Name: analyzing supercomplexes of the mitochondrial electron transport chain with native electrophoresis, in-gel assays, and electroelution
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן השותף האמריקאי של איגוד הלב של שותף [12GRNT12060233] ואת חזקה לילדים מרכז המחקר באוניברסיטת רוצ&#39;סטר.

כל הניסויים בוצעו באמצעות לבבות מ C57BL / 6N עכברים (סוג בר). עכברים היו מורדמים עם CO 2 לפני פריקה צוואר הרחם, וכל ההליכים בוצעו בהתאם קפדנית עם המחלקה של מעבדה לבעלי חיים באוניברסיטת רוצ&#39;סטר ועל פי החוק המדינה, החוק הפדרלי, ואת מדיניות NIH. הפרוטוקול אושר על ידי טיפול...

<ol>
	<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain:+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation.">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li><li>Saks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Energetic+Units+regulate+metabolism+in+cardiac+cells.">Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes.">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li><li>Hahn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+Complete+ATP+Synthase+Dimer+Reveals+the+Molecular+Basis+of+Inner+Mitochondrial+Membrane+Morphology.">Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology.</a> Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).</li><li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane.">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li><li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes.">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330 (2014).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interplay+Between+Respiratory+Supercomplexes+and+ROS+in+Aging.">The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).</li><li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondria+in+heart+failure:+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation.">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li><li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson's+disease.">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li><li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+clear+native+electrophoresis+for+in-gel+functional+assays+and+fluorescence+studies+of+membrane+protein+complexes.">High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+mitochondrial+supercomplex+formed+by+respiratory-chain+complexes+I+and+III.">Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore.">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).</li><li>Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+ryanodine+receptor+in+rat+heart+mitochondria.">Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria.</a> J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).</li><li>Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+brain+mitochondrial+function+in+the+rat+after+complete+and+incomplete+cerebral+ischemia.">Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia.</a> Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).</li><li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria.">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).</li><li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1.">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li><li>Schafer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+active+mammalian+respiratory+chain+supercomplexes.">Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes.">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+removal+of+DNA+from+proteomic+samples+prior+to+two-dimensional+map+analysis.">Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis.</a> J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).</li><li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines.">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+function+of+red+and+white+skeletal+muscle+mitochondria.">Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).</li><li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis:+principles+and+practical+hints.">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain.">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li><li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I.">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li><li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I.">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li></ol>

A פונקציונלי ETC הוא הכרחי עבור הדור המיטוכונדריה ATP. קומפלקסים של ETC מסוגלים ליצור שני סוגים של supercomplexes: respirasomes (Cx-I, IIII, ו- IV) 1 ואת synthasomes (Cx-V) 2 . הרכבה של כל מורכבות נדרשת עבור ETC שלם, בעוד הארגון של ETC לתוך supercomplexes נחשב להגביר את יעילות ETC הכוללת <sup ...

אנרגיה מיטוכונדריאלית בצורה של ATP אינה חיונית רק להישרדות התא, אלא גם להסדרת מוות התא. הדור של ATP על ידי זירזון חמצוני דורש שרשרת תובלה אלקטרונית תפקודית (ETC, Cx-I ל- IV) ו synthase ATP המיטוכונדריה (Cx-V). מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי אלה קומפלקסים חלבונים גדולים מאורגנים supercomplexes, נקרא respirasomes ו synthasomes 1 , 2 . זה מאתגר לנתח את הרכבה, דינמיקה, ויסות הפעילות של אלה קומפלקסים מסיבי supercomplexes. בעוד מדידות צריכת חמצן שנלקחו עם אלקטרודה חמצן מבחני אנזים שנערכו באמצעות ספקטרופוטומטר יכול לתת מידע בעל ערך על פעילות מורכבים ETC, מבחני אלה לא יכולים לספק מידע לגבי נוכחות, גודל, הרכב הרכב משנה של קומפלקס חלבון או supercomplexes המעורבים. עם זאת, פיתוח של יליד כחול ברור (BN ו- CN, בהתאמה) עמוד 3 יצרה כלי רב עוצמה לחשוף מידע חשוב על הרכב מורכבים הרכבה / פירוק ועל הרגולציה הדינמית של הארגון supramolecular של אלה מתחמי הנשימה חיוני בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים 4 . הרכבה של קומפלקסים אלה לתוך supercomplexes בסדר גבוה יותר נראה להסדיר מבנה המיטוכונדריה ותפקוד 5 . לדוגמה, הרכבה respirasome מגביר את היעילות של העברת אלקטרונים ואת הדור של כוח המניע פרוטון על פני קרום פנימי המיטוכונדריה 5 . בנוסף, הרכבה של synthasomes לא רק מגביר את היעילות של ייצור ה- ATP והעברת שווי אנרגיה לתוך הציטופלסמה 2 , אבל זה גם עובש את הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלי לתוך cristae 6 צינורי ,/ Sup&gt; 7 . מחקרים של הרכבה supercomplex במהלך התפתחות הלב בעוברים עכבר עולה כי הדור של Cx-I המכילים supercomplexes בלב מתחיל בערך ביום עובריים 13.5 8 . אחרים הראו כי כמות supercomplexes המכיל Cx-I פוחתת בלב עקב הזדקנות או איסכמיה / reperfusion פציעות 9 , 10 או יכול לשחק תפקיד בהתקדמות של מחלות ניווניות 11 . פרוטוקול זה מתאר שיטות ג &#39;ל הילידים PAGE שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הרכבה ופעילות של מתחמי ETC ו supercomplexes. המשקל המולקולרי המשוער של supercomplexes המיטוכונדריה ניתן להעריך על ידי הפרדת מתחמי חלבון CN או BN polyacrylamide ג&#39;לים. CN PAGE גם מאפשר הדמיה של הפעילות האנזימטית של כל מתחמי המיטוכונדריה ישירות הג&#39;ל (ב-מבחני ג&#39;ל;IGA) 12 . עבודה זו מדגימה את הפעילות של respirasomes על ידי הדגשת היכולת של Cx-I לחמצן NADH דרך IGA ואת נוכחות של synthasomes בשל פעילות ATP- hydrolyzing של CX-V על ידי IGA. קומפלקסים מרובים supercomplexes המכילים Cx-I ו CX-V יכול גם להיות הוכח על ידי העברת חלבונים על גבי קרומי ניטרוצלולוזה וביצוע immunoblotting. היתרון של גישה זו היא כי BN או CN PAGE בדרך כלל מפריד מתחמי חלבון על פי גודל פיזיולוגי שלהם הרכב; ההעברה לקרום משמרת תבנית זו של להקות. ניתוח מתחמי חלבון בדף BN או CN יכול להיעשות גם באמצעות 2D-PAGE (ראה Fiala et al 13 להפגנה) או על ידי צנטריפוגה צפיפות סוכרוז 14 , 15 . כדי לנתח עוד להקה ספציפית, זה יכול להיות נכרת מן דף BN, ואת החלבונים ממכלול חלבון זה יכול להיות purifieד על ידי electroeluting אותם בתנאים הילידים. Electroution יליד יכול להתבצע בתוך כמה שעות, אשר יכול לעשות הבדל משמעותי דיפוזיה פסיבית (כמו בשימוש הפניה 16) של חלבונים מן ג&#39;ל לתוך חיץ הסובבים. לסיכום, שיטות אלה מתארות מספר גישות המאפשרות את אפיון נוסף של supercomplexes משקל מולקולרית גבוהה ממברנות המיטוכונדריה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protean II mini-gel chamber</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean XL maxi-gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653189</td>
			<td>Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker, Hoefer SG15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95044-704</td>
			<td>Pouring mini-gel gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker, maxi-gel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>GM-100</td>
			<td>Pouring maxi-gel gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Complete set to wet transfer of proteins onto membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroeluter model 422</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1652976</td>
			<td>Electroelution of proteins from native or SDS PAGES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653308</td>
			<td>Short plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653312</td>
			<td>Spacer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651823</td>
			<td>Inner plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651824</td>
			<td>Outer Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Power supply suitable for native electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL-Western&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemolumniscense substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal-West Dura</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td>Enhanced chemolumniscense substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film/autoradiography film</td>
			<td>GE Health care</td>
			<td>28906845</td>
			<td>Documentation of Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film processor CP1000</td>
			<td>Agfa</td>
			<td>NC0872640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon Power Shot 640&#160;</td>
			<td>Canon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Taking photos to document gels, membranes and blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon Power Shot 640 Camera hood&#160;</td>
			<td>Canon</td>
			<td></td>
			<td>shielding camera for photos being taken on a light table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/bisacrylamide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610148</td>
			<td>40% pre-mixed solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxychelate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D66750</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I15513</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G250</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native&#160; molecular weight kit</td>
			<td>GE Health care&#160;</td>
			<td>17-0445-01</td>
			<td>High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2):</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>228621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ATP5A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14748</td>
			<td>antibody to ATP synthase subunit ATP5A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NDUFB6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110244</td>
			<td>antibody to Cx-1 subunit NDUFB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>529534</td>
			<td>antibody to VDAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL HRP linked antibody</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver staining Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing supercomplexes of the mitochondrial electron transport chain with native electrophoresis, in-gel assays, and electroelution

רשת ההולכה המיטוכונדריאלית (ETC) מייצרת את האנרגיה הנגזרת מהתפלגות של דלקים שונים למטבע הביו-אנרגטי של התא, ATP. ה- ETC מורכב מ -5 מתחמי חלבון מסיבי, אשר גם להרכיב סופר קומפלקסים הנקראים respirasomes (CI, C-III, ו- C-IV) ו synthasomes (קורות חיים) המגבירים את היעילות של התחבורה אלקטרונים הייצור ATP. שיטות שונות שימשו במשך למעלה מ -50 שנה כדי למדוד את הפונקציה ETC, אבל פרוטוקולים אלה אינם מספקים מידע על הרכבה של קומפלקסים בודדים supercomplexes. פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של ג &#39;ל הילידים polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (PAGE), שיטה ששונה לפני יותר מ -20 שנה ללמוד מבנה מורכבים ETC. יליד אלקטרופורזה מאפשר הפרדה של מתחמי ETC לתוך צורות פעיל שלהם, ואז קומפלקסים אלה ניתן ללמוד באמצעות immunoblotting, מבחני ג&#39;ל (IGA), וטיהור על ידי electroelution. על ידי שילוב מחדשSults של ג &#39;ל הילידים PAGE עם אלה של מבחני המיטוכונדריה אחרים, ניתן להשיג תמונה completer של פעילות ETC, הרכבה דינמי שלה פירוק, וכיצד זה מווסת מבנה המיטוכונדריה ותפקוד. עבודה זו תדון גם במגבלות של טכניקות אלה. לסיכום, הטכניקה של הילידים PAGE, ואחריו immunoblotting, IGA, electroelution, המוצגת להלן, היא דרך רבת עוצמה לחקור את הפונקציונליות ואת ההרכב של supercomplexes המיטוכונדריה ETC.

כדי להמחיש supercomplexes המיטוכונדריה, המיטוכונדריה מבודדים טרי מן העכברים היו בשימוש 17 , 18 . Supercomplexes מיטוכונדריאלי רגישים מחזורי חוזרות ונשנות של הקפאה והפשרה, המוביל להתפוררות שלהם, אם כי זה עשוי להיות נסבל עבור כמה חוקר?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution at JoVE.com

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

פרוטוקול זה מתאר את ההפרדה של מיטוכונדריאלי תפקודי שרשרת התחבורה אלקטרונים מתח (Cx) IV ו supercomplexes מהם באמצעות אלקטרופורזה יליד לחשוף מידע על הרכבה שלהם המבנה. ג&#39;ל הילידים יכול להיות נתון immunoblotting, מבחני ג&#39;ל, וטיהור על ידי electroelution כדי לאפיין עוד קומפלקסים בודדים.

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

אלקטרופורזה היברידית ברורה/כחולה עבור הפרדה וניתוח של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלי מערכות-העל

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

מדידת מתחמי העברת אלקטרונים מיטוכונדריאליים ברקמת לב קפואה בעבר מצאצאי החזירה: מודל להערכת שינויים ביו-אנרגטית מיטוכונדריאליים הנגרמים על ידי פעילות גופנית

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...