Name: analyzing supercomplexes of the mitochondrial electron transport chain with native electrophoresis, in-gel assays, and electroelution
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution at JoVE.com

이 연구는 미국 심장 학회 설립자 제휴사 (12GRNT12060233)와 로체스터 대학의 Strong Children &#39;s Research Center의 연구비 지원으로 이루어졌습니다.

모든 실험은 C57BL / 6N 마우스 (야생형)의 심장을 사용하여 수행 하였다. 쥐는 자궁 경부 전위 이전에 이산화탄소로 마취되었고, 모든 절차는 로체스터 대학의 실험실 동물 의학부에 따라 주법, 연방 법령 및 NIH 정책에 따라 엄격하게 수행되었다. 의정서는 로체스터 대학 동물 동물 보호 및 사용위원회 (동물 자원위원회)의 승인을 받았습니다. 1. CN 및 BN 페이지 <p class="jove_conte...

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	<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain:+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation.">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li><li>Saks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Energetic+Units+regulate+metabolism+in+cardiac+cells.">Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes.">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li><li>Hahn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+Complete+ATP+Synthase+Dimer+Reveals+the+Molecular+Basis+of+Inner+Mitochondrial+Membrane+Morphology.">Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology.</a> Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).</li><li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane.">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li><li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes.">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330 (2014).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interplay+Between+Respiratory+Supercomplexes+and+ROS+in+Aging.">The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).</li><li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondria+in+heart+failure:+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation.">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li><li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson's+disease.">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li><li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+clear+native+electrophoresis+for+in-gel+functional+assays+and+fluorescence+studies+of+membrane+protein+complexes.">High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+mitochondrial+supercomplex+formed+by+respiratory-chain+complexes+I+and+III.">Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore.">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).</li><li>Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+ryanodine+receptor+in+rat+heart+mitochondria.">Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria.</a> J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).</li><li>Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+brain+mitochondrial+function+in+the+rat+after+complete+and+incomplete+cerebral+ischemia.">Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia.</a> Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).</li><li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria.">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).</li><li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1.">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li><li>Schafer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+active+mammalian+respiratory+chain+supercomplexes.">Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes.">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+removal+of+DNA+from+proteomic+samples+prior+to+two-dimensional+map+analysis.">Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis.</a> J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).</li><li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines.">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+function+of+red+and+white+skeletal+muscle+mitochondria.">Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).</li><li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis:+principles+and+practical+hints.">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain.">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li><li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I.">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li><li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I.">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li></ol>

기능적 ETC는 미토콘드리아 ATP 생성에 필요합니다. ETC의 복합체는 respirasomes (Cx-I, -III 및 -IV) 1 과 신타 소솜 (Cx-V) 2의 두 가지 유형의 수퍼 콤플렉스를 형성 할 수 있습니다. ETC를 supercomplexes로 편성하는 것은 전반적인 ETC 효율성을 증가시키는 것으로 생각되는 반면, 각 복합체의 조립은 손상되지 않은 ETC에 필요하다. 이러한 수퍼 콤플렉스가 어떻게 조립 및 분해?...

ATP 형태의 미토콘드리아 에너지는 세포 생존에 필수적 일뿐만 아니라 세포 사멸의 조절에도 필수적이다. 산화 적 인산화에 의한 ATP의 생성에는 기능적 전자 전달 사슬 (ETC, Cx-1 내지 IV) 및 미토콘드리아 ATP 신타 제 (Cx-V)가 필요하다. 최근의 연구에 따르면 이러한 큰 단백질 복합체는 respirasomes 및 synthasomes 1 , 2 라고 불리는 수퍼 콤플렉스로 구성되어 있습니다. 이러한 대규모 단지와 수퍼 콤플렉스의 조립, 역학 및 활동 규제를 분석하는 것은 어려운 일입니다. 분광 광도계를 사용하여 수행 한 산소 전극 및 효소 분석으로 얻은 산소 소비 측정은 ETC 복합체 활성에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있지만이 분석법은 관련된 단백질 복합체 또는 수퍼 콤플렉스의 존재, 크기 및 하위 구성에 관한 정보를 제공 할 수 없습니다. 그러나, 청색 및 투명한 천연 (BN 및 CN) PAGE 3 은 복잡한 구성 및 조립 / 해체에 대한 중요한 정보와 생리 및 병리학 적 조건 하에서 이들 중요한 호흡 복합체의 초분자 조직의 동적 조절에 대한 강력한 도구를 창출했습니다. 이러한 복합체를 고차 수퍼 콤플렉스로 조립하면 미토콘드리아 구조와 기능을 조절하는 것으로 보인다 5 . 예를 들어 respirasome assembly는 전자 이동의 효율과 미토콘드리아 내부 막을 가로 지른 양성자 원동력의 생성을 증가시킵니다 5 . 또한, synthasomes의 조립은 ATP 생산의 효율과 세포질 2 로의 에너지 등가물의 전달을 증가시킬뿐만 아니라 미토콘드리아 내부 막을 관상의 cristae 6 로 몰드시킨다 &lt;/ sup&gt; 7 . 마우스 배아에서 심장 발달 중 supercomplex assembly에 대한 연구는 심장에서 Cx-I- 함유 supercomplexes의 생성이 대략 배아 일 13.5 8 에서 시작한다는 것을 보여준다. 다른 사람들은 노화 또는 허혈 / 재관류 손상으로 인해 Cx-I- 함유 수퍼 콤플렉스의 양이 심장에서 감소하거나 신경 퇴행성 질환의 진행에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여주었습니다 11 . 이 프로토콜은 ETC 복합체 및 supercomplexes의 조립 및 활동을 조사하는 데 사용할 수있는 원시 젤 페이지에 대한 방법을 설명합니다. 미토콘드리아 supercomplexes의 대략 분자량은 CN 또는 BN polyacrylamide 젤에 단백질 복합체를 분리하여 평가할 수 있습니다. CN PAGE는 또한 겔에서 직접적으로 모든 미토콘드리아 복합체의 효소 활성을 시각화합니다 (in-gel assay;IGA) 12 . 이 연구는 IGA를 통해 NADH를 산화시키는 Cx-I의 능력과 IGA에 의한 Cx-V의 ATP 가수 분해 활성으로 인한 신타 소솜의 존재를 강조함으로써 호흡기 활동을 입증합니다. Cx-I 및 Cx-V를 함유 한 복합체 및 수퍼 콤플렉스는 또한 단백질을 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고 면역 블로 팅을 수행함으로써 입증 될 수있다. 이 방법의 장점은 일반적으로 BN 또는 CN PAGE가 생리 학적 크기 및 조성을 기반으로 단백질 복합체를 분리한다는 점입니다. 멤브레인으로의 전달은 이러한 밴드 패턴을 보존합니다. BN 또는 CN PAGE에서 단백질 복합체를 분석하는 것은 2D-PAGE (Fiala 등 13 참조) 또는 자당 밀도 원심 분리 14 , 15 를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 특정 밴드를 추가로 분석하기 위해 BN PAGE에서 추출 할 수 있으며이 단백질 복합체의 단백질을 정제 할 수 있습니다d. 네이티브 전기 분해는 몇 시간 내에 수행 될 수 있는데, 이것은 겔로부터 주변 완충액으로의 단백질의 수동 확산 (참조 문헌 16에서 사용 된 바와 같이)에 상당한 차이를 만들 수있다. 요약하면, 이들 방법은 미토콘드리아 막으로부터의 고 분자량 수퍼 콤플렉스의 추가 특성 결정을 가능하게하는 몇 가지 접근법을 기술한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protean II mini-gel chamber</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean XL maxi-gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653189</td>
			<td>Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker, Hoefer SG15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95044-704</td>
			<td>Pouring mini-gel gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker, maxi-gel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>GM-100</td>
			<td>Pouring maxi-gel gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Complete set to wet transfer of proteins onto membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroeluter model 422</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1652976</td>
			<td>Electroelution of proteins from native or SDS PAGES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653308</td>
			<td>Short plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653312</td>
			<td>Spacer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651823</td>
			<td>Inner plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651824</td>
			<td>Outer Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Power supply suitable for native electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL-Western&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemolumniscense substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal-West Dura</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td>Enhanced chemolumniscense substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film/autoradiography film</td>
			<td>GE Health care</td>
			<td>28906845</td>
			<td>Documentation of Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film processor CP1000</td>
			<td>Agfa</td>
			<td>NC0872640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon Power Shot 640&#160;</td>
			<td>Canon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Taking photos to document gels, membranes and blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon Power Shot 640 Camera hood&#160;</td>
			<td>Canon</td>
			<td></td>
			<td>shielding camera for photos being taken on a light table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/bisacrylamide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610148</td>
			<td>40% pre-mixed solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxychelate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D66750</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I15513</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G250</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native&#160; molecular weight kit</td>
			<td>GE Health care&#160;</td>
			<td>17-0445-01</td>
			<td>High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2):</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>228621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ATP5A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14748</td>
			<td>antibody to ATP synthase subunit ATP5A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NDUFB6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110244</td>
			<td>antibody to Cx-1 subunit NDUFB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>529534</td>
			<td>antibody to VDAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL HRP linked antibody</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver staining Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing supercomplexes of the mitochondrial electron transport chain with native electrophoresis, in-gel assays, and electroelution

미토콘드리아 전자 수송 사슬 (ETC)은 다양한 연료의 분해로 인해 생성 된 에너지를 세포의 ATP 인 생물 에너지로 변환시킵니다. ETC는 respirasomes (CI, C-III, C-IV) 및 전자 전달 및 ATP 생산의 효율성을 증가시키는 synthasomes (CV)라고 불리는 supercomplexes로 조립되는 5 개의 거대한 단백질 복합체로 구성됩니다. ETC 기능을 측정하기 위해 50 년 이상 다양한 방법이 사용되었지만 이러한 프로토콜은 개별 복합체와 수퍼 콤플렉스의 조립에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 ETC 복잡한 구조를 연구하기 위해 20 년 이상 전에 수정 된 방법 인 고유 겔 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE) 기술을 설명합니다. 네이티브 전기 영동으로 ETC 복합체를 활성 형태로 분리 할 수 ​​있으며,이 복합체는 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔화 분석 (IGA) 및 전기 분해로 정제 할 수 있습니다. 다시 조합하여네이티브 젤 PAGE와 다른 미토콘드리아 분석 결과를 비교해 보면 ETC 활동, 동적 인 조립 및 분해, 그리고 이것이 미토콘드리아 구조와 기능을 어떻게 조절하는지에 대한 완성도를 얻을 수 있습니다. 이 작품은 또한 이러한 기술의 한계를 논의 할 것입니다. 요약하면, 네이티브 PAGE 기술은 면역 블로 팅, IGA, 전기 분해가 뒤 따르는 것으로 미토콘드리아 ETC 수퍼 콤플렉스의 기능과 구성을 조사하는 강력한 방법입니다.

미토콘드리아 supercomplexes를 시각화하기 위해 쥐에서 새로 격리 mitochondria가 사용되었다 17 , 18 . Mitochondrial supercomplexes는 일부 연구자들에게는 용인 될 수 있지만, 분해 및 해동의 반복주기에 민감합니다. 보관을 위해 동결이 필요한 경우 최상의 결과를 얻으려면 샘플을 한 번 이상 동결 및 해동하지 않아야합니다. <p class="jove_c...

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Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다.

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

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전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

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Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

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Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

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Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

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Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

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Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

소우의 자손에서 이전에 냉동 된 심장 조직에서 미토콘드리아 전자 전송 복합체 측정 : 운동 유발 미토콘드리아 생물 에너지 변화를 평가하는 모델

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...