Name: metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Vi takker L. D. Nguyen for korrekturlæsning manuskriptet og for frugtbare drøftelser. Derudover takker vi J. Dernedde og H. G. Nguyen for at hjælpe os forberede video shoot. De fleste scener af videoen blev skudt i laboratorierne i R. Tauber. Vi takker også Max Planck instituttet for kolloider og grænseflader, og for at give os fri adgang til deres massespektrometri facilitet. RH blev støttet af DFG (ProMoAge).

1. fremstilling af buffere og reagenser
<ol><li>
Forberedelse af 3 mM natrium methoxide løsning
	<ol>
<li>Opløse 8,1 mg natrium methoxide i 50 mL methanol (3 mM) i en 100 mL glasflaske med en røre bar. Opbevares ved stuetemperatur (RT) i flere uger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Forberedelse af Tris-HCl buffer
	<ol>
<li>Kombiner 8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl og 146 mg EDTA i en 100 mL glasflaske med en røre bar og opløses i 80 mL vand.</li>
		<li>Tilføje natriumhydroxid (1 M, i vand) e...

Hvis de kemisk syntetiseret ManNAc derivater, ManNProp og ManNBut er analyseret via massespektrometri, skal kun den korrekte masse peak for begge enheder identificeres. Produkterne kan derfor antages for at have en renhed på over 99%. Små mængder af Neu5Gc, som normalt ikke findes i menneskets celler29, registreres i membran brøkdele af de lysed celler. Dette sker sandsynligvis gennem en bjærgning vej, der rekrutterer Neu5Gc fra fostrets bovint serum sialoglycoconjugates i medierne<sup class=...

Sialic syre er et monosakkarid, der typisk kan findes på de ikke-reducerende termini af glycoconjugates, som N- og O- glycans eller glycolipider. Blandt alle monosaccharider har sialic syre nogle unikke kemiske egenskaber. Det har en 9 C-atom rygrad, en carboxylic gruppe i stilling, C-1, der er deprotonated og dermed negativt ladede under fysiologiske forhold og en amino funktion i C-5 position. Selv om over 50 naturligt forekommende varianter af sialic syre er blevet karakteriseret til dato1, er den fremherskende form for sialic syre fundet i mennesker N- acetylneuraminic syre (Neu5Ac). Andre pattedyr express også større mængder af N- glycolylneuraminic syre (Neu5Gc)2,3.
På grund af sin udsatte position i glycoconjugates er sialic syre involveret i et utal af receptor-ligand interaktioner, fx hemagglutinin afhængige bindende af influenzavirus til vært celler4. En sialic syre epitop med vigtige biologiske funktioner, især under embryogenese og i nervesystemet, er polysialic syre. Polysialic syre er en polymer af op til 200 alpha 2,8-linked sialic syre. Store protein bærer af polysialic syre er neurale celle vedhæftning molekyle (NCAM). Polysialic syre udtryk modulerer adhesive ejendommen af NCAM, polysialic syre udtryk reducerer friktion og øger plasticitet med nervesystemet5.
Ændringer i udtrykket (poly) sialic syre vil i sidste ende påvirker et væld af forskellige biologiske vekselvirkninger. Dette kan bruges til at studere kendte sialic syre brugerafhængige processer på molekylært niveau, at afdække roman glycoconjugate interaktioner, eller udforske mulige terapeutiske tilgange. Der er forskellige metoder til rådighed som udtryk for sialic syre på cellens overflade kan moduleres, for eksempel behandling med sialic syre specifikke glykosidaser (sialidases), hæmning af enzymer involveret i sialic syre biosyntesen6 ,7,8, eller banke eller ændre udtryk for det centrale enzym sialic syre biosyntesen9.
En anden alsidige metode til at modulere sialic syre udtryk er MGE (også kendt som metaboliske oligosaccharid engineering, MOE). Heri, behandles celler, væv eller selv dyr med ikke-naturlige derivater af ManNAc, der bærer C2-amino ændringer. Der forløber molekyler til sialic syre, efter cellulære optagelse, disse ManNAc-analoger er envejs metaboliseret til ikke-naturlige sialic syre og kan udtrykkes på sialylated glycoconjugates. Celler behandles med ManNAc derivater transporterer alifatiske C2-ændringer, såsom ManNProp eller ManNBut, indarbejde N- propionylneuraminic syre (Neu5Prop) eller N- butanoylneuraminic syre (Neu5But) i deres glycoconjugates10 , 11. ved hjælp af funktionelle grupper introduceret til C2-positionen for ManNAc, kan være koblet forekommende ikke-naturlige sialic syre, fx via Staudinger ligatur eller indeholder alkine cycloaddition, med fluorescerende farvestoffer og derfor visualiseret på celle overflade12.
Udtryk for disse ikke-naturlige sialic syre har spændende effekter på mange biologiske processer, herunder patogen infektioner, vedhæftning og migration af tumorceller, generelle celle vedhæftning, samt vascularization og differentiering (til gennemsyn Se: Wratil et al. 13). interessant, MGE med N-acyl modificerede mannosamines kan også bruges til at blande sig med udtryk af polysialic syre. Polysialic syre er genereret af to forskellige polysialyltransferases (ST8SiaII og ST8SiaIV). Det er blevet påvist, at polysialyltransferase ST8SiaII hæmmes af unaturlige sialic syre prækursorer, såsom ManNProp eller ManNBut14,15. Derudover er det blevet påvist i humane neuroblastoma celler, ManNProp eller ManNBut ansøgning også reducerer sialylation i alt15.
MGE med N-acyl modificerede mannosamines er en nem at anvende metode, der er blevet med held brugt, ikke kun i pattedyr og bakterier cellekultur men også i hele dyr af forskellige arter, som Caenorhabditis elegans16, zebrafisk17, eller mus18,19,20,21. Især ManNAc derivater forsynet med alifatiske ændringer, herunder ManNProp og ManNBut, er negligibly cytotoksisk, selv ved millimolar koncentrationer i cellekulturmedium eller blodplasma. De er desuden relativt nemt at syntetisere.
Her vi give detaljer om hvordan man bruger MGE med N-acetyl ændret mannosamines. Først, den kemiske syntese af to af de mest udbredte ManNAc derivater i dette felt, ManNProp og ManNBut, er forklaret. Næste, vi viser, hvordan MGE kan anvendes i et i vivo eksperiment. Som et eksempel, neuroblastoma cellelinie Kelly blev valgt til at demonstrere nedsat udtryk for polysialic epitop af Western duppes efter behandling med ManNAc derivater. Ikke-naturlige sialic syre på cellens overflade var kvantificeres ved HPLC og yderligere analyseret via massespektrometri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 ml tissue culture flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37190.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SDS Gel/Blot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3019.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau red</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5938.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF 0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4784-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS3548-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-10MG</td>
			<td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109614-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4435-E0</td>
			<td>110 &#197;, 3 &#181;m particle size, 4.6 x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannosamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4670-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56302-50ML-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>36.5-38.0%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T169.2</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-D-mannosamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8176-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0812-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Glycolylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9793-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P51559-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13438-1L-R-D</td>
			<td>40%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>1.0 M, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium methoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>164992-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-100ML-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-019100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T905.1</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel 60</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>9779.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

Sialic syre (Sia) er en meget vigtig bestanddel af glycoconjugates, som N- og O- glycans eller glycolipider. På grund af dens position på ikke-reducerende termini af oligo - og polysaccharider, såvel som dens unikke kemiske karakteristika, er sialic syre involveret i en lang række forskellige receptor-ligand interaktioner. Ved at ændre udtryk for sialic syre på celleoverfladen, vil sialic syre-afhængige interaktioner derfor blive påvirket. Dette kan være nyttigt at undersøge sialic syre-afhængige interaktioner og har potentiale til at påvirke visse sygdomme på en gavnlig måde. Via metaboliske glycoengineering (MGE), kan udtryk for sialic syre på cellens overflade moduleres. Heri, bliver celler, væv eller endda hele dyr behandlet med C2-modificerede derivater af N- acetylmannosamine (ManNAc). Disse amino sukker er fungere som sialic syre forløber molekyler og derfor metaboliseres til den tilsvarende sialic syre arter og udtrykt på glycoconjugates. Anvende denne metode producerer spændende effekter på forskellige biologiske processer. For eksempel, det kan drastisk at reducere udtryk af polysialic syre (polySia) i behandlede neuronale celler og dermed påvirker neuronal vækst og differentiering. Her, viser vi den kemiske syntese af to af de mest almindelige C2-modificerede N- acylmannosamine derivater, N- propionylmannosamine (ManNProp) og N- butanoylmannosamine (ManNBut), og yderligere viser hvordan disse ikke-naturlige amino sukker kan anvendes i celle kultur eksperimenter. Udtryk i ændrede sialic syre arter er kvantificeret ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) og yderligere analyseret via massespektrometri. Effekter på polysialic syre udtryk er belyst via Western blot ved hjælp af en kommercielt tilgængelig polysialic syre antistof.

HPLC kromatogrammer af fluorescerende mærket Neu5Ac og Neu5Gc standarder er afbildet i figur 2. Ved hjælp af den heri beskrevne metode, eluerer DMB-mærket Neu5Gc typisk mellem 7-9 min eluering tid, og DMB-Neu5Ac mellem 10-12 min. Adskillige mindre toppe i kromatogrammet vises normalt mellem 2-6 min. Disse toppe repræsenterer ureageret DMB og reaktion mellemprodukter25.
<s...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic syre er en typisk monosakkarid-enhed fundet i glycoconjugates. Det er involveret i et væld af molekylære og cellulære vekselvirkninger. Her vil vi præsentere en metode til at ændre celle overflade sialic syre udtryk ved hjælp af metaboliske glycoengineering med N- acetylmannosamine derivater.

Metaboliske Glycoengineering Sialic syre ved hjælp af N-acyl-ændret Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-aktiverede Noninvasiv stofskifteprofil

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Real Time Overvågning af intracellulære Bile Acid Dynamics Ved hjælp af en genetisk indkodede FRET-baserede Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

En Facile og miljøvenlig rute at fremstille Poly (mælkesyre) Stilladser med Graded Pore størrelse

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Sustained Administration of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Polylactic-co-glycolic acid Microspheres

Vedvarende administration af β-celle mitogener til intakt Mouse Islets<em&gt; Ex vivo</em&gt; Brug Bionedbrydelig poly (mælke-co-glycolsyre) mikrosfærer

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Metaboliske støtte skåret ud, levende hjernen væv under Kernemagnetisk resonans mikroskopi erhvervelse

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Forberedelse, rensning og brug af fedtsyre-holdige Liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Hyaluronsyre baseret Hydrogels til 3-dimensionelle kultur af Patient-afledte glioblastom celler

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Et tripeptid-stabiliseret Nanoemulsion af oliesyre

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Måling af Global cellulære Matrix Metalloproteinase og metaboliske aktivitet i 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...