Name: preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy
Uploaded: 2017-05-18T15:00:00
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この研究は、Li Ka Shing財団、中国の自然科学財団（http://www.nsfc.gov.cn/助成金番号30971665、広東省高水準大学プロジェクト「海洋産業のためのグリーンテクノロジー」） 81172894、81370925）、広東省の教育部（http://www.gdhed.edu.cn/助成金番号cxzd1123）を参照してください。

8〜12週齢のBALB / cマウスをShanghai Experimental Animal Center（上海、中国）から購入し、特定の病原体および空調された動物施設で飼育した。動物のケアおよび実験手順は、汕頭大学によって設立された実験動物の使用およびケアのためのガイドラインに従っていた。 1.装置の組み立て<ol><li>無菌性を確保するために、使用前に組織培養フードのUV光を30分間点灯させます。 </l...

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	<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gene+transfer+with+fusogenic+liposomes+containing+vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein.">Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein.</a> J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).</li><li>Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+lipid+nanoparticles+as+efficient+drug+and+gene+delivery+systems:+recent+breakthroughs.">Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs.</a> Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).</li><li>Torchilin, V. 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M., Hantash, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+HLA+profiling+and+immunomodulatory+effects+of+human+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).</li><li>Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+culturing+mouse+and+human+bone+marrow+stromal+cells.">A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells.</a> Curr Protoc Immunol. 102, (2013).</li><li>Shahabipour, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Nanoparticulate+tools+for+RNA+interference+and+drug+delivery.">Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery.</a> J Cell Physiol. , (2017).</li><li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+extracellular+vesicles+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).</li><li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+fluid/fluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles.">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).</li><li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles.">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li><li>Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membranes+are+poised+for+activation+of+raft+phase+coalescence+at+physiological+temperature.">Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).</li><li>Pandey, A. P., Sawant, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine:+A+versatile,+multifunctional+non-viral+vector+for+nucleic+acid+delivery.">Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).</li></ol>

Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor...

<html>遺伝子、酵素および細胞置換療法のためのアプローチを確立することに多大な努力が注がれてきた。これは大きなブレークスルー、さらには臨床応用1,2,3をもたらしました。最近、核移植技術に基づいた議論の余地のあるミトコンドリア補充療法が、高齢の女性または致死的ミトコンドリアDNA突然変異を有する女性の体外受精に適用された 4 。アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病、アルツハイマー病、および癌を含む、年齢関連疾患に見られる欠陥は、通常多面的である。脂質液滴の蓄積が報告されている。アミロイドタンパク質の沈着;小胞体における折り畳まれていないタンパク質の保持;オートファゴソーム、およびミトコンドリアの欠陥が、これらの疾患の発症または悪化に寄与する&quot;xref&quot;&gt; 5,6,7,8,9,10,11。現在、老化および老化表現型を引き起こす細胞質および細胞小器官における機能不全の直接修復を目的とした利用可能なメカニズムは存在しない。 私たちはこれまで、哺乳動物細胞の機械的な押し出しによる原形質膜小胞（PMVs）の生成について報告しています12 。核を除いて、膜または細胞質ゾル（タンパク質およびRNAを含む）ならびに細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）の成分が、PMVにおいて見出された。本質的に、PMVは小型除核細胞とみなすことができる。さらに重要なことに、PMVとミトコンドリア欠損Rho0細胞との融合は、正常培養条件下で有糸分裂活性を回復させた。これは、最初の報告書です。潜在的に効率的な細胞質補充療法のアプローチを提案している。 骨髄間葉系幹細胞（BMSC）は、骨髄から日常的に生成され、培養において容易に増殖する多能性前駆細胞である。胚性幹細胞マーカーOct4、Nanog、およびSOX2は、MSCsにおいて低レベルで検出されている13 。テロメラーゼ活性も測定可能である。さらに、MSC上での共刺激分子およびヒト白血球抗原（HLA）クラスII分子の不在および低HLAクラスI発現は、それらを同種異系または「既製品」使用のための理想的な細胞にする再生医療と免疫調節アプリケーションの両方14 。 ここでは、3μm孔のポリカーボネート膜を介した押し出しによるマウスBMSCからPMVを調製する方法、ミトコンドリアの存在を決定する方法、およびコンポックを用いてPMVにおける膜電位の維持を調べる方法を説明する遠心分離によって濃縮されたが凝集していないPMVを調製し、マウスの腓腹筋にPMVをインビボで注入する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IsoporeTM membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TSTP04700</td>
			<td>3 mm pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable filter unit</td>
			<td>Xinya, Shanghai, China</td>
			<td>25 mm</td>
			<td>Medical grade polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>328446</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-EGFP</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&#160;6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green FM, 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C2006</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-DiI</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C1036</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td>Mn = 75000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE 2000</td>
			<td>With CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet</td>
			<td>SigaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>For cell transfection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy

私たちはこれまで、哺乳動物細胞の機械的押出しによる原形質膜小胞（PMV）の生成について報告してきた。 PMVとミトコンドリア欠損Rho0細胞との融合は、正常培養条件下で有糸分裂活性を回復させた。アテローム性動脈硬化症、2型糖尿病、アルツハイマー病および癌は、様々な細胞型の細胞質ゾルおよび細胞小器官における複数の機械的および機能的欠陥に関連すると報告されている加齢性疾患である。骨髄間葉系幹細胞（BMSC）は、多能性を維持しながら自己再生能力を有する骨髄由来の独特の細胞集団を表す。 PMVの融合を介した自己BMSCからの若い細胞質による老化細胞の補充は、加齢に関連する表現型を改善する、または逆転させる有望なアプローチを提供する。このプロトコルは、押出によってBMSCからPMVをポリカーボネート膜を介して3つミオソンドリアの存在を判定し、共焦点顕微鏡を用いてPMV内の膜電位の維持を調べ、遠心分離によってPMVを濃縮し、マウスの腓腹筋にPMVのインビボ注入を行う。

PMVをうまく調製するための鍵は、1mLのPBSをメンブレンに通して試験することができるフィルターユニット（ 図1 ）の正しい組み立てに大きく依存します。漏れが発生した場合は、フィルタユニットを再度組み立て、再度テストしてください。しかし、漏出は、細胞が膜を通って押し出されたときにのみ確実に試験することができる。 10倍の対物レンズを?...

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Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

加齢性疾患は、細胞質成分の複数の欠陥に関連している。ここでは、骨髄間葉系幹細胞から原形質膜小胞を調製するためのプロトコールを提示する。この技術は、加齢に関連した表現型を改善する、またはそれを逆転させるための細胞質置換療法の手段として潜在的に使用することができる。

潜在的細胞質置換療法のための骨髄間葉系幹細胞からの血漿膜小胞の調製

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

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Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

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分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

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Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

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