Name: glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Yazarlar, Radiobiyoloji servisindeki (Lyon-Sud hastanesi) Anne Charrié&#39;yi ve maddi desteklerinden dolayı Fond National Suisse&#39;yi (FNS) onaylarlar.

1. Hücre Kültürü Ortamlarının ve Çözümlerinin Hazırlanması <ol><li> Kültür ortamının hazırlanması <ol><li> Ham&#39;in F-10 ortamını glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL final),% 2 Fetal Buzağı Serumu (FCS) ve% 2 serum replasmanı ile takviye ederek çoğalma ortamı hazırlayın. </li><li> Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL son) ve% 2 FCS ile takviye ederek farklılaşma ortamı (DM) hazırlayın. </li></o...

Glukoz alımı, hücre kültürü üzerindeki aktivatörleri veya inhibitörleri test etmek için önemli biyolojik bir ölçümdür ve glikoz kullanımını nasıl etkilediği ve hücrenin insüline cevap verme yeteneği. Burada açıklanan yöntemin hızlı ve güvenilir olduğu gösterilmiştir ve sağlıklı kişilerden ve / veya metabolik olarak etkilenen hastalardan alınan primer miyotları kullanan birçok çalışmada yaygın olarak kullanılmaktadır 6,7,10,12,21,26,27,36,37. Sadece bir 6 kuyucuklu plaka ile, ...

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Bu insülin yanıt veren doku, insülin stimülasyonu 1 tarafından tetiklenen glikoz alımının birincil bölgesidir. Tip 2 diyabette, iskelet kası da dahil olmak üzere çeşitli dokularda insülin direnci gözlenir ve normal kan şekeri konsantrasyonunun üstünde seyreder. Bu nedenle, bir öznedeki bir kusurun karakterize edilmesine mi yoksa iyileştirmek isteyen bir tedavinin verimliliğini değerlendirmeye mi götürmesi gerektiği gibi, bu dokunun ve hücrelerinin insülin duyarlılığının seviyesinin belirlenmesi büyük önem taşır. Insan ya da hayvan konularda, insülin duyarlılığını değerlendirmek için altın standart tekniği, hiperinsülinemik-öglisemik klipstir. DeFronzo tarafından 1979 2&#39;de tanıtıldı ve 3 , 4&#39;den sonra değiştirildi, yöntem tüm vücudu a veDokular insülin tepkisi, normal kan şekeri konsantrasyonunu korumak için insülin uyarımı altında perfüze edilecek glikoz oranı olarak ölçülmüştür. İnsülin duyarlılığı araştırması, in vitro kas modelleri kullanılarak hücre seviyesinde de yapılabilir ve glikoz alım oranlarının ölçümü, hücrenin insülin stimülasyonuna biyolojik tepkisini ölçmek için etkin ve güvenilir bir araç olarak kalır 5 , 6 , 7 . Aslında, glikoz alım ölçümleri, insülin reseptörüne bağlanmasından, GLUT4 zenginleştirilmiş vezikülleri translokasyonuna kadar ve hücre içi sinyalizasyon ve fosforilasyon kaskadları dahil olmak üzere, insülin stimülasyonuna verilen hücre biyolojik tepkisini niceleştirir. Farklılaşmış miyotlar, verici fenotipin metabolik özellikleri de dahil olmak üzere pek çok özelliğini muhafaza ettiği için insan numuneleri ile büyük ilgi görüyor.Hastalarda görülen bozukluklar ve bozukluklar 9 , 10 , 11 , 12 . Miyotüpler, glikoz taşıyıcıları 15 ve hücresel insülin sinyalleme makineleri 16&#39;nın ekspresyonu dahil olmak üzere iskelet kasına 13 , 14 yapısal, metabolik ve fenotipik benzerlikler gösterir. Bu nedenle, primer miyotlarda glikoz alımı ölçümü, bir donörün kas fenotipinin karakterize edilmesi veya bir müdahalenin (ilaç, beslenme veya fiziksel aktivite) kas hücresindeki insülin duyarlılığı üzerindeki etkisinin araştırılması ile ilgilidir. Kültürlenmiş miyotlarda glikoz alımı ölçümü, insülin duyarlılığını değiştiren deneyler yaparken güvenilir bir araçtır17,18. In vitro </Em&gt; modeli, insülin yanıt vermeyi iyileştirebilen veya edinilen veya indüklenen insülin direncini 19 , 20 , 21 , 22 , 23 engelleyebilen veya tersine döndürebilen herhangi bir bileşiğin testi için uygundur. Burada insan miyotlarını kültürlemek ve ayırmak ve hücre glikoz alım hızlarını ölçmek için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, laboratuvar ortamındaki preparatlardan, işbirliğinden ya da piyasada bulunan tedarikçilerden gelmiş olmasına rağmen, insan kas öncül hücrelerinin herhangi bir kaynağına uygulanabilir. Fare ve sıçan kökenli sırasıyla C2C12 ve L6 gibi ölümsüzleştirilmiş kas hücre çizgileri, bu protokolle glikoz alım ölçümleri için de kullanılabilir 7 . Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2dG&#39;yi kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. TEtiketli bir glikoz analoğunun kullanılması, birincil hücrelerle çalışıldığında ortak bir koşul olan indirgenmiş başlangıç ​​materyali ile glikoz girişinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Modifiye glikoz molekülü, metabolik yollara giremiyor ve böylece hücre içinde birikiyor ve toplam hücre radyoaktivitesi aracılığıyla güvenilir bir şekilde ölçülebiliyor. Deneysel koşullar arasında bir glikoz transport inhibitörü (sitokalasin B) kullanımı yer alır ve ölçümler insülin ile veya insülinsiz yapılır. Bu kombinasyon, glukoz aktif giriş hızlarının belirlenmesine ve insülin tepki indeksi için kat değişikliğinin hesaplanmasına izin verir. Yöntem tek bir kuluçka süresi boyunca bir doz insülin ile sunulur, ancak protokol doz yanıtı ya da zaman dersi deneyleri için kolayca modifiye edilebilir 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Kas glikoz metabolizmasını araştırmaya ve metabolik değişiklikleri karakterize etme amaçlı tüm çalışmalar için kas hücrelerinin insülin duyarlılığının değerlendirilmesi büyük önem taşımaktadır. Kas hücrelerinde, glukoz taşıyıcı tip 4 (GLUT4) proteinleri, insüline tepki olarak plazma membranına translokasyon yapar, böylece hücrenin içine glükoz girmesini sağlar. Kas hücrelerinin glikoz alım oranını arttırarak insüline cevap verme yeteneği, insüline karşı kas hücrelerinin duyarlılığını ölçmek için standart okumalardan biridir. İnsan primer miyotları, in vitro model olarak uygundur, çünkü hücreler insülin duyarlılığı da dahil olmak üzere verici fenotipin birçok özelliğini korurlar. Bu in vitro model de insülin yanıt vermeyi etkileyebilecek herhangi bir bileşiğin testi için uygundur. Farklı miyotlarda glikoz alım hızı ölçümleriInsülin duyarlılığı. Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklılaşmış miyotlar elde edilir ve insülin stimülasyonu olan ve olmayan glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [3H] 2-deoksi-D-Glukoz ([3H] 2dG) kullanılarak pasif ve aktif glikoz taşınım oranlarını belirlemek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hesaplama yöntemleri, aktif bazal ve insülin tarafından uyarılan hızların yanı sıra stimülasyon katının miktarını belirlemek için sağlanır.

3. günde miyoblastlar konfluansa ulaşır ( Şekil 1A ). Bu aşamadaki miyoblastlar tipik olarak mononükleotiddir. Ortam değiştirildi ve 8. günde farklılaşma tamamlandı ( Şekil 1B ) (protokol bölümü 2). 5 gün farklılaştıktan sonra, miyotlar hizalanır ve tipik olarak polinükleere edilir. İnsan primer miyotları, glikoz alım hızı ölçümünden önce bir palmitat veya bir BSA&#39;ya uygulanmıştır. Hücrele...

Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklı miyotüpler elde edilir ve glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2-deoksi-D-Glikoz kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Glikoz Alımı Ölçümü ve İnsülin Uyarıcısına Yanıt<em&gt; In vitro</em&gt; Kültürlü İnsan Primer Miyotları

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

İnsülin Enjeksiyon ve Yetişkin İnsülin Hassasiyet Tedbir hemolimf Ekstraksiyon Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Kültürlü organel Ulaşım<em&gt; Drosophila</em&gt; Hücreler: S2 Hücre Hattı ve İlköğretim Nöronlar.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Sitoplazmik DNA Algılama Pathways uyarılması<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra Glutatyon kaynaklı Besleme Tepki Ölçüm

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Susturulması<em&gt; BRCA2</em&gt; Kültür İnsan hücrelerinde Roman BRCA2 düzenlenmiş Biyolojik Fonksiyonları Belirlemek İçin

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...