Name: analyzing supercomplexes of the mitochondrial electron transport chain with native electrophoresis, in-gel assays, and electroelution
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de la American Heart Association Afiliado [12GRNT12060233] y el Centro de Investigación de Niños fuertes de la Universidad de Rochester.

Todos los experimentos se realizaron utilizando corazones de ratones C57BL / 6N (tipo salvaje). Los ratones fueron anestesiados con CO 2 antes de la dislocación cervical, y todos los procedimientos se realizaron en estricta conformidad con la División de Laboratorio de Medicina Animal en la Universidad de Rochester y en cumplimiento con la ley estatal, estatuto federal y NIH política. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Rochester (Comité...

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	<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain:+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation.">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li><li>Saks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Energetic+Units+regulate+metabolism+in+cardiac+cells.">Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes.">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li><li>Hahn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+Complete+ATP+Synthase+Dimer+Reveals+the+Molecular+Basis+of+Inner+Mitochondrial+Membrane+Morphology.">Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology.</a> Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).</li><li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane.">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li><li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes.">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330 (2014).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interplay+Between+Respiratory+Supercomplexes+and+ROS+in+Aging.">The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).</li><li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondria+in+heart+failure:+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation.">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li><li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson's+disease.">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li><li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+clear+native+electrophoresis+for+in-gel+functional+assays+and+fluorescence+studies+of+membrane+protein+complexes.">High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+mitochondrial+supercomplex+formed+by+respiratory-chain+complexes+I+and+III.">Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore.">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).</li><li>Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+ryanodine+receptor+in+rat+heart+mitochondria.">Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria.</a> J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).</li><li>Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+brain+mitochondrial+function+in+the+rat+after+complete+and+incomplete+cerebral+ischemia.">Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia.</a> Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).</li><li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria.">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).</li><li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1.">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li><li>Schafer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+active+mammalian+respiratory+chain+supercomplexes.">Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes.">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria.">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+removal+of+DNA+from+proteomic+samples+prior+to+two-dimensional+map+analysis.">Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis.</a> J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).</li><li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines.">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li><li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+function+of+red+and+white+skeletal+muscle+mitochondria.">Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).</li><li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis:+principles+and+practical+hints.">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li><li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain.">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li><li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I.">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li><li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I.">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li></ol>

Un ETC funcional es necesario para la generación de ATP mitocondrial. Los complejos del ETC son capaces de formar dos tipos de supercomplejos: los respirasomes (Cx-I, -III, y -IV) 1 y los sintomas (Cx-V) 2 . El montaje de cada complejo es necesario para un ETC intacto, mientras que la organización de la ETC en supercomplexes se cree que aumentar la eficiencia global ETC [ 5 , 22] . No se conocen bien cómo se mon...

La energía mitocondrial en forma de ATP no sólo es esencial para la supervivencia celular, sino también para la regulación de la muerte celular. La generación de ATP por fosforilación oxidativa requiere una cadena funcional de transporte de electrones (ETC, Cx-I a IV) y ATP sintasa mitocondrial (Cx-V). Estudios recientes han demostrado que estos grandes complejos de proteínas están organizados en supercomplejos, llamados respirasomes y synthasomes 1 , 2 . Es difícil analizar la asamblea, la dinámica y la regulación de la actividad de estos complejos y supercomplejos masivos. Mientras que las mediciones del consumo de oxígeno tomadas con un electrodo de oxígeno y los ensayos enzimáticos llevados a cabo utilizando un espectrofotómetro pueden proporcionar información valiosa sobre la actividad compleja de ETC, estos ensayos no pueden proporcionar información con respecto a la presencia, tamaño y composición de subunidades del complejo proteico o supercomplejos implicados. Sin embargo, el desarrollo de azul y claro nativo (BN y CN, respectivamente) PAGE 3 ha creado una potente herramienta para revelar información importante sobre la composición compleja y el montaje / desmontaje y sobre la regulación dinámica de la organización supramolecular de estos complejos respiratorios vitales en condiciones fisiológicas y patológicas 4 . El montaje de estos complejos en supercomplejos de orden superior parece regular la estructura y función mitocondrial 5 . Por ejemplo, el montaje respirasome aumenta la eficiencia de la transferencia de electrones y la generación de la fuerza motriz del protón a través de la membrana interna mitocondrial 5 . Además, el montaje de los sintomas no sólo aumenta la eficiencia de la producción de ATP y la transferencia de equivalentes de energía al citoplasma 2 , sino que también moldea la membrana interna mitocondrial en las crestas tubulares 6 ,/ Sup&gt; 7 . Estudios de montaje supercompleto durante el desarrollo cardíaco en embriones de ratón muestran que la generación de Cx-I que contienen supercomplejos en el corazón comienza en alrededor del día embrionario 13,5 8 . Otros han demostrado que la cantidad de supercomplexos que contienen Cx-I disminuye en el corazón debido al envejecimiento o lesiones por isquemia / reperfusión 9 , 10 o pueden jugar un papel en la progresión de enfermedades neurodegenerativas 11 . Este protocolo describe métodos para gel PAGE nativo que puede usarse para investigar el montaje y la actividad de los complejos ETC y supercomplejos. El peso molecular aproximado de los supercomplejos mitocondriales puede evaluarse separando los complejos proteicos en geles de poliacrilamida CN o BN. CN PAGE también permite la visualización de la actividad enzimática de todos los complejos mitocondriales directamente en el gel (ensayos en gel;IGA) 12 . Este trabajo demuestra la actividad de respirasomes resaltando la capacidad de Cx-I para oxidar NADH a través de IGA y la presencia de synthasomes debido a la actividad de hidrolización de ATP de Cx-V por IGA. Los múltiples complejos y supercomplejos que contienen Cx-I y Cx-V también pueden demostrarse transfiriendo las proteínas sobre membranas de nitrocelulosa y realizando inmunotransferencia. La ventaja de este enfoque es que BN o CN PAGE generalmente separa complejos proteicos basados ​​en su tamaño fisiológico y composición; La transferencia a una membrana conserva este patrón de bandas. Análisis de complejos de proteínas en un BN o CN PAGE también se puede hacer utilizando 2D-PAGE (véase Fiala et al 13 para una demostración) o por centrifugación de densidad de sacarosa [ 14 , 15] . Para analizar más a fondo una banda específica, puede ser extirpada de la BN PAGE, y las proteínas de este complejo de proteínas pueden ser purificadasD electroelutándolos bajo condiciones nativas. La electroelución nativa puede realizarse en pocas horas, lo que podría hacer una diferencia significativa en la difusión pasiva (tal como se utiliza en la Referencia 16) de proteínas desde un gel al tampón circundante. En resumen, estos métodos describen varios enfoques que permiten la caracterización adicional de los supercomplexos de alto peso molecular de las membranas mitocondriales.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Protean II mini-gel chamber</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean XL maxi-gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653189</td>
			<td>Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker, Hoefer SG15</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95044-704</td>
			<td>Pouring mini-gel gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker, maxi-gel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>GM-100</td>
			<td>Pouring maxi-gel gradients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Complete set to wet transfer of proteins onto membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroeluter model 422</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1652976</td>
			<td>Electroelution of proteins from native or SDS PAGES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653308</td>
			<td>Short plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1653312</td>
			<td>Spacer plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651823</td>
			<td>Inner plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651824</td>
			<td>Outer Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Power supply suitable for native electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL-Western&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemolumniscense substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal-West Dura</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td>Enhanced chemolumniscense substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film/autoradiography film</td>
			<td>GE Health care</td>
			<td>28906845</td>
			<td>Documentation of Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film processor CP1000</td>
			<td>Agfa</td>
			<td>NC0872640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon Power Shot 640&#160;</td>
			<td>Canon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Taking photos to document gels, membranes and blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon Power Shot 640 Camera hood&#160;</td>
			<td>Canon</td>
			<td></td>
			<td>shielding camera for photos being taken on a light table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/bisacrylamide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610148</td>
			<td>40% pre-mixed solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (sodium dodecyl sulfate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15525-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxychelate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D66750</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I15513</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G250</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native&#160; molecular weight kit</td>
			<td>GE Health care&#160;</td>
			<td>17-0445-01</td>
			<td>High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2):</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>228621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ATP5A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14748</td>
			<td>antibody to ATP synthase subunit ATP5A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NDUFB6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110244</td>
			<td>antibody to Cx-1 subunit NDUFB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VDAC</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>529534</td>
			<td>antibody to VDAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL HRP linked antibody</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking reagent</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td>Company</td>
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			<td>Silver staining Kit</td>
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analyzing supercomplexes of the mitochondrial electron transport chain with native electrophoresis, in-gel assays, and electroelution

La cadena de transporte de electrones mitocondriales (ETC) transduce la energía derivada de la descomposición de varios combustibles en la moneda bioenergética de la célula, ATP. El ETC se compone de 5 complejos masivos de proteínas, que también se agrupan en supercomplejos llamados respirasomes (CI, C-III y C-IV) y synthasomes (CV) que aumentan la eficiencia del transporte de electrones y la producción de ATP. Se han utilizado varios métodos durante más de 50 años para medir la función ETC, pero estos protocolos no proporcionan información sobre el ensamblaje de complejos individuales y supercomplejos. Este protocolo describe la técnica de electroforesis en gel de gel de poliacrilamida nativa (PAGE), un método que fue modificado hace más de 20 años para estudiar la estructura compleja de ETC. La electroforesis nativa permite la separación de los complejos ETC en sus formas activas, y estos complejos pueden entonces estudiarse usando inmunotransferencia, ensayos en gel (IGA) y purificación por electroelución. Combinando el reLos resultados de PAGE PAGE nativo con los de otros ensayos mitocondriales, es posible obtener una imagen completa de la actividad ETC, su ensamblaje dinámico y desmontaje, y cómo esto regula la estructura y función mitocondrial. Este trabajo también discutirá las limitaciones de estas técnicas. En resumen, la técnica de PAGE nativo, seguida de immunoblotting, IGA y electroelución, presentada a continuación, es una poderosa manera de investigar la funcionalidad y composición de los supercomplexos mitocondriales ETC.

Para visualizar supercomplexos mitocondriales, se utilizaron mitocondrias recién aisladas de ratones 17 , 18 . Los supercomplejos mitocondriales son sensibles a ciclos repetidos de congelación y descongelación, lo que conduce a su desintegración, aunque esto puede ser tolerable para algunos investigadores. Si la congelación es necesaria para el almacenamiento, para asegurar mejores resultados, las muestras no deben someterse...

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Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Este protocolo describe la separación de complejos funcionales de cadenas de transporte de electrones mitocondriales (Cx) IV y sus supercomplejos utilizando electroforesis nativa para revelar información sobre su ensamblaje y estructura. El gel nativo puede someterse a inmunotransferencia, ensayos en gel y purificación por electroelución para caracterizar adicionalmente los complejos individuales.

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Híbrido claro/azul electroforesis nativa para la separación y análisis de Supercomplejos de cadenas respiratorias mitocondriales

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Enriquecimiento de partículas de lipoproteínas nativas con microRNA y determinación posterior de su contenido absoluto/relativo de microRNA y su tasa de transferencia celular

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Medición de complejos de transferencia de electrones mitocondriales en tejido cardíaco previamente congelado de la descendencia de cerda: un modelo para evaluar los cambios bioenergéticos mitocondriales inducidos por el ejercicio

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...