Name: glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner Anne Charrié ved Radiobiology-tjenesten (Lyon-Sud sykehus) og Fond National Suisse (FNS) for økonomisk støtte.

1. Fremstilling av cellekulturmedier og -løsninger <ol><li> Fremstilling av kulturmedier <ol><li> Klargjør proliferasjonsmedium (PM) ved å supplere Hams F-10 medium med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 μg / ml endelige), 2% føtalt kalvserum (FCS) og 2% serumsubstitutt. </li><li> Forbered differensieringsmedium (DM) ved å supplere Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 μg / mL endelige) og 2% FCS. </li></ol></li><li> Fre...

Glukoseopptak er en viktig biologisk måling for testing av aktivatorer eller inhibitorer på cellekultur og hvordan de påvirker glukosebruk, og cellens evne til å reagere på insulin. Metoden beskrevet her har vist seg å være rask og pålitelig og har blitt mye brukt i mange studier ved bruk av primære myotubes fra friske individer og / eller metabolisk berørte pasienter 6 , 7 , 10 , 12...

Skjelettmuskulatur er den største glukose innskudd i pattedyr og bidrar i stor grad til glukose homeostase. Dette insulinresponsive vevet er det primære stedet for glukoseopptaket som utløses av insulinstimulering 1 . I type 2 diabetes observeres insulinresistens i flere vev, inkludert skjelettmuskulatur, og fører til over normal blodglukosekonsentrasjon. Således er det av stor betydning for å bestemme nivået av insulinfølsomhet for dette vevet og dets celler, enten målet er å karakterisere en defekt i et individ, eller å evaluere effektiviteten av en behandling som har til hensikt å forbedre den. I menneskelige eller dyrefag er gullstandardteknikken for å vurdere insulinfølsomhet hyperinsulinemisk-euglykemisk klemme. Introdusert av DeFronzo i 1979 2 og modifisert siden 3 , 4 da tillater metoden å kvantifisere hele kroppen aNd vev insulinresponsivitet målt som graden av glukose som skal perfusjoneres under insulinstimulering for å opprettholde normal blodglukosekonsentrasjon. Insulinsensitivitetsutforskning kan også utføres på cellenivå ved bruk av in vitro muskelmodeller, og måling av glukoseopptakshastigheter er fortsatt et effektivt og pålitelig verktøy for å kvantifisere den biologiske responsen til cellen til insulinstimulering 5 , 6 , 7 . Faktisk kvantifiserer glukoseopptaksmåling den cellebiologiske responsen på insulinstimulering, fra bindingen av insulin til dets reseptor til translokasjon av GLUT4-berikede vesikler, og inklusiv intracellulære signalerings- og fosforyleringskaskader 8 . Dette er av stor interesse med humane prøver, da differensierte myotubes opprettholder mange egenskaper av donorfenotypen, inkludert metabolisk egenskapSymptomer og lidelser observert i pasienten 9 , 10 , 11 , 12 . Myotubene viser strukturelle, metabolske og fenotypiske likheter med skjelettmuskulaturen 13 , 14 , inkludert ekspresjonen av glukosetransportører 15 og det cellulære insulinsignaleringsmaskineri 16 . Målingen av glukoseopptaket i primære myotubes er derfor relevant for å karakterisere en donors muskelfenotype, eller undersøke effekten av en intervensjon (medikament, næring eller fysisk aktivitet) på insulinfølsomheten i muskelcellen. Måling av glukoseopptak på dyrkede myotubes er også et pålitelig verktøy når du utfører eksperimenter som endrer insulinfølsomhet 17 , 18 . In vitro </Em&gt; -modellen er egnet til test av noen forbindelser som kan forbedre insulinresponsiviteten, eller kunne forhindre eller reversere oppnådd eller indusert insulinresistens 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Her beskriver vi en detaljert protokoll for kultur og differensiering av humane myotubes og for måling av celleglukoseopptakshastigheter. Metoden gjelder for hvilken som helst kilde til menneskelige muskelprecursorceller, enten de kommer fra in-lab preparater, samarbeid eller kommersielt tilgjengelige leverandører. Immortaliserte muskelcellelinjer, som henholdsvis C2C12 og L6, fra henholdsvis mus og rotte, kan også brukes til glukoseopptaksmåling med denne protokollen 7 . Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere frekvensene i basale og insulinstimulerte tilstander ved hjelp av radiomerket [ 3 H] 2dG. THan bruker en merket glukoseanalog tillater nøyaktig bestemmelse av glukoseoppføring med redusert utgangsmateriale, en vanlig tilstand ved arbeid med primære celler. Det modifiserte glukosemolekylet er ikke i stand til å gå inn i metabolske veier, og akkumuleres således i cellen, slik at det tillates pålitelig kvantifisering via total celleradioaktivitet. Eksperimentelle forhold inkluderer bruk av en glukose transportinhibitor (cytokalasin B), og målinger utføres med og uten insulin. Denne kombinasjonen tillater bestemmelse av glukose aktive inngangsrater, samt beregning av foldendring for insulinresponsindeksen. Metoden presenteres med en dose insulin under en enkelt inkubasjonstid, men protokollen kan lett modifiseres for dose respons eller tidskursforsøk 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

Skjelettmuskulatur er den største glukose innskudd i pattedyr og bidrar i stor grad til glukose homeostase. Vurdering av insulinkänslighet av muskelceller har stor relevans for alle studier dedikert til å undersøke muskelglukosemetabolismen og karakteriserende metabolske endringer. I muskelceller translaterer glukosebærer type 4 (GLUT4) proteiner til plasmamembranen som respons på insulin, slik at massiv innføring av glukose inn i cellen. Muskelcellers evne til å reagere på insulin ved å øke hastigheten på glukoseopptak er en av standardavlesningene for å kvantifisere muskelcellefølsomhet for insulin. Humane primære myotuber er en egnet in vitro- modell, da cellene opprettholder mange egenskaper av donorfenotypen, inkludert insulinfølsomhet. Denne in vitro- modellen er også egnet for test av eventuelle forbindelser som kan påvirke insulinresponsiviteten. Målinger av glukoseopptakshastigheten i differensierte myotubes reflektererInsulinfølsomhet. I denne metoden dyrkes humane primære muskelceller in vitro for å oppnå differensierte myotubes, og glukoseopptakshastigheter med og uten insulinstimulering måles. Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere passive og aktive glukosetransporthastigheter ved bruk av radioaktivt merket [3H] 2-deoksy-D-glukose ([ 3 H] 2dG). Beregningsmetoder blir gitt for å kvantifisere aktive basale og insulinstimulerte frekvenser, samt stimuleringsfold.

På dag 3 når myoblastene sammenløp ( figur 1A ). Myoblastene på dette stadiet er vanligvis mononukleerte. Medium ble endret og på dag 8 ble differensiering fullført ( figur 1B ) (protokoll avsnitt 2). Etter 5 dager med differensiering er myotubene justert og typisk polynukleert. Humane primære myotubes ble utsatt for en palmitat eller en BSA-eneste behandling før glukoseopptakshastighetsmåling. Celler ble inkubert i 48 ...

Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

I denne metoden dyrkes humane primære muskelceller in vitro for å oppnå differensierte myotubes og glukoseopptakshastigheter måles. Vi gir en detaljert protokoll for å kvantifisere frekvensene i basale og insulinstimulerte tilstander ved bruk av radioaktivt merket [3H] 2-deoksy-D-glukose.

Glukoseopptaksmåling og respons på insulinstimulering i<em&gt; I Vitro</em&gt; Dyrket humant primært myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport i Helstøpt<em&gt; Drosophila</em&gt; Celler: S2 Cell Line og Primær nevroner.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulering av cytoplasmatiske DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling glutation-indusert Fôring Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Stanse av<em&gt; BRCA2</em&gt; For å identifisere Novel BRCA2-regulert biologiske funksjoner i dyrkede humane celler

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap junctional interkommunikasjons: En funksjonell biomarkør for å vurdere skadevirkninger av giftstoffer og giftstoffer, og helsemessige fordeler av Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Vurdering av Dictyostelium discoideum svaret til akutt mekanisk stimulering

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Måling av insulin- og sammentrekningstimulert glukoseopptak i isolert og inkubert moden skjelettmuskulatur fra mus

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...