Name: analyzing supercomplexes of the mitochondrial electron transport chain with native electrophoresis, in-gel assays, and electroelution
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution at JoVE.com

この研究は、米国心臓協会創設者のアフィリエイト[12GRNT12060233]およびロチェスター大学の強力な児童研究センターからの助成金によって支えられました。

すべての実験は、C57BL / 6Nマウス（野生型）の心臓を用いて行った。マウスを頚部脱臼の前にCO 2で麻酔し、すべての処置を、ロチェスター大学の実験動物学部に厳密に準拠し、州法、連邦法、およびNIH方針に従って実施した。このプロトコールは、ロチェスター大学（動物資源学会）の機関動物管理および使用委員会によって承認された。 1. CNおよびBNページ<p ...

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	<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain:+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation.">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li><li>Saks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Energetic+Units+regulate+metabolism+in+cardiac+cells.">Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes.">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li><li>Hahn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+Complete+ATP+Synthase+Dimer+Reveals+the+Molecular+Basis+of+Inner+Mitochondrial+Membrane+Morphology.">Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology.</a> Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).</li><li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane.">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li><li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes.">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330 (2014).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interplay+Between+Respiratory+Supercomplexes+and+ROS+in+Aging.">The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).</li><li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondria+in+heart+failure:+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation.">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li><li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson's+disease.">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li><li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+clear+native+electrophoresis+for+in-gel+functional+assays+and+fluorescence+studies+of+membrane+protein+complexes.">High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+mitochondrial+supercomplex+formed+by+respiratory-chain+complexes+I+and+III.">Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore.">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).</li><li>Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+ryanodine+receptor+in+rat+heart+mitochondria.">Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria.</a> J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).</li><li>Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+brain+mitochondrial+function+in+the+rat+after+complete+and+incomplete+cerebral+ischemia.">Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia.</a> Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).</li><li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria.">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).</li><li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1.">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li><li>Schafer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+active+mammalian+respiratory+chain+supercomplexes.">Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes.">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+removal+of+DNA+from+proteomic+samples+prior+to+two-dimensional+map+analysis.">Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis.</a> J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).</li><li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines.">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+function+of+red+and+white+skeletal+muscle+mitochondria.">Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).</li><li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis:+principles+and+practical+hints.">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain.">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li><li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I.">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li><li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I.">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li></ol>

機能的ETCは、ミトコンドリアATP生成に必要である。 ETCの複合体は、respirasomes（Cx-1、-III、-IV） 1とシンターソーム（Cx-V） 2の2種類のスーパーコンプレックスを形成することができます。 ETCをスーパーコンプレックスに編成することは、ETC全体の効率を向上させると考えられている5,22。これらのスーパーコンプレックスがどのように組み立てられ分解され?...

ATPの形態のミトコンドリアのエネルギーは、細胞生存に必須であるだけでなく、細胞死の調節にも必須である。酸化的リン酸化によるATPの生成には、機能的電子伝達鎖（ETC; Cx-1〜IV）およびミトコンドリアATPシンターゼ（Cx-V）が必要である。最近の研究は、これらの大きなタンパク質複合体が、レスピラソームおよびシンセサム1,2と呼ばれるスーパーコンプレックスに組織化されていることを示している。これらの大規模な複合体およびスーパーコンプレックスのアセンブリ、ダイナミクス、およびアクティビティの規制を分析することは困難です。分光光度計を用いて実施された酸素電極および酵素アッセイを用いた酸素消費測定はETC複合体活性に関する貴重な情報を与えることができるが、これらのアッセイはタンパク質複合体または関連するスーパーコンプレックスの存在、サイズおよびサブユニット組成に関する情報を提供することができない。しかし、青色で透明なネイティブ（BNおよびCN）PAGE 3は、複雑な組成およびアセンブリ/分解に関する重要な情報、ならびに生理学的および病理学的条件下でのこれらの生命を脅かす呼吸器複合体の超分子構成の動的調節に関する強力なツールを創出した4 。 これらの複合体を高次スーパーコンプレックスに集合させることは、ミトコンドリア構造および機能を調節するようである5 。例えば、レスピアソームアセンブリは、電子伝達の効率およびミトコンドリア内膜5にわたるプロトン原動力の生成を増加させる。さらに、シンサソームの集合体は、ATP産生の効率および細胞質2へのエネルギー等価物の移動を増加させるだけでなく、ミトコンドリア内膜を管状クリステイ6 、/ u&gt; 7 。マウス胚における心臓発達中のスーパーコンプレックス集合体の研究は、心臓におけるCx-1含有スーパーコンプレックスの発生が、およそ胚の13。 8日に始まることを示している。他は、Cx-I含有スーパーコンプレックスの量が、老化または虚血/再かん流傷害のために心臓において減少すること、 9,10 、または神経変性疾患の進行に役割を果たす可能性があることを示している11 。 このプロトコールは、ETC複合体およびスーパーコンプレックスのアセンブリおよび活性を調べるために用いることができる天然のゲルPAGEのための方法を記載する。ミトコンドリアのスーパーコンプレックスのおおよその分子量は、CNまたはBNポリアクリルアミドゲル中のタンパク質複合体を分離することによって評価することができる。 CN PAGEはまた、ゲル中で直接的に全てのミトコンドリア複合体の酵素活性の可視化を可能にする（in-gelアッセイ;IGA） 12 。この研究は、IGAを介してNADHを酸化するCx-Iの能力およびIGAによるCx-VのATP加水分解活性に起因するシンサソームの存在を強調することによって、呼吸器の活性を実証している。 Cx-IおよびCx-Vを含む複数の複合体およびスーパー複合体はまた、タンパク質をニトロセルロース膜上に移し、イムノブロッティングを行うことによって実証することができる。このアプローチの利点は、BNまたはCN PAGEが一般に、それらの生理学的サイズおよび組成に基づいてタンパク質複合体を分離することである。膜への移動はこのバンドのパターンを保持する。 BNまたはCN PAGEにおけるタンパク質複合体の分析は、2D-PAGE（デモンストレーションのためにFiala ら 13参照）またはショ糖密度遠心分離14,15を用いて行うこともできる。特定のバンドをさらに分析するために、それをBN PAGEから切り出すことができ、このタンパク質複合体からのタンパク質を精製することができるそれらを自然条件下で電気溶出することにより、ネイティブの電気溶出は数時間以内に行うことができ、ゲルから周囲のバッファーへのタンパク質の受動拡散（参考文献16で使用されているような）に有意差を生じさせる可能性がある。 要約すると、これらの方法は、ミトコンドリア膜からの高分子量スーパーコンプレックスのさらなる特徴付けを可能にするいくつかのアプローチを記載する。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Protean II mini-gel chamber</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean XL maxi-gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653189</td>
			<td>Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker, Hoefer SG15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95044-704</td>
			<td>Pouring mini-gel gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker, maxi-gel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>GM-100</td>
			<td>Pouring maxi-gel gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Complete set to wet transfer of proteins onto membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroeluter model 422</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1652976</td>
			<td>Electroelution of proteins from native or SDS PAGES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653308</td>
			<td>Short plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653312</td>
			<td>Spacer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651823</td>
			<td>Inner plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651824</td>
			<td>Outer Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Power supply suitable for native electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL-Western&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemolumniscense substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal-West Dura</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td>Enhanced chemolumniscense substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film/autoradiography film</td>
			<td>GE Health care</td>
			<td>28906845</td>
			<td>Documentation of Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film processor CP1000</td>
			<td>Agfa</td>
			<td>NC0872640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon Power Shot 640&#160;</td>
			<td>Canon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Taking photos to document gels, membranes and blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon Power Shot 640 Camera hood&#160;</td>
			<td>Canon</td>
			<td></td>
			<td>shielding camera for photos being taken on a light table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/bisacrylamide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610148</td>
			<td>40% pre-mixed solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxychelate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D66750</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I15513</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G250</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native&#160; molecular weight kit</td>
			<td>GE Health care&#160;</td>
			<td>17-0445-01</td>
			<td>High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2):</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>228621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ATP5A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14748</td>
			<td>antibody to ATP synthase subunit ATP5A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NDUFB6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110244</td>
			<td>antibody to Cx-1 subunit NDUFB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>529534</td>
			<td>antibody to VDAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL HRP linked antibody</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver staining Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing supercomplexes of the mitochondrial electron transport chain with native electrophoresis, in-gel assays, and electroelution

ミトコンドリア電子輸送鎖（ETC）は、様々な燃料の分解から誘導されたエネルギーを細胞のATPの生体エネルギー通貨に変換する。 ETCは、レスピラソーム（CI、C-III、およびC-IV）と呼ばれるスーパーコンプレックスと、電子輸送およびATP産生の効率を高めるシンターソーム（CV）にアセンブルする5つの巨大タンパク質複合体からなる。 ETC機能を測定するために50年以上にわたって様々な方法が用いられてきたが、これらのプロトコルは個々の複合体およびスーパーコンプレックスの集合に関する情報を提供しない。このプロトコールは、ETC複合体構造を研究するために20年以上前に改変された方法であるネイティブゲルポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）の技術を記載している。ネイティブ電気泳動は、ETC複合体の活性型への分離を可能にし、イムノブロッティング、インゲルアッセイ（IGA）、および電気溶出による精製を用いてこれらの複合体を研究することができる。また、ネイティブゲルPAGEの他のミトコンドリアアッセイの結果と比較すると、ETC活性、その動的なアセンブリおよび分解、およびこれがミトコンドリアの構造および機能をどのように調節するかについてのコンプリータ画像を得ることが可能である。この作業では、これらの技術の限界についても検討する予定です。要約すると、以下に示すイムノブロッティング、IGA、および電気溶出が続くネイティブPAGEの技法は、ミトコンドリアETCスーパーコンプレックスの機能性および組成を調べる強力な方法である。

ミトコンドリアのスーパーコンプレックスを視覚化するために、マウスから新たに単離したミトコンドリアを使用した（ 17,18 ） 。ミトコンドリアのスーパーコンプレックスは、凍結融解の繰り返しサイクルに敏感であり、崩壊に至るが、これは一部の研究者にとって許容されるかもしれない。保存に凍結が必要な場合は、最良の結果を得る...

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Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

このプロトコールは、機能的ミトコンドリア電子輸送鎖複合体（Cx）IVおよびそれらのスーパーコンプレックスの、それらのアセンブリおよび構造に関する情報を明らかにするための天然の電気泳動の分離を記載する。天然ゲルは、イムノブロッティング、ゲル内アッセイ、および電気溶出による精製を受けて、個々の複合体をさらに特徴付けることができる。

ネイティブ電気泳動、インゲルアッセイおよび電気溶出を用いたミトコンドリア電子輸送鎖のスーパーコンプレックスの解析

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

C2C12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

電気化学検出の重水素速度論的同位体効果シェワネラ oneidensis氏 1 の細胞外電子輸送

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

ミトコンドリアの呼吸鎖 Supercomplexes の分離と分析のためのハイブリッドクリア/ブルーネイティブ電気泳動

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

ソウの子孫から以前に凍結した心臓組織におけるミトコンドリア電子伝達複合体の測定:運動誘発ミトコンドリアバイオエネルギーの変化を評価するモデル

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...