Name: glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

De auteurs erkennen Anne Charrié bij de Radiobiology-dienst (Lyon-Sud-ziekenhuis) en de Fonds National Suisse (FNS) voor hun financiële steun.

1. Bereiding van celcultuurmedia en -oplossingen <ol><li> Bereiding van cultuurmedia <ol><li> Bereid proliferatiemedium (PM) door Ham&#39;s F-10-medium aan te vullen met glutamine (2 mM), penicilline / streptomycine (5 μg / ml finale), 2% foetale kalf serum (FCS) en 2% serum substitutie. </li><li> Bereid het differentiatiemedium (DM) door Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) met glutamine (2 mM), penicilline / streptomycine (5 μg / mL finale) en 2% FCS aan te vullen. </li></ol></li><li> <stro...

Glucoseopname is een belangrijke biologische meting voor het testen van activatoren of remmers op celcultuur en hoe ze het gebruik van glucose beïnvloeden, en het vermogen van de cel om te reageren op insuline. De hier beschreven werkwijze is snel en betrouwbaar gebleken en is veel gebruikt in veel studies met primaire myotubes van gezonde proefpersonen en / of metabolisch getroffen patiënten 6 , 7 , 10 , <sup clas...

Skeletspier is de grootste glucosebepaling bij zoogdieren en draagt ​​bij tot de glucose homeostase. Dit insuline responsieve weefsel is de primaire plaats van de glucose opname die wordt geactiveerd door insuline stimulatie 1 . Bij type 2 diabetes wordt insuline resistentie waargenomen in verschillende weefsels, inclusief skeletspier, en leidt tot een hogere normale bloedglucoseconcentratie. Zo is het van groot belang om het niveau van de insuline gevoeligheid van dit weefsel en zijn cellen te bepalen, of het doel is om een ​​defect in een vak te karakteriseren of om de efficiëntie van een behandeling te evalueren die van plan is om deze te verbeteren. Bij menselijke of dierlijke onderwerpen is de gouden standaard techniek om insuline gevoeligheid te beoordelen, de hyperinsulinemische-euglycemische klem. In 1979 door DeFronzo geïntroduceerd en gewijzigd sinds 3 , 4 , laat de methode toe om het hele lichaam a te kwantificerenNd weefsels insuline responsiviteit gemeten als de snelheid van glucose te worden geperfuseerd onder insuline stimulatie om de normale bloedglucoseconcentratie te behouden. Insuline gevoeligheid verkenning kan ook op het celniveau worden uitgevoerd met in vitro spiermodellen, en de meting van glucose opname tarieven blijft een efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel om de biologische respons van de cel te kwantificeren naar insuline stimulatie 5 , 6 , 7 . In feite kwantificeert glucose opname meting de celbiologische respons op insuline stimulatie, van de binding van insuline aan de receptor tot translocatie van GLUT4 verrijkte blaasjes, en omvat intracellulaire signalering en fosforylatie cascades 8 . Dit is van groot belang bij menselijke monsters, aangezien gedifferentieerde myotubes veel eigenschappen van het donorfenotype handhaven, met inbegrip van metabolische eigenschappenZiekten en aandoeningen waargenomen in de patiënt 9 , 10 , 11 , 12 . De myotubes tonen structurele, metabolische en fenotypische overeenkomsten met de skeletspier 13 , 14 , met inbegrip van de expressie van glucosetransporteurs 15 en de cellulaire insulinsignaalmachines 16 . Zo is de meting van de glucoseopname in primaire myotubes van belang voor het karakteriseren van het spierfenotype van een donor of het onderzoek van het effect van een interventie (medicijn, voeding of lichamelijke activiteit) op de insuline gevoeligheid in de spiercel. De meting van glucoseopname op gekweekte myotubes is ook een betrouwbaar hulpmiddel bij het uitvoeren van experimenten die de gevoeligheid van insuline 17 , 18 wijzigen . De in vitro </Em&gt; -model is geschikt voor de test van verbindingen die de insuline-responsiviteit kunnen verbeteren, of de verworven of geïnduceerde insulineresistentie 19 , 20 , 21 , 22 , 23 kunnen voorkomen of terugkeren. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor cultuur en differentiëren van menselijke myotubes en het meten van celglucose opname. De methode is van toepassing op elke bron van menselijke spiervoorlopercellen, of ze afkomstig zijn uit in-lab preparaten, samenwerking of commercieel leveranciers. Immortalized spiercellijnen, respectievelijk C2C12 en L6, respectievelijk van oorsprong uit muis en rat, kunnen ook gebruikt worden voor het meten van glucoseopname met dit protocol 7 . Wij bieden een gedetailleerd protocol om tarieven te berekenen in basale en insuline gestimuleerde staten met radioactief gemerkte [ 3 H] 2dG. THij gebruikt van een gelabelde glucose analoog zorgt voor een nauwkeurige bepaling van de glucose ingang met gereduceerd uitgangsmateriaal, een algemene voorwaarde bij het werken met primaire cellen. Het gemodificeerde glucosemolecuul is niet in staat metabolische wegen in te voeren en verzamelt zich dus binnen de cel, waardoor betrouwbare kwantificering via totale celradioactiviteit mogelijk is. Experimentele condities omvatten het gebruik van een glucosetransportremmer (cytochalasin B), en metingen worden uitgevoerd met en zonder insuline. Deze combinatie maakt het mogelijk de glucose actieve toetredingswaarden vast te stellen, evenals de berekening van de vouwverandering voor de insuline-responsindex. De methode wordt gepresenteerd met één dosis insuline gedurende een enkele incubatietijd, maar het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor dosis respons of tijdschool experimenten 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

Skeletspier is de grootste glucosebepaling bij zoogdieren en draagt ​​bij tot de glucose homeostase. De beoordeling van de insuline gevoeligheid van spiercellen is van groot belang voor alle studies die zijn gericht op het onderzoeken van spierglucose metabolisme en karakteriserende metabolische veranderingen. In spiercellen translateert glucose transporter type 4 (GLUT4) eiwitten naar het plasmamembraan in reactie op insuline, waardoor massale glucose in de cel wordt toegediend. Het vermogen van spiercellen om te reageren op insuline door het verhogen van de snelheid van glucose opname is een van de standaard uitlezingen om de spiercel gevoeligheid voor insuline te kwantificeren. Menselijke primaire myotubes zijn een geschikt in vitro model, omdat de cellen veel eigenschappen van het donorfenotype handhaven, inclusief insuline gevoeligheid. Dit in vitro model is ook geschikt voor de test van verbindingen die de insuline-responsiviteit kunnen beïnvloeden. Metingen van de glucose opname snelheid in gedifferentieerde myotubes weerspiegelenInsuline gevoeligheid. Bij deze methode worden humane primaire spiercellen in vitro gekweekt om gedifferentieerde myotubes te verkrijgen en de opname van glucose met en zonder insulinerstimulatie worden gemeten. Wij bieden een gedetailleerd protocol om passieve en actieve glucosetransportcijfers te kwantificeren met radioactief gemerkte [3H] 2-deoxy-D-glucose ([ 3 H] 2dG). Berekeningsmethoden worden verstrekt om de actieve basale en insuline gestimuleerde percentages te kwantificeren, evenals stimulatievouw.

Op dag 3 bereiken myoblasten samenloop ( figuur 1A ). De myoblasten in dit stadium zijn meestal mononucleated. Medium is veranderd en op dag 8 is de differentiatie voltooid ( Figuur 1B ) (protocol sectie 2). Na 5 dagen van differentiatie zijn myotubes uitgelijnd en typisch polynucleated. Menselijke primaire myotubes werden onderworpen aan een palmitaat of een BSA-enige behandeling voor het meten van glucose opname. Cellen werden...

Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Bij deze werkwijze worden humane primaire spiercellen in vitro gekweekt om gedifferentieerde myotubes te verkrijgen en de opname van glucose wordt gemeten. Wij bieden een gedetailleerd protocol om de tarieven in basale en insuline gestimuleerde staten te kwantificeren met radioactief gemerkte [3H] 2-deoxy-D-glucose.

Glucoseopname-meting en respons op insuline stimulatie in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insuline-injectie en hemolymfe Extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organel Transport in gekweekte<em&gt; Drosophila</em&gt; Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulatie van Cytoplasmatische DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Meten-Glutathion geïnduceerde Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing van<em&gt; BRCA2</em&gt; Naar Novel-BRCA2 geregeld biologische functies Identificeer in gekweekte menselijke cellen

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Meting van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren van muizen

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...