Name: preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy
Uploaded: 2017-05-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy at JoVE.com

Bu araştırma, Li Ka Shing Vakfı, Guangdong Yüksek Düzeyli Üniversite Projesi &quot;Deniz Teknolojileri için Yeşil Teknolojiler&quot;, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) ve Guangdong Eğitim Bölümü (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).

8 ila 12 haftalık BALB / c fareleri Shanghai Experimental Animal Center&#39;dan (Shanghai, Çin) satın alındı ​​ve spesifik patojen içermeyen ve klimalı bir hayvan tesisinde yetiştirildi. Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Shantou Üniversitesi tarafından kurulan laboratuar hayvanlarının kullanımı ve bakımına ilişkin esaslara uygundu. 1. Cihazın Montajı <ol><li> Steriliyet sağlamak için, kullanmadan önce 30 dakika boyunca bir doku kültürü kapağının UV ?...

<ol>
	<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gene+transfer+with+fusogenic+liposomes+containing+vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein.">Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein.</a> J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).</li><li>Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+lipid+nanoparticles+as+efficient+drug+and+gene+delivery+systems:+recent+breakthroughs.">Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs.</a> Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional,+stimuli-sensitive+nanoparticulate+systems+for+drug+delivery.">Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).</li><li>Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+replacement+therapy+in+reproductive+medicine.">Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).</li><li>L&#243;pez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li><li>Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet-associated+proteins+in+atherosclerosis.">Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis.</a> Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).</li><li>Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+amyloid+and+type+2+diabetes+mellitus.">Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus.</a> N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).</li><li>Jagust, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+amyloid-&#946;+harmful+to+the+brain?+Insights+from+human+imaging+studies.">Is amyloid-&#946; harmful to the brain? Insights from human imaging studies.</a> Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).</li><li>Naidoo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum+stress+response+and+aging.">The endoplasmic reticulum stress response and aging.</a> Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).</li><li>Cuervo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging:+keeping+that+old+broom+working.">Autophagy and aging: keeping that old broom working.</a> Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).</li><li>Bratic, A., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+aging.">The role of mitochondria in aging.</a> J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+VSV-G+produces+fusogenic+plasma+membrane+vesicles+capable+of+efficient+transfer+of+bioactive+macromolecules+and+mitochondria.">Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria.</a> Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).</li><li>Riekstina, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+marker+expression+pattern+in+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow,+adipose+tissue,+heart+and+dermis.">Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis.</a> Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).</li><li>Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+HLA+profiling+and+immunomodulatory+effects+of+human+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).</li><li>Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+culturing+mouse+and+human+bone+marrow+stromal+cells.">A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells.</a> Curr Protoc Immunol. 102, (2013).</li><li>Shahabipour, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Nanoparticulate+tools+for+RNA+interference+and+drug+delivery.">Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery.</a> J Cell Physiol. , (2017).</li><li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+extracellular+vesicles+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).</li><li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+fluid/fluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles.">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).</li><li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles.">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li><li>Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membranes+are+poised+for+activation+of+raft+phase+coalescence+at+physiological+temperature.">Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).</li><li>Pandey, A. P., Sawant, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine:+A+versatile,+multifunctional+non-viral+vector+for+nucleic+acid+delivery.">Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).</li></ol>

Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor...

<html> Gen, enzim ve hücre replasman tedavileri için yaklaşımlar oluşturmak için büyük çaba harcandı. Bu, büyük ilerlemeler ve hatta klinik uygulamalarla sonuçlandı 1 , 2 , 3 . Yakın zamanda, yaşlı kadınların veya ölümcül mitokondriyal DNA mutasyonu taşıyan in vitro döllenmeye çekirdek transfer teknolojisine dayalı tartışmalı bir mitokondria replasman tedavisi uygulanmıştır4. Ateroskleroz, tip 2 diyabet, Alzheimer hastalığı ve kanser gibi yaşla ilişkili hastalıklarda bulunan kusurlar genellikle çok yönlüdür. Lipid damlacıklarının birikiminin; Amiloid proteinin birikimi; Açılmış proteinlerin endoplazmik retikulumda tutulması; Ve arızalı proteazom, otofagozom ve mitokondri bu hastalıkların gelişimine veya şiddetlenmesine katkıda bulunur&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Halen, yaşlanmaya ve yaşlanmaya neden olan fenotiplere neden olan sitozol ve organellerde arızanın doğrudan düzeltilmesini amaçlayan herhangi bir mekanizma mevcut değildir. Daha önce, memeli hücrelerinin mekanik ekstrüzyonu yoluyla plazma zar veziküllerinin (PMV&#39;lerin) üretimini bildirdik 12 . Çekirdek dışında, PMV&#39;lerde protein ve RNA da dahil olmak üzere zar veya sitoplazmadaki bileşenlerin yanı sıra mitokondri gibi organel bileşikleri de bulundu. Esasen, bir PMV minyatür enükleated hücre olarak kabul edilebilir. Daha da önemlisi, PMV&#39;lerin mitokondriyal eksik Rho0 hücreleri ile birleşmesi, normal kültür koşulları altında mitotik aktiviteyi geri kazandırdı. Bu, establi hakkındaki ilk rapordur.Sitoplazma replasman tedavisi için potansiyel olarak verimli bir yaklaşım savunur. Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC&#39;ler), kemik iliğinden rutin olarak üretilen ve kültürde kolaylıkla genişleyen multipotent progenitör hücrelerdir. Embriyonik kök hücre markörleri Oct4, Nanog ve SOX2 MSC&#39;lerde düşük seviyelerde tespit edildi 13 . Telomeraz etkinliği de ölçülebilirdir. Buna ek olarak, yardımcı uyarıcı moleküller ve insan lökosit antijeni (HLA) Sınıf II moleküllerinin yanı sıra MSC&#39;lerde düşük HLA Sınıf I ifadesi bulunmadığından, bunları allojenik veya &quot;raflarda&quot; kullanım için ideal hücreler haline getirir Hem rejeneratif tıp hem de immünomodülatör uygulamalar 14 . Burada, 3-μm gözenekli bir polikarbonat zar yoluyla ekstrüzyon yoluyla fare BMSC&#39;lerden PMV&#39;lerin nasıl hazırlanacağını, PMV&#39;lerde mitokondri varlığını belirleyip, confoc kullanarak PMV&#39;lerin bakımını inceliyoruz.Konsantre fakat agregasyonsuz PMV&#39;leri santrifüjleme ile hazırlayın ve PMV&#39;lerin farelerin gastroknemius kütlesine in vivo enjeksiyonu gerçekleştirin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IsoporeTM membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TSTP04700</td>
			<td>3 mm pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable filter unit</td>
			<td>Xinya, Shanghai, China</td>
			<td>25 mm</td>
			<td>Medical grade polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>328446</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-EGFP</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&#160;6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green FM, 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C2006</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-DiI</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C1036</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td>Mn = 75000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE 2000</td>
			<td>With CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet</td>
			<td>SigaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>For cell transfection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy

Daha önce, memeli hücrelerinin mekanik ekstrüzyonu yoluyla plazma zar veziküllerinin (PMV&#39;ler) üretimini bildirdik. PMV&#39;lerin mitokondriyal yetersiz Rho0 hücreleri ile birleşmesi, normal kültür koşullarında mitotik aktiviteyi geri kazandırdı. Ateroskleroz, tip 2 diyabet, Alzheimer hastalığı ve kanser, çeşitli hücre tiplerinin sitolol ve organellerinde çok sayıda mekanik ve fonksiyonel kusur ile ilişkili olduğu bildirilen yaşa bağlı hastalıklardır. Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC&#39;ler), kendi çoktanlıklarını korurken kendi kendini yenileme kabiliyetlerine sahip olan kemik iliğinden gelen benzersiz bir hücre popülasyonunu temsil eder. Yaşlanmayı önleyici hücrelerin, otolog BMSC&#39;lerden genç sitoplazması ile PMV&#39;lerin füzyonu yoluyla eklenmesi, yaşa bağlı fenotiplerin iyileştirilmesi veya hatta tersine çevrilmesi için umut verici bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, 3&#39;lü polikarbonat membran içinden ekstrüzyon yoluyla BMSC&#39;lerden PMV&#39;lerin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır.1 gözenekleri, mitokondri varlığını belirlemek ve bir konfokal mikroskop kullanarak PMV&#39;ler içinde zar potansiyelinin bakımı incelemek, santrifüj ile PMVs konsantre ve farelerin gastroknemius kas içine PMVs in vivo enjeksiyonu gerçekleştirmek.

PMV&#39;lerin başarılı bir şekilde hazırlanmasının anahtarı, filtre ünitesinin doğru şekilde monte edilmesine ( Şekil 1 ) bağlıdır ve membrandan 1 mL PBS iterek test edilebilir. Sızıntı oluşursa, filtre ünitesini tekrar monte edin ve tekrar test edin. Bununla birlikte, sızıntı, hücreler zardan içeri itildiğinde güvenilir şekilde test edilebilir. 10X objektif kullanarak normal bir mikroskopta yalnızca birkaç PMV tespit edilirse veya PMV&#39;l...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy at JoVE.com

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

Yaşa bağlı hastalıklar, sitoplazmadaki bileşenlerin birden fazla kusuru ile ilişkilidir. Burada, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden plazma membran veziküller hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik yaşla ilişkili fenotipleri iyileştirmek veya hatta tersine çevirmek için sitoplazma replasman tedavisi aracı olarak potansiyel olarak kullanılabilir.

Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Bir Enzimatik Yöntem Kaymaklı Kemik İliği Örneklerinden Mezenkimal Kök Hücreler Kurtarma

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

İnsan Kemik İliği gelen Yalıtımlı Mesangiogenic Ata Hücreleri (MPCs)

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...