Name: preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy
Uploaded: 2017-05-18T15:00:00
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Diese Forschung wurde von der Li Ka Shing Foundation, die Guangdong High-Level-Universität-Projekt &quot;Green Technologies für Marine Industries&quot;, die Natural Science Foundation von China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant Nr. 30971665, 81172894, 81370925), und die Bildung Abteilung von Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).

8 bis 12 Wochen alte BALB / c-Mäuse wurden von Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, China) gekauft und in einer spezifischen pathogenfreien und klimatisierten Tieranlage aufgewachsen. Tierpflege und experimentelle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Labortieren von Shantou University. 1. Montage des Gerätes <ol><li> Um die Sterilität zu gewährleisten, schalte das UV-Licht einer Gewebekulturhaube für 30 Minuten vor dem G...

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	<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gene+transfer+with+fusogenic+liposomes+containing+vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein.">Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein.</a> J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).</li><li>Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+lipid+nanoparticles+as+efficient+drug+and+gene+delivery+systems:+recent+breakthroughs.">Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs.</a> Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).</li><li>Torchilin, V. 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Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor...

<html> Eine enorme Menge an Aufwand wurde der Etablierung von Ansätzen für Gen-, Enzym- und Zellersatztherapien gewidmet. Dies führte zu großen Durchbrüchen und sogar klinischen Anwendungen 1 , 2 , 3 . In jüngster Zeit wurde eine umstrittene Mitochondrien-Ersatztherapie auf Basis der Nukleustransfertechnologie auf die In-vitro- Fertilisation für Frauen im Alter angewendet oder mit einer tödlichen mitochondrialen DNA-Mutation 4 assoziiert. Defekte, die bei altersbedingten Krankheiten, einschließlich Atherosklerose, Typ-2-Diabetes, Alzheimer-Krankheit und Krebs, gefunden werden, sind in der Regel facettenreich. Es wurde dokumentiert, dass die Ansammlung von Lipidtröpfchen; Die Ablagerung von Amyloidprotein; Die Beibehaltung von entfalteten Proteinen im endoplasmatischen Retikulum; Und defektes Proteasom, Autophagosom und Mitochondrien tragen zur Entwicklung oder Verschlimmerung dieser Krankheiten bei&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Gegenwärtig gibt es keinen verfügbaren Mechanismus zur direkten Sanierung von Fehlfunktionen im Cytosol und Organellen, die Seneszenz und Alterung Phänotypen verursacht. Wir haben bisher über die Erzeugung von Plasmamembran-Vesikeln (PMVs) durch die mechanische Extrusion von Säugetierzellen 12 berichtet. Mit Ausnahme des Kerns wurden in PMVs Komponenten in der Membran oder Cytosol einschließlich Proteine ​​und RNA sowie die Organellen wie Mitochondrien gefunden. Im Wesentlichen kann ein PMV als eine Miniatur-Enkernzelle betrachtet werden. Noch wichtiger ist, dass die Fusion von PMVs mit mitochondrien-defizienten Rho0-Zellen die Mitoseaktivität unter normalen Kulturbedingungen wiederherstellte. Dies ist der erste bericht auf establiEinen potenziell effizienten Ansatz für die Zytoplasma-Ersatztherapie. Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) sind multipotenten Vorläuferzellen, die routinemäßig aus dem Knochenmark erzeugt werden und in Kultur leicht expandiert werden. Embryonale Stammzellmarker Oct4, Nanog und SOX2 wurden bei niedrigen Werten in MSCs 13 nachgewiesen. Telomerase-Aktivität ist auch messbar. Darüber hinaus machen die Abwesenheit von co-stimulierenden Molekülen und menschlichen Leukozyten-Antigen (HLA) Klasse-II-Molekülen sowie einer niedrigen HLA-Klasse-I-Expression auf MSCs ideale ideelle Zellen für die allogene oder &quot;off-the-shelf&quot; Sowohl regenerative Medizin als auch immunmodulatorische Anwendungen 14 . Hier beschreiben wir, wie man PMVs aus Maus-BMSCs durch Extrusion durch eine Polycarbonat-Membran mit 3-Poren-Poren herstellt, die Existenz von Mitochondrien bestimmt und die Aufrechterhaltung des Membranpotentials in PMVs mit confoc untersuchtAl-Mikroskopie, konzentrierte, aber nicht aggregierte PMVs durch Zentrifugation vorbereiten und die In-vivo- Injektion von PMVs in den Gastrocnemius-Muskel von Mäusen durchführen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IsoporeTM membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TSTP04700</td>
			<td>3 mm pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable filter unit</td>
			<td>Xinya, Shanghai, China</td>
			<td>25 mm</td>
			<td>Medical grade polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>328446</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-EGFP</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&#160;6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green FM, 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C2006</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-DiI</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C1036</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td>Mn = 75000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE 2000</td>
			<td>With CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet</td>
			<td>SigaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>For cell transfection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy

Wir haben bisher über die Erzeugung von Plasmamembran-Vesikeln (PMVs) durch die mechanische Extrusion von Säugetierzellen berichtet. Die Fusion von PMVs mit mitochondrialen defizienten Rho0-Zellen stellte die Mitoseaktivität unter normalen Kulturbedingungen wieder her. Atherosklerose, Typ-2-Diabetes, Alzheimer-Krankheit und Krebs sind altersbedingte Erkrankungen, von denen berichtet wurde, dass sie mit mehreren mechanischen und funktionellen Defekten im Cytosol und Organellen einer Vielzahl von Zelltypen assoziiert sind. Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) stellen eine einzigartige Zellpopulation aus dem Knochenmark dar, die Selbsterneuerungsfähigkeiten besitzen und gleichzeitig ihre Multipotenz beibehalten. Die Ergänzung von Seneszenzzellen mit dem jungen Zytoplasma aus autologen BMSCs über die Fusion von PMVs bietet einen vielversprechenden Ansatz, um altersbedingte Phänotypen zu verbessern oder sogar umzukehren. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von PMVs aus BMSCs durch Extrusion durch eine Polycarbonatmembran mit 31, m Poren, bestimmen die Existenz von Mitochondrien und untersuchen die Aufrechterhaltung des Membranpotentials innerhalb von PMVs unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops, konzentrieren PMVs durch Zentrifugation und führen die In-vivo- Injektion von PMVs in den Gastrocnemius-Muskel von Mäusen durch.

Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Vorbereitung von PMVs hängt stark von der korrekten Montage der Filtereinheit ab (Abbildung 1 ), die durch Drücken von 1 mL PBS durch die Membran getestet werden kann. Falls Leckage auftritt, die Filtereinheit wieder zusammenbauen und erneut prüfen. Allerdings kann die Leckage nur zuverlässig getestet werden, wenn die Zellen durch die Membran geschoben werden. Wenn nur wenige PMVs unter einem regulären Mikroskop unter Verwendung...

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Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

Altersbedingte Krankheiten sind mit mehreren Defekten in Komponenten des Zytoplasmas verbunden. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung von Plasmamembran-Vesikeln aus Knochenmark-Mesenchym-Stammzellen. Diese Technik könnte potentiell als Mittel zur Zytoplasma-Ersatztherapie verwendet werden, um altersbedingte Phänotypen zu lindern oder sogar umzukehren.

Vorbereitung von Plasmamembran-Vesikeln aus Knochenmark Mesenchymale Stammzellen für potentielle Zytoplasma-Ersatztherapie

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Ein enzymatisches Verfahren zur mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkproben Clotted Rettung

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Isolieren von Mesangiogenic Progenitorzellen (MPL) aus menschlichem Knochenmark

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Zeitliche Reihenfolge der dynamischen Ausdruck von Daten aus Detaillierte Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...