Name: glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Авторы признают Энн Шарри в службе радиобиологии (больница Лион-Сюд) и Фонд «Национальный суис» (FNS) за финансовую поддержку.

1. Подготовка среды и растворов клеточной культуры <ol><li> Получение культуральной среды <ol><li> Подготовьте среду для пролиферации (ПМ), добавив среду Х-Х-F с глутамином (2 мМ), пенициллином / стрептомицином (5 мкг / мл конечной), 2% сывороткой плодного теленка (FCS) и 2% -ной заменой сыворо?...

Поглощение глюкозы является ключевым биологическим измерением для тестирования активаторов или ингибиторов клеточной культуры и того, как они влияют на использование глюкозы, и способность клетки реагировать на инсулин. Описанный здесь метод оказался быстрым и надежным и широко исп...

Скелетные мышцы являются самым большим содержанием глюкозы у млекопитающих и в значительной степени способствуют гомеостазу глюкозы. Эта чувствительная к инсулину ткань является основным участком поглощения глюкозы, вызванным стимуляцией инсулина 1 . При диабете 2 типа резистентность к инсулину наблюдается в нескольких тканях, включая скелетную мышцу, и приводит к превышению нормальной концентрации глюкозы в крови. Таким образом, очень важно определить уровень чувствительности к инсулину этой ткани и ее клеток, независимо от того, является ли цель характеризовать дефект у субъекта или оценить эффективность лечения, направленного на его улучшение. У людей или животных, метод золотого стандарта для оценки чувствительности к инсулину - это гиперинсулинемико-эвгликемический зажим. Введенный DeFronzo в 1979 году 2 и измененный с 3 , 4, тогда метод позволяет количественно измерить все тело aЙ сыворотке крови, измеряемой как скорость глюкозы, которую нужно перфузировать при стимуляции инсулина для поддержания нормальной концентрации глюкозы в крови. Исследование чувствительности к инсулину также может быть выполнено на уровне клеток с использованием моделей мышц in vitro , а измерение уровня поглощения глюкозы остается эффективным и надежным инструментом для количественной оценки биологической реакции клетки на стимуляцию инсулина 5 , 6 , 7 . Действительно, измерение поглощения глюкозы количественно оценивает биологическую реакцию клеток на стимуляцию инсулина, от связывания инсулина с его рецептором с транслокацией обогащенных GLUT4 везикул и включая внутриклеточные сигнальные и фосфорилирующие каскады 8 . Это представляет большой интерес для образцов человека, поскольку дифференцированные миотубы поддерживают многие особенности донорского фенотипа, включая метаболическое свойствоИ нарушениями, наблюдаемыми у пациента 9 , 10 , 11 , 12 . Миотубы демонстрируют структурное, метаболическое и фенотипическое сходство с скелетной мышцей 13 , 14 , включая экспрессию транспортеров 15 для глюкозы и аппаратуру сигнализации клеточного инсулина 16 . Таким образом, измерение поглощения глюкозы в первичных миопутах имеет значение для характеристики фенотипа мышц донора или исследования влияния вмешательства (лекарственного средства, питания или физической активности) на чувствительность к инсулину в мышечной клетке. Измерение поглощения глюкозы на культивируемых миопутах также является надежным инструментом при проведении экспериментов, которые изменяют чувствительность к инсулину 17 , 18 . В пробирке </Em&gt; подходит для испытаний любых соединений, которые могут улучшить чувствительность к инсулину, или могут предотвратить или обратить вспять приобретенную или индуцированную резистентность к инсулину 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Здесь мы описываем подробный протокол к культуре и дифференцируем человеческие миотубы и измеряем уровни поглощения глюкозы клеток. Этот метод применим к любому источнику клеток-предшественников мышечных клеток человека, независимо от того, поступают ли они из лабораторных препаратов, совместной работы или коммерчески доступных поставщиков. Иммертизированные линии мышечных клеток, такие как C2C12 и L6, соответственно, из происхождения мыши и крысы, также могут использоваться для измерения поглощения глюкозы с помощью этого протокола 7 . Мы предоставляем подробный протокол для количественной оценки показателей в базальных и стимулированных инсулином состояниях с использованием радиоактивно меченого [ 3 H] 2dG. TОн использует маркированный глюкозный аналог, позволяющий точно определять введение глюкозы с уменьшенным исходным материалом, обычное условие при работе с первичными клетками. Модифицированная молекула глюкозы неспособна проникать в метаболические пути и, таким образом, накапливается внутри клетки, обеспечивая надежную количественную оценку с помощью полной радиоактивности клеток. Экспериментальные условия включают использование ингибитора транспорта глюкозы (цитохалазин В), а измерения проводятся с инсулином и без него. Эта комбинация позволяет определить уровни активности активного глюкозы, а также расчет изменения смены индекса инсулина. Метод представлен одной дозой инсулина в течение одного времени инкубации, но протокол может быть легко модифицирован для дозозависимых или временных экспериментов 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

Скелетные мышцы являются самым большим содержанием глюкозы у млекопитающих и в значительной степени способствуют гомеостазу глюкозы. Оценка чувствительности к инсулину мышечных клеток имеет большое значение для всех исследований, посвященных изучению метаболизма глюкозы в мышцах и характеризующих метаболические изменения. В мышечных клетках белки транспортера белка глюкозы типа 4 (GLUT4) транслоцируются в плазматическую мембрану в ответ на инсулин, что позволяет массово вводить глюкозу в клетку. Способность мышечных клеток реагировать на инсулин путем увеличения скорости поглощения глюкозы является одним из стандартных показателей для количественной оценки чувствительности мышечных клеток к инсулину. Первичные миотубы человека являются подходящей моделью in vitro , так как клетки поддерживают многие особенности фенотипа донора, включая чувствительность к инсулину. Эта модель in vitro также подходит для тестирования любых соединений, которые могут влиять на чувствительность к инсулину. Измерения скорости поглощения глюкозы в дифференцированных миотубах отражаютЧувствительность к инсулину. В этом методе человеческие первичные мышечные клетки культивируют in vitro для получения дифференцированных миотубов и измеряют уровни поглощения глюкозы с стимуляцией инсулина и без нее. Мы предоставляем подробный протокол для количественной оценки пассивных и активных скоростей переноса глюкозы с использованием радиоактивно меченой [ 3 H] 2-дезокси-D-глюкозы ([ 3 H] 2dG). Методы расчета предоставляются для количественного определения активных базальных и стимулированных инсулином скоростей, а также сгибания стимуляции.

На третий день миобласты достигают слияния ( рис. 1А ). Миобласты на этом этапе обычно мононуклеированы. Средство было изменено, и на 8-й день была завершена дифференциация ( рисунок 1B ) (раздел протокола 2). Через 5 дней дифференцировки миот?...

Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

В этом методе человеческие первичные мышечные клетки культивируют in vitro для получения дифференцированных миотубов и измеряют скорости поглощения глюкозы. Мы предоставляем подробный протокол для количественной оценки показателей в базальных и стимулированных инсулином состояниях с использованием радиоактивно меченого [ 3 H] 2-дезокси-D-глюкозы.

Измерение поглощения глюкозы и ответ на стимуляцию инсулина в<em&gt; In Vitro</em&gt; Культурные человеческие первичные миопуты

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Инъекции инсулина и гемолимфы добычи для измерения чувствительности к инсулину у взрослых Дрозофилы</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды<em&gt; В пробирке</em&gt;, Чтобы определить Поступательное сайтов Пауза Наряду мРНК

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Органелл Транспорт в культуре<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Клетки: S2 клеточной линии и первичных нейронов.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Стимуляция цитоплазматической ДНК зондирования Пути<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Измерение глутатион-индуцированной кормления ответ в Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Подавление<em&gt; BRCA2</em&gt; Для идентификации новых BRCA2-биологические функции регулируются в культивируемых клетках человека

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional межклеточной коммуникации: Функциональная биомаркеров для оценки неблагоприятного воздействия токсикантов и токсинами, и Польза для здоровья натуральных продуктов

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Оценка сапротрофные discoideum реагирования на острые механической стимуляции

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Измерение поглощения глюкозы инсулином и сокращением в изолированных и инкубированных зрелых скелетных мышцах мышей

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...