Name: glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

המחברים מודים אן Charrié ב Radiobiology שירות (ליון- Sud החולים) ואת הפדרציה הלאומית Suisse (FNS) על התמיכה הכספית שלהם.

1. הכנת תרבות תאים מדיה ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדיה תרבותית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני שגשוג על ידי תוספת של F-10 בינוני עם גלוטמין (2 מ&quot;מ), פניצילין / סטרפטומיצין (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ס?...

<html> ספיגת גלוקוז היא מדידה ביולוגית מפתח לבדיקת actators או מעכבי על תרבות התא וכיצד הם משפיעים על השימוש בגלוקוז, ואת היכולת של התא להגיב לאינסולין. השיטה המתוארת כאן הוכחה כמהירה ואמינה ונמצאה בשימוש נרחב במחקרים רבים באמצעות מיוטובים ראשוניים של חולים בריאים ו / או מט?...

שריר השלד הוא הפיקדון הגדול ביותר גלוקוז ביונקים תורמת במידה רבה גלוקוז הומיאוסטזיס. זו רקמת תגובה אינסולין הוא האתר העיקרי של ספיגה הגלוקוז כי מופעלת על ידי גירוי אינסולין 1 . בסוכרת מסוג 2, עמידות לאינסולין נצפתה במספר רקמות, כולל שריר השלד, ומובילה לריכוז גבוה יותר של גלוקוז בדם. לכן, יש חשיבות רבה לקביעת רמת הרגישות לאינסולין של רקמה זו ותאייה, בין אם המטרה היא לאפיין פגם בנושא או להעריך את היעילות של טיפול המיועד לשפר אותו. בבעלי חיים אנושיים או בבעלי חיים, טכניקת הזהב סטנדרטית להעריך רגישות לאינסולין הוא מהדק hyperinsulinemic-euglycemic. הוצג על ידי DeFronzo בשנת 1979 2 ו שונה מאז 3 , 4 אז, השיטה מאפשרת לכמת את כל הגוףNd רקמות התגובה האינסולין נמדד כמו שיעור גלוקוז להיות perfused תחת גירוי אינסולין לשמור על ריכוז גלוקוז בדם רגיל. בדיקת רגישות לאינסולין יכולה להתבצע גם ברמת התא באמצעות מודלים של שריר במבחנה , ומדידת שיעורי ספיגת הגלוקוז נותרת כלי יעיל ואמין לכמת התגובה הביולוגית של התא לגירוי אינסולין 5 , 6 , 7 . ואכן, מדידת ספיגת הגלוקוז מכמתת את התגובה הביולוגית של התא לגירוי אינסולין, מהכריכה של אינסולין לקולטן שלה לטרנסלוקציה של שלפוחית ​​GLUT4 מועשר, כולל איתות תאיים ומפלצי זרחון 8 . זה עניין מרכזי עם דגימות אנושיות, כמו myotubes מובחן לשמור על תכונות רבות של פנוטיפ התורם, כולל trueat מטבוליתIes והפרעות שנצפו בחולה 9 , 10 , 11 , 12 . המיאוטובס מציג קווי דמיון מבניים, מטבוליים ופנוטיפיים לשרירי השלד 13 , 14 , כולל הביטוי של מובילי גלוקוז 15 ומנגנון האינסולין הסלולרי 16 . לפיכך, מדידה של ספיגה הגלוקוז ב myotubes העיקרי הוא רלוונטי לאפיון פנוטיפ השריר של התורם, או לחקור את ההשפעה של התערבות (סמים, תזונה, או פעילות גופנית) על רגישות האינסולין בתא השריר. המדידה של ספיגה גלוקוז על המיאוביים תרבותיים גם הוא כלי אמין בעת ​​ביצוע ניסויים לשנות רגישות לאינסולין 17 , 18 . במבחנה </Em&gt; מתאים למבחן של כל תרכובות שיכולות לשפר את היענות האינסולין, או למנוע או לבטל את התנגדות האינסולין שנרכשה או המושרה , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתרבות להבדיל מיוטוב האדם למדוד את שיעורי ספיגת גלוקוז התא. השיטה מתאימה לכל מקור של תאים מבשר שרירים אנושיים, בין אם הם באים מתוך ההכנות במעבדה, שיתוף פעולה או ספקים זמינים מסחרית. שורות תאים שרירים מונצחים, כמו C2C12 ו- L6, בהתאמה ממקור עכבר ומ חולדה, יכולים לשמש גם למדידת ספיגה של גלוקוז עם פרוטוקול זה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת את שיעורי במדינות בסיס ומעוררת אינסולין באמצעות radiolabeled [ 3 H] 2dG. Tהוא משתמש אנלוגי גלוקוז שכותרתו מאפשר קביעת מדויקת של כניסת גלוקוז עם חומר מופחת החל, מצב שכיח בעת עבודה עם תאים ראשוניים. מולקולה גלוקוז שונה אינו מסוגל להיכנס נתיבים מטבוליים, ולכן, מצטבר בתוך התא, המאפשר כימות אמין באמצעות רדיואקטיביות התא הכולל. תנאי הניסוי כוללים את השימוש של מעכב גלוקוז תחבורה (cytochalasin B), ומדידות מבוצעות עם וללא אינסולין. שילוב זה מאפשר לקבוע את ערכי הכניסה הפעילים לגלוקוז, כמו גם את חישוב השינוי לקפל עבור אינדקס התגובה לאינסולין. השיטה מוצגת עם מנה אחת של אינסולין במהלך זמן הדגירה יחיד, אבל הפרוטוקול יכול בקלות להיות שונה עבור התגובה מינון או קורס זמן ניסויים 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

שריר השלד הוא הפיקדון הגדול ביותר גלוקוז ביונקים תורמת במידה רבה גלוקוז הומיאוסטזיס. הערכה של רגישות לאינסולין של תאי שריר היא רלוונטית משמעותית עבור כל המחקרים המוקדש לחקר מטבוליזם גלוקוז בשרירים ואפיון שינויים מטבוליים. בתאי שריר, חלבונים מסוג 4 גלוקוז מסוג 4 (GLUT4) מתורגמים לממברנת הפלסמה בתגובה לאינסולין, ובכך מאפשרים כניסה מסיבית של גלוקוז לתא. היכולת של תאי שריר להגיב לאינסולין על ידי הגדלת שיעור ספיגת הגלוקוז הוא אחד readouts תקן לכמת רגישות תאי שריר לאינסולין. מיוטובין ראשוני האדם הם מתאימים במודל חוץ גופית , כמו התאים לשמור על תכונות רבות של פנוטיפ התורם, כולל רגישות לאינסולין. מודל זה במבחנה מתאים גם למבחן של כל תרכובות שעלולות להשפיע על היענות האינסולין. מדידות של שיעור ספיגת הגלוקוז במיטובים מובחנים משקפיםרגישות לאינסולין. בשיטה זו, תאי שריר ראשוניים אנושיים מתורבתים במבחנה כדי לקבל מיוטובים מובחנים, ושיעורי ספיגה של גלוקוז עם גירוי אינסולין ובלי נמדדים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת שיעורי העברה גלוקטיבית פסיבית פעילה באמצעות [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose [ 3 H] 2dG). שיטות חישוב ניתנים לכמת פעיל basal ו אינסולין מגורה שיעורי, כמו גם גירוי לקפל.

ביום 3, myoblasts להגיע מפגש ( איור 1 א ). את myoblasts בשלב זה הם בדרך כלל mononucleated. בינוני השתנה ביום 8, הבחנה הושלמה ( איור 1 ב ) (פרוטוקול סעיף 2). לאחר 5 ימים של הבחנה, מיוטובים מיושרים ו polynucleated בדרך כלל. מיוטובים ראשוניים של האדם היו...

Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

בשיטה זו, תאי השריר העיקריים של האדם מתורבתים במבחנה כדי לקבל מיוטובים מובחנים ושיעורי ספיגה של גלוקוז נמדדים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת את שיעורי במדינות בסיס ומעוררת אינסולין באמצעות [ 3 H] 2-deoxy-D גלוקוז.

גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

אברון תחבורה בתרבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

גירוי של cytoplasmic מסלולי חישה DNA<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...