתה נוצרו בשכבת התא גרגר (כולל אזור משנה גרגרי) של היפוקמפוס חולדה בעקבות גירוי אלקטרו, אשר הוא בין הממריצים החזקים ביותר של neurogenesis. הטכניקה Fractator אופטי נועד לספק הערכות של המספר הכולל של תאים מקטעים עבים שנדגמו מן המבנה המלא. חלקים עבים מספקים את ההזדמנות כדי לצפות בתאים שלהם מלא 3-D היקף ובכך, לאפשר סיווג תא קל וחזק מבוסס על קריטריונים מורפולוגיים. כאשר מיושם כראוי, את הרגישות והיעילות של Fractator אופטי מספק הערכות מדויקות עם דיוק קבוע מראש.

פרמטרים דגימה על ידי ניתוח הפצה z במחקר פיילוט ( איור 3 ), מצאנו התפלגות אחידה של נוירונים חיוביים BrdU בגובה גובה. הצטמקות המדורים נמדדה; עובי ממוצע הסופי היה 26.4 מיקרומטר (19.0-32.0 מיקרומטר) בקטעים במקור לחתוך ב 80 מיקרומטר. בהתבסס על עובי רקמות והפצה של נוירונים שכותרתו BrdU גובה הגובה נקבע 10 מיקרומטר, אזורי השמירה בחלק העליון והתחתון של החלק נקבע 5 מיקרומטר ו 4-17 מיקרומטר בהתאמה. בהתאם הצפיפות של התאים, השטח של מסגרות הספירה היה 1414 או 5210 מיקרומטר 2 . אורך הצעד היה 220 מיקרומטר בשני הכיוונים x ו- y וספירה התא בוצעה בממוצע של 12 (טווח 8-16) סעיפים לכל חיה. פרמטרים אלה הדגימה הביא ממוצע של 133 (טווח 33-372) BrdUתאים אופציונליים נספרים ב- 173 (107-204) disectors בכל חצי כדור המוח. לדוגמה, השגנו את קורות החיים הבאים וערכי CE לאמירות נוירונים חיוביות של BrdU בחולדות עם ECS: 24 שעות: CV = 0.59, CE = 0.11; 3 חודשים: CV = 0.34, CE = 0.12; 6 חודשים: CV = 0.43, CE = 0.09; 12 חודשים: CV = 0.22, CE = 0.09. אנחנו לכמת את המספר הכולל של נוירונים שנוצר לאחרונה הישרדות לטווח ארוך שלהם בהיפוקמפוס חולדה בעקבות ECS באמצעות fractionator אופטי בשילוב עם BrdU מכתים טכניקה 10 , 11 . התוצאות הסופיות הראו נוירוגנזה בסיסית בארבע קבוצות של בעלי חיים שליטה, אשר לא שונה באופן משמעותי כפונקציה של זמן ההישרדות ( איור 3 ). יתר על כן, ECS גרמה לעלייה משמעותית במספר הכולל של נוירונים חיובי BrdU ב 24(259%, p &lt;0.0001), 3 (229%, p &lt;0.001), 6 (152%, p &lt;0.05) ו -12 חודשים (162%, p &lt;0.05), בהשוואה לבקרת בעלי חיים. <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55737/55737fig3.jpg" /> איור 3: נתונים כמותיים של המספר הכולל של נוירונים חיובי BrdU ב GCL / SGZ של היפוקמפוס חולדה 10 , 11 . ברים אופקיים מייצגים את הערכים הממוצעים. קיצורים: GCL, גרגר תא שכבת; SGZ, אזור משנה גרגרי; שעות, שעות; מ &#39;, חודשים. **** p &lt;0.0001, *** p &lt;0.001 ו- p &lt;0.05 לעומת שליטה (n = 11-12 לקבוצה). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55737/55737fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy at JoVE.com

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

כאן, אנו מציגים שיטה סטריאולוגית, fractionator אופטי, המשמש לכימות היווצרות של נוירונים חדשים, ואת ההישרדות שלהם, בהיפוקמפוס חולדה בעקבות גירוי electroconvulsive. כאשר מיושמים כראוי, את הרגישות והיעילות של שיטות stereological מבטיח הערכות מדויקות עם קבוע מראש קבוע מראש.

טכניקת Fractator אופטי להעריך מספרים תאים במודל עכברוש של תרפיה אלקטרו-פולית

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

הקלטת פוטנציאל עוררה חזותית במודל עכברוש של demyelination עצב אופטי הניסויי

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

השימוש של התניה קלאסית Eyeblink מעקב כדי להעריך תפקוד בהיפוקמפוס במודל של עכברים של אלכוהול עוברית ספקטרום הפרעות

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

הערכה stereological של דופאמין נוירון במספר העכבר הסובסטנציה ניגרה באמצעות מיקרוסקופ רגיל ציוד אופטי Fractionator

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

Biodegradable Magnesium Stent Treatment of Saccular Aneurysms in a Rat Model - Introduction of the Surgical Technique

מגנזיום מתכלה סטנט לטיפול מפרצות Saccular במודל חולדה - מבוא לשיטת כירורגי

The steady progess in the armamentarium of techniques available for endovascular treatment of intracranial aneurysms requires affordable and reproducable ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

ניתוח עצבי הפנים במודל חולדה כדי ללמוד עיכוב Axonal והתחדשות

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

גישה ספסל למיקום ספציפי מחסום הדם מוח פתיחת באמצעות אולטרסאונד ממוקד במודל עכברוש

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...