Name: metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

我们感谢阮先生校对手稿和进行富有成效的讨论。此外, 我们感谢 j. Dernedde 和阮先生帮助我们准备视频拍摄。大多数视频镜头都是在 r. 罗腾堡实验室拍摄的。我们还感谢马克斯普朗克研究所的胶体和接口, 并为我们提供免费进入他们的质谱仪设施。RH 得到了 DFG (ProMoAge) 的支持。

1. 缓冲器和试剂的制备
<ol><li>
3 mM 甲醇钠溶液的制备
	<ol>
<li>在50毫升甲醇 (3 mM) 中, 在100毫升的玻璃瓶中溶解8.1 毫克钠醇, 搅拌棒。室温 (RT) 贮存数周。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
三盐酸缓冲液的制备
	<ol>
<li>结合8.766 克氯化钠, 157 毫克三盐酸, 146 毫克 EDTA 在100毫升玻璃瓶与搅拌棒和溶解在80毫升水。</li>
		<li>将氢氧化钠 (1 米, 在水中) 或 HCl (20%, 在水中) 添加到搅拌液中, 同时观?...

如果化学合成的 ManNAc 衍生物, ManNProp 和 ManNBut 通过质谱分析, 只有正确的质量峰值的两个标本应确定。因此, 可以假定产品的纯度超过99%。在裂解细胞的膜片段中检测到少量的 Neu5Gc, 通常不存在于人类细胞29。这最有可能发生通过一个打捞途径, 招募 Neu5Gc 从胎儿牛血清 sialoglycoconjugates 在媒体30。用唾液酸的天然前驱物进行生物合成, ManNAc, 大大降低了 Neu5Gc 表位?...

唾液酸是一种单糖, 通常可以在糖的还原总站找到, 如N-和O-糖或脂。在所有单糖中, 唾液酸具有独特的化学特性。它有一个 9 C 原子骨干, 一个羧基在 C-1 位置, 是 deprotonated, 从而负电荷在生理条件下, 和一个氨基功能的 C-5 位置。虽然超过50自然发生的唾液酸变种已被描述为迄今1, 在人类中发现的主要形式的唾液酸是N-乙酰酸 (Neu5Ac)。其他哺乳动物也表达了更高的数量的N-glycolylneuraminic 酸 (Neu5Gc)23。
由于其暴露在糖的位置, 唾液酸参与了过多的受体-配体相互作用,例如,流感病毒对宿主细胞的血依赖性绑定4。具有重要生物学功能的唾液酸表位, 尤其在胚胎发生和神经系统中, 是唾液酸。唾液酸是一种高达200α28连接的唾液酸的聚合物。唾液酸的主要蛋白载体是神经细胞黏附分子 (分子)。唾液酸的表达调节了分子的粘附特性, 即唾液酸的表达减少了粘连, 增加了与神经系统的可塑性5。
(聚) 唾液酸的表达变化最终会影响多种不同的生物相互作用。这可以用来研究已知的唾液酸相关过程的分子水平, 以揭示新的糖相互作用, 或探索可能的治疗方法。有不同的方法可利用在细胞表面上唾液酸的表示可以被调整, 例如治疗与唾液酸具体糖苷 (sialidases), 抑制酵素参与在唾液酸生物合成中6 ,7,8, 或击倒或更改唾液酸生物合成的关键酶的表达式9。
另一种用于调节唾液酸表达的方法是 MGE (也称为代谢性寡糖工程, 教育部)。在这里, 细胞, 组织, 甚至动物都是用非衍生物的 ManNAc 来进行 C2-amino 修饰。作为前体分子的唾液酸, 在细胞摄取后, 这些 ManNAc 类似物是单向代谢到非唾液酸和可以表达的 sialylated 糖。使用含有脂肪 C2-modifications 的 ManNAc 衍生物 (如 ManNProp 或 ManNBut) 处理的细胞, 在其 propionylneuraminic10中合并n-Neu5Prop 酸 (butanoylneuraminic) 或n-Neu5But 酸 (糖),11. 通过引入 ManNAc C2-position 的功能组, 非的唾液酸可以通过施陶丁格结扎或叠氮化 alkine 加与荧光染料相结合, 从而在单元格表面上可视化12。
这些非唾液酸的表达对许多生物过程有着耐人寻味的影响, 包括病原体感染、肿瘤细胞黏附和迁移、一般细胞黏附以及血管化和分化 (供审查请参见: Wratil et al.13). 有趣的是, MGE 与N-酰基修饰的 mannosamines 也可以用来干扰唾液酸的表达。唾液酸是由两种不同的 polysialyltransferases (ST8SiaII 和 ST8SiaIV) 产生的。已经证明, polysialyltransferase ST8SiaII 是由非自然的唾液酸前体抑制的, 如 ManNProp 或 ManNBut14,15。此外, 它已经证明在人类神经母细胞瘤 ManNProp 或 ManNBut 应用也减少 sialylation 总15。
MGE 与N-酰基修饰 mannosamines 是一种易于应用的方法, 已成功使用, 不仅在哺乳动物和细菌细胞培养, 而且在整个动物的不同物种, 如线虫线虫16,斑马鱼17, 或鼠标18,19,20,21。特别是含脂肪修饰的 ManNAc 衍生物, 包括 ManNProp 和 ManNBut, 都是地细胞毒, 即使在 millimolar 浓度的培养基或血浆中也是如此。此外, 它们相对容易合成。
在这里, 我们提供了如何使用 MGE 与N-乙酰修饰 mannosamines 的详细信息。首先, 解释了这一领域中最广泛使用的两种 ManNAc 衍生物的化学合成, ManNProp 和 ManNBut。接下来, 我们将展示如何在体内实验中应用 MGE。以 ManNAc 衍生物为例, 选择了神经母细胞线凯利在治疗后唾液表位的表达减少。采用 HPLC 法对细胞表面的非唾液酸进行定量分析, 并通过质谱法进一步分析。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 ml tissue culture flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37190.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SDS Gel/Blot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3019.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau red</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5938.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF 0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4784-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS3548-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-10MG</td>
			<td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109614-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4435-E0</td>
			<td>110 &#197;, 3 &#181;m particle size, 4.6 x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannosamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4670-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56302-50ML-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>36.5-38.0%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T169.2</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-D-mannosamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8176-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0812-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Glycolylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9793-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P51559-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13438-1L-R-D</td>
			<td>40%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>1.0 M, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium methoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>164992-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-100ML-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-019100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T905.1</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel 60</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>9779.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

唾液酸是糖的重要组成部分, 如N和O-糖或脂。由于它的位置在还原总站的寡糖和多糖, 以及其独特的化学特性, 唾液酸参与了多种不同的受体配体相互作用。通过改变唾液酸在细胞表面的表达, 将影响唾液酸依赖性的相互作用。这有助于研究唾液酸依赖性的相互作用, 并有可能以有益的方式影响某些疾病。通过代谢 glycoengineering (MGE), 可以调节唾液酸在细胞表面的表达。在这里, 细胞, 组织, 甚至整个动物都是用 C2-modified 衍生物的N-acetylmannosamine (ManNAc) 来处理的。这些氨基糖充当唾液酸前体分子, 因此被代谢到相应的唾液酸种类和表达的糖。应用这种方法对各种生物过程产生了有趣的影响。例如, 它可以大大减少唾液酸 (polySia) 在处理神经元细胞中的表达, 从而影响神经元的生长和分化。在这里, 我们展示了两个最常见的 C2-modified n-acylmannosamine 衍生物的化学合成, n-propionylmannosamine (ManNProp) 以及n-butanoylmannosamine (ManNBut), 并进一步显示这些非氨基糖可用于细胞培养实验。用高效液相色谱 (HPLC) 对改性唾液酸的表达进行了定量分析, 并通过质谱法进行了进一步的分析。利用唾液酸抗体对唾液酸表达的影响进行了免疫印迹。

在图 2中描述了荧光标记 Neu5Ac 和 Neu5Gc 标准的 HPLC 谱。使用本文所描述的方法, DMB 标记的 Neu5Gc 通常 elutes 在 7-9 分钟洗脱时间之间, 和 DMB-Neu5Ac 之间 10-12 分钟。色谱中的几个小峰通常出现在 2-6 分钟之间。这些峰值代表未 DMB 和反应中间体25。
图 3显示了单元格裂解...

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Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

唾液酸是一种典型的单糖单位, 见于糖。它涉及过多的分子和细胞相互作用。在这里, 我们提出了一个方法来修改细胞表面唾液酸表达使用代谢 glycoengineering 与N-acetylmannosamine 衍生物。

利用N酰基修饰 Mannosamines 对唾液酸的代谢 Glycoengineering

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

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生物工程

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