Name: glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

يقر المؤلفون آن شاراي في خدمة علم الأحياء الإشعاعية (مستشفى ليون سود) و فوند ناتيونال سويس (فنس) على دعمهم المالي.

1. إعداد ثقافة الخلية وسائل الإعلام والحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الإعلام الثقافية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسط التكاثر (بيإم) عن طريق تكملة المتوسط ​​F-10 هام مع الجلوتامين (2 ملم) والبنسلي...

<html> امتصاص الجلوكوز هو القياس البيولوجي الرئيسي لاختبار المنشطات أو مثبطات على ثقافة الخلية وكيف أنها تؤثر على استخدام الجلوكوز، وقدرة الخلية على الاستجابة للأنسولين. وقد تبين أن الطريقة الموصوفة هنا لتكون سريعة وموثوق بها، وقد استخدمت على نطاق واسع في العديد من ال...

العضلات الهيكلية هي أكبر إيداع الجلوكوز في الثدييات ويسهم إلى حد كبير في التوازن الجلوكوز. هذا الانسولين استجابة النسيج هو الموقع الرئيسي للامتصاص الجلوكوز التي يتم تشغيلها من قبل التحفيز الأنسولين 1 . في مرض السكري من النوع 2، لوحظ مقاومة الأنسولين في عدة أنسجة، بما في ذلك العضلات والهيكل العظمي، ويؤدي إلى تركيز السكر في الدم الطبيعي. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لتحديد مستوى حساسية الانسولين من هذا النسيج وخلاياه، سواء كان الهدف هو وصف عيب في الموضوع، أو لتقييم كفاءة العلاج الذي يهدف إلى تحسينه. في المواضيع البشرية أو الحيوانية، تقنية الذهب القياسية لتقييم حساسية الأنسولين هو المشبك فرط الإنسولين-سكر الدم. مقدمة من قبل ديفرونزو في عام 1979 2 وتعديلها منذ 3 ، 4 ثم، طريقة تسمح لتحديد الجسم كله أأنسجة الاستجابة الانسولين قياسها كما معدل الجلوكوز ليكون بيرفوسد تحت التحفيز الأنسولين للحفاظ على تركيز السكر في الدم الطبيعي. ويمكن أيضا أن تنجز حساسية حساسية الأنسولين على مستوى الخلية باستخدام نماذج العضلات في المختبر ، وقياس معدلات امتصاص الجلوكوز يبقى أداة فعالة وموثوق بها لقياس الاستجابة البيولوجية للخلية لتحفيز الأنسولين 5 ، 6 ، 7 . في الواقع، قياس امتصاص الجلوكوز يحد من الاستجابة البيولوجية الخلية لتحفيز الأنسولين، من ربط الأنسولين لمستقبله إلى نقل الحويصلات المخصبة GLUT4، بما في ذلك إشارات الخلايا والتسلسل الفسفرة 8 . هذا هو ذات أهمية كبيرة مع العينات البشرية، كما ميوتوبيس متباينة الحفاظ على العديد من الميزات من النمط الظاهري المانحة، بما في ذلك فتحة التمثيل الغذائيوالاضطرابات التي لوحظت في المريض 9 ، 10 ، 11 ، 12 . ميوتوبيس يعرض التشابه الهيكلي والتمثيل الغذائي والمظاهر الظاهرية للعضلات الهيكل العظمي 13 ، 14 ، بما في ذلك التعبير عن ناقلات الجلوكوز 15 وآلات الإشارات الأنسولين الخلوية 16 . وبالتالي، قياس امتصاص الجلوكوز في ميوتوبيس الابتدائي هو ذات الصلة لوصف النمط الظاهري العضلات من المانحين، أو التحقيق في تأثير التدخل (المخدرات، والتغذية، أو النشاط البدني) على حساسية الأنسولين في خلايا العضلات. قياس امتصاص الجلوكوز على ميوتوبيس مثقف أيضا هو أداة موثوق بها عند إجراء التجارب التي تعدل حساسية الأنسولين 17 ، 18 . في المختبر </إم&gt; مناسبة لاختبار أي مركبات يمكن أن تحسن استجابة الأنسولين، أو يمكن أن تمنع أو تعكس مقاومة الأنسولين المكتسبة أو المستحثة 19 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 . نحن هنا وصف بروتوكول مفصل للثقافة والتمييز ميوتوبيس الإنسان وقياس معدلات امتصاص الجلوكوز الخلية. وتنطبق هذه الطريقة على أي مصدر من خلايا السلائف العضلية البشرية، سواء أكانت من مستحضرات التحضير للمختبر أو التعاون أو الموردين المتاحين تجاريا. خلد خلايا الخلايا العضلية، مثل C2C12 و L6، على التوالي من الماوس وأصل الفئران، ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس امتصاص الجلوكوز مع هذا البروتوكول 7 . نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد معدلات في الدول القاعدية وحفز الأنسولين باستخدام راديولبلد [ 3 H] 2dG. تيانه استخدام التناظرية الجلوكوز وصفت يسمح تحديد دقيق من دخول الجلوكوز مع انخفاض المواد بدءا، وهو شرط شائع عند العمل مع الخلايا الأولية. جزيء الجلوكوز المعدل غير قادر على دخول مسارات التمثيل الغذائي، وبالتالي، يتراكم داخل الخلية، مما يسمح الكمي موثوق بها عن طريق النشاط الإشعاعي الكلي الخلية. وتشمل الظروف التجريبية استخدام مثبط نقل الجلوكوز (السيتوكالاسين B)، ويتم إجراء القياسات مع وبدون الأنسولين. هذا الجمع يسمح لتحديد معدلات دخول نشطة الجلوكوز، فضلا عن حساب تغيير أضعاف لمؤشر استجابة الأنسولين. يتم تقديم طريقة مع جرعة واحدة من الأنسولين خلال فترة حضانة واحدة، ولكن يمكن بسهولة تعديل البروتوكول لاستجابة الجرعة أو الوقت التجارب بالطبع 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

العضلات الهيكلية هي أكبر إيداع الجلوكوز في الثدييات ويسهم إلى حد كبير في التوازن الجلوكوز. تقييم حساسية الأنسولين من خلايا العضلات ذات أهمية كبيرة لجميع الدراسات المخصصة لاستكشاف التمثيل الغذائي الجلوكوز في العضلات وتوصيف التعديلات الأيضية. في خلايا العضلات، نقل الجلوكوز نوع 4 (GLUT4) البروتينات ترانزلاتيون إلى غشاء البلازما ردا على الأنسولين، مما يسمح دخول كميات كبيرة من الجلوكوز في الخلية. قدرة خلايا العضلات على الاستجابة للأنسولين عن طريق زيادة معدل امتصاص الجلوكوز هي واحدة من قراءات القياسية لقياس حساسية الخلايا العضلية للأنسولين. ميوتوبيس الإنسان الأولية هي مناسبة في نموذج المختبر ، كما تحافظ الخلايا على العديد من الميزات من النمط الظاهري المانحة، بما في ذلك حساسية الأنسولين. هذا النموذج في المختبر هو أيضا مناسبة لاختبار أي المركبات التي يمكن أن تؤثر على استجابة الأنسولين. قياسات معدل امتصاص الجلوكوز في ميوتوبيس متباينة تعكسحساسية الأنسولين. في هذه الطريقة، يتم استزراع خلايا العضلات الأولية في المختبر للحصول على ميوتوبيس متباينة، ويتم قياس معدلات امتصاص الجلوكوز مع وبدون التحفيز الأنسولين. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد معدلات انتقال الجلوكوز السلبي والنشط باستخدام راديولبلد [ 3 H] 2-ديوكسي- D- الجلوكوز ([ 3 H] 2dG). يتم توفير طرق الحساب لتحديد معدل نشط القاعدية والأنسولين المحفزة، وكذلك تحفيز أضعاف.

في يوم 3، ميوبلاستس تصل التقاء ( الشكل 1A ). وعادة ما تكون ميوبلاستس في هذه المرحلة أحادي النواة. تم تغيير المتوسطة وفي يوم 8، تم الانتهاء من التمايز ( الشكل 1B ) (بروتوكول القسم 2). بعد 5 أيام من التمايز، يتم محاذاة ميوتوبيس ?...

Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

في هذه الطريقة، يتم استزراع خلايا العضلات الأولية الإنسان في المختبر للحصول على ميوتوبيس متباينة ويتم قياس معدلات امتصاص الجلوكوز. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد معدلات في الدول القاعدية وحفز الأنسولين باستخدام راديولبلد [ 3 H] 2-ديوكسي- D- الجلوكوز.

قياس امتصاص الجلوكوز والاستجابة لتحفيز الأنسولين في<em&gt; في المختبر</em&gt; مثقف الإنسان ميوتوبيس الابتدائية

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

حقن الانسولين واستخراج الدملمف لقياس حساسية الانسولين في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

النقل عضية في مثقف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا: S2 الخط الخليوي والخلايا العصبية الابتدائية.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

تحفيز حشوية DNA الاستشعار عن مسارات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

إسكات<em&gt; BRCA2</em&gt; من التعرف على رواية الوظائف البيولوجية التنظيم BRCA2 في الخلايا البشرية المستزرعة

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

قياس امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في العضلات الهيكلية الناضجة المعزولة والمحتضنة من الفئران

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...