Name: glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Os autores reconhecem Anne Charrié no serviço de Radiobiologia (hospital Lyon-Sud) e Fond National Suisse (FNS) pelo apoio financeiro.

1. Preparação de meios e soluções de cultura de células <ol><li> Preparação de meios de cultura <ol><li> Prepare o meio de proliferação (PM), completando o meio F-10 de Ham com glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (5 μg / mL final), 2% de soro de vitelo fetal (FCS) e 2% de suero. </li><li> Prepare o meio de diferenciação (DM), completando o meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (5 μg / mL final) e FCS a 2%. </li></ol></li><...

A absorção de glicose é uma medida biológica fundamental para testar ativadores ou inibidores na cultura celular e como eles afetam o uso de glicose e a capacidade da célula de responder à insulina. O método descrito aqui mostrou-se rápido e confiável e tem sido amplamente utilizado em muitos estudos usando miotubos primários de indivíduos saudáveis ​​e / ou pacientes metabólicamente afetados 6 , 7 , 10 ,<...

O músculo esquelético é o maior depósito de glicose em mamíferos e contribui em grande parte para a homeostase da glicose. Este tecido responsivo à insulina é o principal local de captação de glicose que é desencadeado pela estimulação de insulina 1 . Na diabetes tipo 2, a resistência à insulina é observada em vários tecidos, incluindo o músculo esquelético, e conduz à concentração de glicose no sangue acima do normal. Assim, é de grande relevância para determinar o nível de sensibilidade à insulina deste tecido e suas células, quer seja para caracterizar um defeito em um sujeito, quer para avaliar a eficiência de um tratamento com o objetivo de melhorá-lo. Em indivíduos humanos ou animais, a técnica de padrão-ouro para avaliar a sensibilidade à insulina é o grampo hiperinsulinêmico-euglicêmico. Introduzido por DeFronzo em 1979 2 e modificado desde 3 , 4 então, o método permite quantificar todo o corpo aNd tecidos de resposta de insulina medida como a taxa de glicose a ser perfundida sob estimulação de insulina para manter a concentração normal de glicose no sangue. A exploração da sensibilidade à insulina também pode ser realizada no nível celular usando modelos musculares in vitro e a medição das taxas de absorção de glicose continua sendo uma ferramenta eficiente e confiável para quantificar a resposta biológica da célula à estimulação de insulina 5 , 6 , 7 . De fato, a medida da absorção de glicose quantifica a resposta biológica celular à estimulação de insulina, desde a ligação da insulina ao seu receptor até a translocação de vesículas enriquecidas com GLUT4 e incluindo sinalização intracelular e cascatas de fosforilação 8 . Isso é de grande interesse com amostras humanas, pois os miotubos diferenciados mantêm muitas características do fenótipo do doador, incluindo propriedades metabólicasIes e distúrbios observados no paciente 9 , 10 , 11 , 12 . Os miotubos apresentam semelhanças estruturais, metabólicas e fenotípicas com o músculo esquelético 13 , 14 , incluindo a expressão de transportadores de glicose 15 e a maquinaria de sinalização de insulina celular 16 . Assim, a medição da absorção de glicose em miotubos primários é relevante para caracterizar o fenótipo muscular de um doador, ou investigar o efeito de uma intervenção (medicamento, nutrição ou atividade física) na sensibilidade à insulina na célula muscular. A medida da absorção de glicose em miotubos cultivados também é uma ferramenta confiável ao realizar experimentos que modificam a sensibilidade à insulina 17 , 18 . O in vitro </Em&gt; modelo é adequado para o teste de quaisquer compostos que possam melhorar a capacidade de resposta da insulina, ou poderia prevenir ou reverter a resistência à insulina adquirida ou induzida 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Aqui descrevemos um protocolo detalhado para a cultura e diferenciamos os miotubos humanos e medimos as taxas de absorção de glicose celular. O método é aplicável a qualquer fonte de células precursoras de músculo humano, sejam eles provenientes de preparações em laboratório, colaboração ou fornecedores comercialmente disponíveis. As linhas celulares musculares imortalizadas, como C2C12 e L6, respectivamente, de origem de rato e rato, também podem ser usadas para medição de absorção de glicose com este protocolo 7 . Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar as taxas em estados basais e estimulados por insulina usando [3H] 2dG radiomarcado. TO uso de um análogo de glicose rotulado permite uma determinação precisa da entrada de glicose com material de partida reduzido, uma condição comum ao trabalhar com células primárias. A molécula de glicose modificada é incapaz de entrar em caminhos metabólicos e, assim, se acumula dentro da célula, permitindo quantificação confiável através da radioatividade celular total. As condições experimentais incluem o uso de um inibidor do transporte de glicose (citocalasina B), e as medidas são realizadas com e sem insulina. Esta combinação permite a determinação das taxas de entrada ativa da glicose, bem como o cálculo da variação da dobra para o índice de resposta à insulina. O método é apresentado com uma dose de insulina durante um único tempo de incubação, mas o protocolo pode ser facilmente modificado para experiências de resposta a dose ou tempo 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

O músculo esquelético é o maior depósito de glicose em mamíferos e contribui em grande parte para a homeostase da glicose. A avaliação da sensibilidade à insulina das células musculares é de grande relevância para todos os estudos dedicados a explorar o metabolismo da glicose muscular e caracterizar alterações metabólicas. Nas células musculares, as proteínas do transportador de glicose 4 (GLUT4) translocam para a membrana plasmática em resposta à insulina, permitindo assim a entrada maciça de glicose na célula. A capacidade das células musculares para responder à insulina, aumentando a taxa de captação de glicose é uma das leituras padrão para quantificar a sensibilidade das células musculares à insulina. Os miotubos primários humanos são um modelo in vitro adequado, uma vez que as células mantêm muitas características do fenótipo do doador, incluindo a sensibilidade à insulina. Este modelo in vitro também é adequado para o teste de quaisquer compostos que possam impactar a capacidade de resposta da insulina. As medições da taxa de absorção de glicose em miotubos diferenciados refletemSensibilidade à insulina. Neste método, as células musculares primárias humanas são cultivadas in vitro para obter miotubos diferenciados, e as taxas de absorção de glicose com e sem estimulação com insulina são medidas. Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar as taxas de transporte de glicose passiva e ativa usando [ 3 H] 2-desoxi-D-Glucose radiomarcado ([3H] 2dG). Os métodos de cálculo são fornecidos para quantificar as taxas basais e estimuladas por insulina, bem como a dobra de estimulação.

No dia 3, os mioblastos alcançam a confluência ( Figura 1A ). Os mioblastos nesta fase são tipicamente mononucleados. O meio foi alterado e no dia 8, a diferenciação foi completada ( Figura 1B ) (seção de protocolo 2). Após 5 dias de diferenciação, os miotubos são alinhados e tipicamente polinucleados. Os miotubos primários humanos foram submetidos a um tratamento com palmitato ou apenas com BSA antes da medição da...

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Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Neste método, as células musculares primárias humanas são cultivadas in vitro para obter miotubos diferenciados e as taxas de absorção de glicose são medidas. Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar taxas em estados basais e estimulados por insulina usando [ 3 H] 2-desoxi-D-Glucose radiomarcado.

Medição da captação de glicose e resposta à estimulação de insulina em miotubos primários humanos cultivados in vitro

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

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Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

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Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

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Biologia

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Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...