Name: preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy
Uploaded: 2017-05-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי קרן לי שאנג שינג, פרויקט גואנגדונג ברמה גבוהה אוניברסיטת &quot;ירוק טכנולוגיות לתעשיות ימית&quot;, הקרן למדעי הטבע של סין (http://www.nsfc.gov.cn/ מענק מס &#39;30971665, 81172894, 81370925), ואת מחלקת החינוך של גואנגדונג (http://www.gdhed.edu.cn/ מענק No.cxzd1123).

8 עד 12 שבועות BALB / c עכברים נרכשו מ שנחאי ניסיוני בעלי חיים מרכז (שנחאי, סין) וגדל ב פתוגן ללא מתקן ממוזג ללא תשלום. טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוניים היו בקנה אחד עם הנחיות לשימוש וטיפול של חיות מעבדה שהוקמה על ידי אוניברסיטת שאנטו. 1. ...

<ol>
	<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gene+transfer+with+fusogenic+liposomes+containing+vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein.">Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein.</a> J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).</li><li>Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+lipid+nanoparticles+as+efficient+drug+and+gene+delivery+systems:+recent+breakthroughs.">Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs.</a> Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional,+stimuli-sensitive+nanoparticulate+systems+for+drug+delivery.">Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).</li><li>Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+replacement+therapy+in+reproductive+medicine.">Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).</li><li>L&#243;pez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li><li>Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet-associated+proteins+in+atherosclerosis.">Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis.</a> Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).</li><li>Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+amyloid+and+type+2+diabetes+mellitus.">Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus.</a> N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).</li><li>Jagust, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+amyloid-&#946;+harmful+to+the+brain?+Insights+from+human+imaging+studies.">Is amyloid-&#946; harmful to the brain? Insights from human imaging studies.</a> Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).</li><li>Naidoo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum+stress+response+and+aging.">The endoplasmic reticulum stress response and aging.</a> Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).</li><li>Cuervo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging:+keeping+that+old+broom+working.">Autophagy and aging: keeping that old broom working.</a> Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).</li><li>Bratic, A., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+aging.">The role of mitochondria in aging.</a> J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+VSV-G+produces+fusogenic+plasma+membrane+vesicles+capable+of+efficient+transfer+of+bioactive+macromolecules+and+mitochondria.">Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria.</a> Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).</li><li>Riekstina, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+marker+expression+pattern+in+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow,+adipose+tissue,+heart+and+dermis.">Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis.</a> Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).</li><li>Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+HLA+profiling+and+immunomodulatory+effects+of+human+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).</li><li>Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+culturing+mouse+and+human+bone+marrow+stromal+cells.">A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells.</a> Curr Protoc Immunol. 102, (2013).</li><li>Shahabipour, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Nanoparticulate+tools+for+RNA+interference+and+drug+delivery.">Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery.</a> J Cell Physiol. , (2017).</li><li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+extracellular+vesicles+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).</li><li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+fluid/fluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles.">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).</li><li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles.">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li><li>Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membranes+are+poised+for+activation+of+raft+phase+coalescence+at+physiological+temperature.">Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).</li><li>Pandey, A. P., Sawant, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine:+A+versatile,+multifunctional+non-viral+vector+for+nucleic+acid+delivery.">Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).</li></ol>

Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor...

<html> כמות עצומה של מאמץ הוקדשה להקמת גישות לטיפול בגנים, באנזים ובתאי החלפת תאים. זה הביא פריצות דרך גדולות ואפילו יישומים קליניים 1 , 2 , 3 . לאחרונה, טיפול מחליף מיטוכונדריה שנוי במחלוקת המבוסס על טכנולוגיית העברת גרעין הוחל על הפריה חוץ גופית עבור נשים בגיל מבוגר או נושא מוטציה דנ&quot;א מיטוכונדריאלית קטלנית 4 . פגמים שנמצאו במחלות הקשורות לגיל, כולל טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן, הם לרוב רב פנים. זה כבר מתועד כי הצטברות של טיפות השומנים; את התצהיר של חלבון עמילואיד; שימור חלבונים שהתגלגלו בתוך הרשת האנדופלסמית; ו פרוטאזום פגום, autophagosome, ו המיטוכונדריה לתרום להתפתחות או להחמרה של מחלות אלה&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . כיום, אין מנגנון זמין שמטרתו תיקון ישיר של תקלה ב cytosol ו organelles, אשר גורם ההזדקנות ו פנוטיפים ההזדקנות. יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית ​​הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים 12 . למעט הגרעין, נמצאו המרכיבים בממברנה או בציטוסול, כולל חלבונים ורנ&quot;א, כמו גם את האברונים, כמו המיטוכונדריה, ב- PMV. בעיקרו של דבר, PMV יכול להיחשב לתא אנקלאציה מיניאטורי. חשוב יותר, היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. זהו הדו&quot;ח הראשון על establiShing גישה יעילה פוטנציאלית לטיפול החלפת ציטופלסמה. תאי גזע מוחיים mesenchymal העצם (BMSCs) הם תאים אב multipotent כי הם נוצרים באופן שגרתי ממח העצם והם מורחבים בקלות בתרבות. תאים עובריים של תאי גזע Oct4, Nanog ו- SOX2 התגלו ברמות נמוכות ב- MSC 13 . פעילות הטלומראז ניתנת למדידה. בנוסף, היעדרם של מולקולות מעוררות-גומלין ומולקולות מחלקה II של לויקוציטים אנושיים (HLA), כמו גם ביטוי נמוך של HLA Class I ב- MSC, הופכים אותם לתאים אידיאליים לשימוש באלוגני או &quot;מדף&quot; רפואה משובי ויישומים אימונומודולטוריים 14 . כאן, אנו מתארים כיצד להכין PMVs מ BMSCs העכבר באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 3 מיקרוגרם הנקבוביות, לקבוע את קיומו של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה ב PMVs באמצעות קונפוקאל מיקרוסקופיה, להכין מרוכזים אך לא מצטברים PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IsoporeTM membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TSTP04700</td>
			<td>3 mm pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable filter unit</td>
			<td>Xinya, Shanghai, China</td>
			<td>25 mm</td>
			<td>Medical grade polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>328446</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-EGFP</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&#160;6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green FM, 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C2006</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-DiI</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C1036</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td>Mn = 75000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE 2000</td>
			<td>With CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet</td>
			<td>SigaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>For cell transfection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy

יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית ​​הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים. היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן הן מחלות הקשורות לגיל, אשר דווחו כי הן קשורות למספר פגמים מכניים ופונקציונליים בציטוזול ובאברונים של מגוון סוגי תאים. תאי גזע מוחיים mesenchymal (BMSCs) מייצגים אוכלוסיית תאים ייחודית ממח העצם, בעלת יכולות התחדשות עצמית, תוך שמירה על ריבוי המרכיבים שלהם. התוספת של תאים ההזדקנות עם cytoplasm צעירים מ BMSCs אוטולוגיים באמצעות היתוך של PMVs מספק גישה מבטיחה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין PMVs מ BMSCs באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 31, נקבוביות, לקבוע את קיומה של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה בתוך PMVs באמצעות מיקרוסקופ confocal, להתרכז PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.

המפתח ההכנה המוצלחת של PMVs תלוי במידה רבה על הרכבה נכונה של יחידת המסנן ( איור 1 ), אשר ניתן לבדוק על ידי דחיפת 1 מ&quot;ל של PBS דרך הממברנה. אם מתרחשת דליפה, חבר מחדש את יחידת המסנן ובדוק שוב. עם זאת, דליפה ניתן רק לבדוק באופן מהימן כאשר תאים נדחפים ד...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy at JoVE.com

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

מחלות הקשורות לגיל קשורות למספר פגמים במרכיבי הציטופלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת שלפוחית ​​הממברנה פלזמה מתאי גזע העצם mesenchymal. טכניקה זו יכולה לשמש כאמצעי טיפולי החלפת ציטופלסמה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים.

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

הכנת שלפוחית הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה