Name: glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Die Autoren bestätigen Anne Charrié bei der Radiobiologie (Lyon-Sud Krankenhaus) und der Fond National Suisse (FNS) für ihre finanzielle Unterstützung.

1. Vorbereitung von Zellkulturmedien und -lösungen <ol><li> Vorbereitung von Kulturmedien <ol><li> Bereiten Sie das Proliferationsmedium (PM) vor, indem Sie das F-10-Medium von Ham mit Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (5 &amp; mgr; g / ml Finale), 2% Fetal Calf Serum (FCS) und 2% Serumersatz ergänzen. </li><li> Bereiten Sie das Differenzierungsmedium (DM) vor, indem Sie Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) mit Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (5 μg / ml Finale) und 2% FCS...

Die Glukoseaufnahme ist eine wichtige biologische Messung zum Testen von Aktivatoren oder Inhibitoren auf die Zellkultur und deren Auswirkungen auf die Verwendung von Glukose und die Fähigkeit der Zelle, auf Insulin zu reagieren. Die hier beschriebene Methode hat sich als schnell und zuverlässig erwiesen und wurde in vielen Studien mit primären Myotubes von gesunden Probanden und / oder metabolisch betroffenen Patienten 6 , 7 , 10...

Skelettmuskel ist die größte Glukoseablagerung bei Säugetieren und trägt wesentlich zur Glukose-Homöostase bei. Dieses Insulin reagierende Gewebe ist die primäre Stelle der Glukoseaufnahme, die durch Insulinstimulation ausgelöst wird 1 . Bei Typ-2-Diabetes wird die Insulinresistenz in mehreren Geweben, einschließlich des Skelettmuskels, beobachtet und führt zu einer übermäßigen Blutglukosekonzentration. So ist es von großer Bedeutung, den Grad der Insulinsensitivität dieses Gewebes und seiner Zellen zu bestimmen, ob es darum geht, einen Defekt eines Subjekts zu charakterisieren oder die Effizienz einer Behandlung zu beurteilen, die beabsichtigt, sie zu verbessern. Bei menschlichen oder tierischen Probanden ist die Gold-Standard-Technik zur Beurteilung der Insulinsensitivität die hyperinsulinämisch-euglykämische Klammer. Eingeführt von DeFronzo im Jahr 1979 2 und seit 3 , 4 geändert , dann erlaubt die Methode, den ganzen Körper zu quantifizierenNd Gewebe Insulin-Reaktionsfähigkeit gemessen als die Rate der Glukose, um unter Insulin-Stimulation perfundiert werden, um die normale Blutglukose-Konzentration zu erhalten. Insulin-Sensitivitäts-Exploration kann auch auf der Zellebene unter Verwendung von In-vitro- Muskelmodellen durchgeführt werden, und die Messung der Glukose-Aufnahmeraten bleibt ein effizientes und zuverlässiges Werkzeug, um die biologische Antwort der Zelle auf die Insulinstimulation 5 , 6 , 7 zu quantifizieren. In der Tat quantifiziert die Glukose-Aufnahme-Messung die zellbiologische Antwort auf Insulin-Stimulation, von der Bindung von Insulin an seinen Rezeptor an die Translokation von GLUT4 angereicherten Vesikeln und einschließlich intrazellulärer Signal- und Phosphorylierungskaskaden 8 . Dies ist von großer Bedeutung für menschliche Proben, da differenzierte Myotubes viele Merkmale des Spender-Phänotyps beibehalten, einschließlich metabolischer EigenschaftenUnd Störungen, die bei Patienten 9 , 10 , 11 , 12 beobachtet wurden . Die Myotubes zeigen strukturelle, metabolische und phänotypische Ähnlichkeiten mit dem Skelettmuskel 13 , 14 , einschließlich der Expression von Glukosetransportern 15 und der zellulären Insulin-Signalisierungsmaschine 16 . So ist die Messung der Glukoseaufnahme in primären Myotubes für die Charakterisierung des Muskelphänotyps eines Spenders relevant oder untersucht die Wirkung einer Intervention (Arzneimittel, Ernährung oder körperliche Aktivität) auf die Insulinsensitivität in der Muskelzelle. Die Messung der Glukoseaufnahme auf kultivierten Myotubes ist auch ein zuverlässiges Werkzeug bei der Durchführung von Experimenten, die die Insulinsensitivität modifizieren 17 , 18 . Die in vitro </Em&gt; Modell eignet sich für den Test von beliebigen Verbindungen, die die Insulinreaktionsfähigkeit verbessern könnten oder die erworbene oder induzierte Insulinresistenz 19 , 20 , 21 , 22 , 23 verhindern oder umkehren könnten. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur und differenzieren menschliche Myotubes und zur Messung der Zellglukose-Aufnahmeraten. Die Methode gilt für jede Quelle von menschlichen Muskelvorläuferzellen, ob sie aus In-Labor-Präparaten, Collaboration oder kommerziell erhältlichen Lieferanten stammen. Immortalisierte Muskelzelllinien, wie C2C12 und L6, jeweils aus Maus- und Rattenursprung, können auch für die Glukoseaufnahme mit diesem Protokoll verwendet werden 7 . Wir liefern ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung von Raten in basalen und Insulin-stimulierten Zuständen unter Verwendung von radioaktiv markiertem [ 3 H] 2dG. TDie Verwendung eines markierten Glukose-Analogons ermöglicht eine genaue Bestimmung des Glukoseeintritts mit reduziertem Ausgangsmaterial, ein gemeinsamer Zustand bei der Arbeit mit Primärzellen. Das modifizierte Glukosemolekül ist nicht in der Lage, metabolische Wege einzugehen und sich somit innerhalb der Zelle zu akkumulieren, was eine zuverlässige Quantifizierung über die gesamte Zellradioaktivität ermöglicht. Die experimentellen Bedingungen umfassen die Verwendung eines Glukose-Transport-Inhibitors (Cytochalasin B), und Messungen werden mit und ohne Insulin durchgeführt. Diese Kombination ermöglicht die Bestimmung der Glukose-Eintrittsraten sowie die Berechnung der Faltungsänderung für den Insulinreaktionsindex. Die Methode wird mit einer Dosis Insulin während einer einzigen Inkubationszeit präsentiert, aber das Protokoll kann leicht für Dosisreaktionen oder Zeitverlaufsexperimente modifiziert werden 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

Skelettmuskel ist die größte Glukoseablagerung bei Säugetieren und trägt wesentlich zur Glukose-Homöostase bei. Die Beurteilung der Insulinsensitivität von Muskelzellen ist für alle Studien, die der Erforschung des Muskelglukosestoffwechsels und der Charakterisierung von Stoffwechselveränderungen gewidmet sind, von großer Bedeutung. In den Muskelzellen bewegen sich Glukosetransporter Typ 4 (GLUT4) -Proteine ​​als Reaktion auf Insulin in die Plasmamembran, so dass ein massiver Eintritt von Glukose in die Zelle möglich ist. Die Fähigkeit der Muskelzellen, auf Insulin zu reagieren, indem sie die Rate der Glukoseaufnahme erhöht, ist eine der Standardauslesungen, um die Empfindlichkeit der Muskelzelle gegenüber Insulin zu quantifizieren. Menschliche primäre Myotubes sind ein geeignetes in vitro- Modell, da die Zellen viele Merkmale des Spender-Phänotyps beibehalten, einschließlich Insulinsensitivität. Dieses in vitro Modell eignet sich auch für den Test von Verbindungen, die die Insulinreaktion beeinflussen könnten. Messungen der Glukoseaufnahmerate in differenzierten Myotubes reflektierenInsulinsensitivität Bei dieser Methode werden menschliche primäre Muskelzellen in vitro kultiviert, um differenzierte Myotubes zu erhalten, und Glukoseaufnahmeraten mit und ohne Insulinstimulation werden gemessen. Wir liefern ein detailliertes Protokoll zur quantitativen Bestimmung von passiven und aktiven Glukosetransportraten unter Verwendung von radioaktiv markiertem [ 3 H] 2-Desoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG). Berechnungsmethoden werden zur Quantifizierung der aktiven basalen und insulin-stimulierten Raten sowie der Stimulationsfalte bereitgestellt.

Am Tag 3 erreichen Myoblasten Zusammenfluss ( Abbildung 1A ). Die Myoblasten sind in diesem Stadium typischerweise mononukleiert. Medium wurde geändert und am Tag 8 wurde die Differenzierung abgeschlossen ( Abbildung 1B ) (Protokollabschnitt 2). Nach 5 Tagen Differenzierung werden Myotubes ausgerichtet und typischerweise polynukleiert. Menschliche primäre Myotubes wurden einer Palmitat- oder einer BSA-Behandlung unterzogen, be...

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Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Bei diesem Verfahren werden menschliche primäre Muskelzellen in vitro kultiviert, um differenzierte Myotubes zu erhalten, und Glucose-Aufnahmeraten werden gemessen. Wir liefern ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung von Raten in basalen und insulin-stimulierten Zuständen unter Verwendung von radioaktiv markiertem [ 3 H] 2-Desoxy-D-Glucose.

Glukoseaufnahme Messung und Response auf Insulin Stimulation in<em&gt; In vitro</em&gt; Kultivierte menschliche primäre Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

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Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

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Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

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Forschung

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