Name: dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum
Uploaded: 2017-06-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum at JoVE.com

Diese Forschung wurde vom Brigham &amp; Women&#39;s Hospital und dem March of Dimes unterstützt. Die Autoren danken allen Mitgliedern des Whited Labs für ihre Unterstützung und Beratung.

Alle Axolotl-Experimente wurden in Übereinstimmung mit Brigham und Women&#39;s Hospital (BWH) Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt. 1. Perfusionsexperiment einrichten <ol><li> Legen Sie ein erwachsenes Axolot in einen mit 0,1% Triacinlösung (MS222) gefüllten Plastikbehälter für 15-20 min oder bis vollständig anästhesiert. Stellen Sie sicher, dass der Behälter mit genügend Triacin-Lösung gefüllt ist, so dass das Axolotl vollständig untergetaucht ist. ...

<ol>
	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

Die Visualisierung der Vaskulatur des Axolotls kann erfolgreich durch Perfusion mit dem lipophilen Carbocyaninfarbstoff DiI erreicht werden. In dieser Studie beschreiben wir ein neuartiges Protokoll für die Perfusion des Axolotls mit DiI mit einer peristaltischen Pumpe. Wir zeigen auch die anschließende Visualisierung des Axolotl-Gefäßsystems mit einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop. Dieses Protokoll war eine Anpassung des Nagetier-DiI-Perfusionsprotokolls, das in Li et al. 7 ...

Die Visualisierung der Vaskulatur spielt eine wesentliche Rolle beim Verständnis der Struktur und Funktion von Organismen über viele Arten hinweg. Ab dem 16. Jahrhundert mit Leonardo da Vinci wurden Modelle und grafische Darstellungen der Zirkulation untersucht 1 . Mit Hilfe von Wachs und Gummi-Formen wurden Gewebe perfundiert, um dreidimensionale Modelle des Gefäßsystems zu schaffen, die das Studium der Organogenese und Pathogenese 1 , 2 erlaubten. Harze und Wachse wurden mit Farbstoffen wie Indien Tinte oder Karminrot gefärbt, um ihre einfache Visualisierung zu ermöglichen 1 , 2 . Allerdings verursachten diese Techniken viele Probleme, weil ihre hohen Viskositäten eine vollständige Perfusion des interessierenden Gewebes verhinderten. Als das Feld anspruchsvoller wurde, kam die Verwendung von konfokalen und Elektronenmikroskopen ins Spiel, indem er die Perfusionstechnologie bewegte<html> Ues weg von Gussformen und zu flüssigen Perfusionen des Gefäßsystems, von denen einige die Perfusion und Bildgebung von Blutgefäßen erlaubt haben, ohne das anfängliche Gewebe 3 zu zerstören. DiI, ein fluoreszierender Carbocyaninfarbstoff, ist ein solcher Fleck, der die Perfusion von Tieren ohne Beschädigung des Gefäßgewebes ermöglicht. Carbocyaninfarbstoffe sind lipophile Farbstoffe, die bei Kontakt in Zellmembranen einfließen. Diese Farbstoffe ermöglichen eine einfache und sofortige Färbung von vaskulären Endothelzellen, die dann unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop betrachtet werden können. DiI bewegt sich über laterale Diffusion in der Lipidmembran von Zellen, wie in der Markierung und Verfolgung von Neuronen gezeigt 4 . Chemikalisch geben die beiden Alkylketten von DiI dem Farbstoff seine hohe Affinität für Zellmembranen, während zwei konjugierte Ringe aus einem Fluorochrom, das für die Emission einer roten Wellenlänge verantwortlich ist, wenn es durch grüne Fluoreszenzlichtfilter angeregt wird&gt; 4 DiI wurde in vielen Kapazitäten eingesetzt, darunter die erfolgreiche Markierung der Plasmamembran und sowohl die anterograde als auch die retrograde Markierung in den Neuronen 5 , 6 . DiI wurde zuvor in Perfusionsprotokollen verwendet, während das Vaskulatur von Mäusen sichtbar gemacht wurde 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sind Salamander, die exklusiv in Brackseen in der Nähe von Mexiko-Stadt, Mexiko leben. Diese Tiere sind zu einem wichtigen Modell für das Verständnis von regenerativen Prozessen geworden, da sie ganze Gliedmaßen, Schwanz (einschließlich Nervenkabel), Teile des Herzens und anderer innerer Organe und Teile des Auges als Erwachsene 8 , 9 regenerieren können . Darüber hinaus ist mit der jüngsten Anwendung von genetischen Werkzeugen in Axolotten ein beispielloser Einblick in die Moleküle und Zellen, die diese Prozesse durchführen, nun möglich 8 . Das erfolgreiche regeneDie Ration eines ganzen Gliedes erfordert einen umfangreichen Revaskularisierungsprozess, der bei der Regeneration eine wesentliche Rolle spielen kann, die über die traditionellen Funktionen der Blutgefäße bei der Bereitstellung von Sauerstoff und Nährstoffen hinausgeht. Das Verständnis der Revaskularisierung im Kontext der Geweberegeneration ist zwingend erforderlich. Axolotl-Blutgefäße wurden zuvor mit India Ink visualisiert, und während die Ergebnisse faszinierend waren, wurde dieser Prozess in den folgenden Jahrzehnten nicht erneut besucht 10 . Wir suchten ein DiI-Perfusionsprotokoll anzupassen, das für den Einsatz in Säugetieren entwickelt wurde, um eine vollständige Perfusion und Visualisierung des Axolotl-Gefäßsystems zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erfolgreich durchgeführt wurden, um die Axolotl-Zirkulation erfolgreich mit einer DiI-Färbetechnik zu visualisieren und anschließend zu visualisieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht eine genaue Visualisierung von Patentblutgefäßen in homöostatischen Geweben sowie in regenerierenden Geweben und stellt eine neuartige Methode zur Visualisierung zur VerfügungN und Analyse des Revaskularisierungsprozesses im Axolotl.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1583">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:405px;">Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Marshall Scientific&#160;</td>
			<td style="width:152px;">RD-RP1</td>
			<td style="width:831px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Perfusion tubing</td>
			<td style="width:195px;">Excelon Lab &#38; Vacuum Tubing</td>
			<td>436901705</td>
			<td>size S1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">27g butterfly needle</td>
			<td style="width:195px;">EXELint Medical Products</td>
			<td>26709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">KCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7747-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Distilled water</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td style="width:195px;">AmericanBio</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFischer</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ethanol (100% vol/vol)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical foreceps&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDG0748741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Polystyrene foam frame</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&#160; cut out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>DYND04025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Scalpel&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Medline</td>
			<td>MDS15210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Absorbent underpad</td>
			<td style="width:195px;">Avacare Medical</td>
			<td>PKUFSx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paper towels</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Standard disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td>50216954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Clamp stand</td>
			<td style="width:195px;">Adafruit</td>
			<td style="width:152px;">291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Tricaine powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Adult axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">MgSO4</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">CaCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Plastic tanks</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Varying size appropriate for the axolotl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Axolotl</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">ET-CY3 Fluorescent Filter</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td>M205FA/M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

Perfusionstechniken wurden seit Jahrhunderten verwendet, um die Zirkulation von Geweben zu visualisieren. Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist eine Spezies von Salamander, die als ein wesentliches Modell für Regenerationsstudien entstanden ist. Es ist wenig bekannt, wie die Revaskularisierung im Zusammenhang mit der Regeneration bei diesen Tieren auftritt. Hier berichten wir über eine einfache Methode zur Visualisierung des Gefäßsystems in Axolotl über Perfusion von 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanin perchlorat (DiI). DiI ist ein lipophiler Carbocyaninfarbstoff, der sofort in die Plasmamembran von Endothelzellen eindringt. Die Perfusion erfolgt mit einer peristaltischen Pumpe, so dass DiI durch die Aorta in die Zirkulation gelangt. Während der Perfusion fließt der Farbstoff durch die Blutgefäße des Axolotls und schließt sich bei Kontakt in die Lipiddoppelschicht von vaskulären Endothelzellen ein. Das Perfusionsverfahren dauert etwa eine Stunde für ein Acht-Zoll-Axolotl. Unmittelbar nach Perfusion wiDas Diolotl kann mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden. Der DiI emittiert Licht im rot-orange Bereich, wenn er mit einem grünen Fluoreszenzfilter angeregt wird. Dieses DiI-Perfusionsverfahren kann verwendet werden, um die vaskuläre Struktur von Axolotten zu visualisieren oder Muster der Revaskularisierung in regenerierenden Geweben zu demonstrieren.

<html> Mit der DiI-Färbung kann die Vaskulatur des Axolotls leicht sichtbar gemacht werden. Blutgefäße von Tieren, die mit dem lipophilen Farbstoff perfundiert wurden, sind sofort unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop sichtbar. Abbildung 1: 1-1.5 ist eine schematische Darstellung des Perfusionsprotokolls. Nach der Perfusion mit dem hellen rosa Farbstoff wird ein erfolgreich perfundiertes Axolotl rosa erscheinen...

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DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Unter Verwendung einer lipophilen 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat (DiI) -Färbetechnik kann Ambystoma mexicanum eine vaskuläre Perfusion durchlaufen, um eine leichte Visualisierung des Gefäßsystems zu ermöglichen.

DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

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