Name: metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

אנו מודים ל' ד נגוין להגהת כתב היד ועל דיונים פוריים. יתר על כן, אנו מודים Dernedde ג' וה' ג' נגוין שעזרת לנו להכין את. הצילומים. רוב סצנות של הווידאו נורו במעבדות ר טאובר. אנו מודים גם מכון מקס פלנק קולואידים ואמולסיות, ממשקים, ואשר נתן לנו גישה חופשית למתקן ספקטרומטר מסה שלהם. RH נתמכה על ידי DFG (ProMoAge).

1. הכנת Buffers וראגנטים
<ol><li>
הכנה של 3 מ מ נתרן methoxide פתרון
	<ol>
<li>להמיס 8.1 מ ג נתרן methoxide ב 50 מ ל מתנול (3 מ"מ) בבקבוק זכוכית 100 מ עם בר מערבבים. לאחסן בטמפרטורת החדר (RT) למשך מספר שבועות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת מאגר טריס-HCl
	<ol>
<li>לשלב 8.766 g NaCl, 157 מ ג טריס-HCl ו- 146 מ ג EDTA בבקבוק זכוכית 100 מ עם בר s...

אם נגזרות מסונתז כימית ManNAc, ManNProp ו- ManNBut הם ניתחו באמצעות ספקטרומטר מסה, צריך להיות מזוהה רק הפסגה המוני הנכון עבור שתי דגימות. לכן, ניתן להניח את המוצרים יש טוהר של מעל 99%. כמויות קטנות של Neu5Gc, אשר בדרך כלל לא נמצא תאים אנושיים29, מזוהים בחלקים הממברנה של התאים lysed. זה קרוב לוודאי מ?...

חומצה sialic היא חד-סוכר כי בדרך כלל ניתן למצוא בתחנת טרמיני ללא הפחתת של glycoconjugates, כגון N-, O- glycans או glycolipids. בין כל monosaccharides, חומצה sialic יש כמה מאפיינים כימיים ייחודיים. יש שדרה 9 C-אטום, קבוצה קרבוקסילית במיקום C-1, deprotonated, טעונים שלילית ובכך תחת התנאים הפיזיולוגיים, ותפקוד אמינו במצב C-5. למרות מעל 50 באופן טבעי וריאציות של חומצה sialic מאפינים תאריך1, הצורה הדומיננטית של חומצה sialic נמצאו אצל בני אדם הוא N- acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac). יונקים אחרים מבטאים גם את כמויות גבוהות יותר של N- glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc)2,3.
בשל מעמדה חשוף glycoconjugates, חומצה sialic מעורב שפע של אינטראקציות קולטן-ליגנד, למשל, הכריכה תלויים hemagglutinin של נגיף שפעת מארח תאים4. Epitope sialic חומצה עם תפקודים ביולוגיים חשובים, במיוחד במהלך מופרה, במערכת העצבים, היא חומצה polysialic. חומצה Polysialic הוא פולימר של עד 200 חומצות sialic אלפא מקושרים-2,8. החלבון העיקרי המוביל של חומצה polysialic היא מולקולת אדהזיה תא עצבי (NCAM). הביטוי חומצה Polysialic שמחליש את המאפיין דבק של NCAM בכך ביטוי חומצה polysialic מקטין את הידבקות ומגביר את הפלסטיות עם מערכת העצבים5.
שינויים בביטוי של חומצה sialic (פולי) בסופו של דבר משפיעים שפע של אינטראקציות ביולוגיים שונים. זה יכול לשמש כדי לחקור תהליכים התלויים חומצה sialic ידועים ברמה המולקולרית, לחשוף את הרומן glycoconjugate אינטראקציות, או לחקור גישות טיפוליות אפשריות. ישנן שיטות שונות זמינים שלפיו הביטוי של חומצה sialic על פני התא יכול להיות מאופנן, למשל טיפול עם חומצה sialic glycosidases ספציפיים (sialidases), עיכוב של אנזימים המעורבים ביוסינטזה חומצה sialic6 7, ,8, או הורסים או שינוי הביטוי של האנזים מפתח של חומצה sialic ביוסינטזה9.
שיטה נוספת תכליתי כדי לווסת את הביטוי חומצה sialic היא MGE (הנדסה מטבולית הידוע גם פחמימה # מיון הפחמימות, מו). במסמך זה, תאים, רקמות או אפילו חיות מטופלים עם נגזרות הלא טבעי של ManNAc אשר C2-אמינו שינויים. להיות קודמן מולקולות של חומצה sialic, לאחר ספיגת תאית, תחליפי ManNAc אלה הן חומצות חד כיווני sialic אל הלא טבעי מטבוליזם, יכול לבוא לידי ביטוי sialylated glycoconjugates. תאים שטופלו ManNAc נגזרים נושאת אליפטיות C2-שינויים, כגון ManNProp או ManNBut, לשלב N- propionylneuraminic חומצה (Neu5Prop) או חומצה - butanoylneuraminic N(Neu5But) שלהם glycoconjugates10 , 11. באמצעות קבוצות פונקציונליות הציג C2-העמדה של ManNAc, חומצות sialic המתרחשים את הלא טבעי יכול להיות יחד, למשל, דרך מצדו Staudinger או את cycloaddition alkine של אזיד, עם צבעי פלורסנט, ולכן דמיינו על פני שטח התא12.
הביטוי של חומצות אלה sialic הלא טבעי יש השפעות מסקרן על תהליכים ביולוגיים רבים, כולל זיהומים הפתוגן, אדהזיה נדידה של תאים סרטניים, אדהזיה תא הכללית, כמו גם vascularization, בידול (לסקירה ראה:. Wratil et al. 13). מעניין, MGE עם N-acyl השומן שונה mannosamines יכול לשמש גם כדי להפריע הביטוי של חומצה polysialic. חומצה Polysialic נוצר על ידי שני polysialyltransferases שונים (ST8SiaII, ST8SiaIV). זה הוכח, כי polysialyltransferase ST8SiaII מעוכבת על ידי סימנים מקדימים חומצה sialic לא טבעי, כגון ManNProp או ManNBut14,15. בנוסף, זה הוכח בתאים אנושיים נוירובלסטומה ManNProp או ManNBut יישום גם מפחית sialylation הכולל15.
MGE עם N-acyl השומן שונה mannosamines הוא קל ליישם את השיטה כבר בהצלחה בשימוש, לא רק מידע יונקים והתרבות תאי חיידקים אלא גם אצל בעלי חיים שלם של מינים שונים, כגון Caenorhabditis elegans16, דג זברה17, או עכברים18,19,20,21. במיוחד ManNAc נגזרים הנושאת שינויים אליפטיות, כולל ManNProp ו- ManNBut, הם החזרה ציטוטוקסיות, אפילו בריכוזים millimolar תא תרבות בינוני או פלזמה. יתר על כן, הם יחסית קל לסנתז.
כאן, אנו מספקים פרטים על אופן השימוש MGE עם N-acetyl שונה mannosamines. קודם כל, הסינתזה של שני נגזרות ManNAc הנפוצה ביותר בתחום זה, ManNProp, ManNBut, הוא הסביר. בשלב הבא, אנו מראים כיצד ניתן ליישם MGE ניסוי ויוו . כדוגמה, שורת התאים נוירובלסטומה קלי נבחר כדי להדגים ירידה בביטוי של epitope polysialic על ידי המערבי כתם לאחר הטיפול עם נגזרות ManNAc. חומצות sialic את הלא טבעי על פני התא לכמת על ידי HPLC, בהמשך נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 ml tissue culture flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37190.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SDS Gel/Blot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3019.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau red</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5938.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF 0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4784-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS3548-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-10MG</td>
			<td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109614-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4435-E0</td>
			<td>110 &#197;, 3 &#181;m particle size, 4.6 x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannosamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4670-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56302-50ML-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>36.5-38.0%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T169.2</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-D-mannosamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8176-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0812-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Glycolylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9793-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P51559-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13438-1L-R-D</td>
			<td>40%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>1.0 M, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium methoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>164992-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-100ML-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-019100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T905.1</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel 60</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>9779.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

חומצה sialic (Sia) הוא נתין מאוד חשוב glycoconjugates, כגון N-, O- glycans או glycolipids. בשל מיקומו בתחנת טרמיני ללא צמצום של oligo - סוכרים, וכן כימי מאפייניו הייחודיים, חומצה sialic מעורב שפע של קולטן שונים-ליגנד אינטראקציות. על-ידי שינוי הביטוי של חומצה sialic על פני התא, כתוצאה מכך מימוש אינטראקציות תלויי-חומצה sialic. זה יכול להיות מועיל לחקור אינטראקציות תלויי-חומצה sialic, יש פוטנציאל להשפיע על מחלות מסוימות בצורה מועילה. Via glycoengineering מטבולית (MGE), הביטוי של חומצה sialic על פני התא יכול להיות מאופנן. במסמך זה, תאים, רקמות או אפילו כל בעלי החיים מטופלים עם C2-השתנה נגזרות של N- acetylmannosamine (ManNAc). אלה סוכרים אמינו לשמש sialic חומצה קודמן מולקולות, ולכן מטבוליזם המינים חומצה sialic המתאימים, הביע על glycoconjugates. יישום שיטה זו יוצרת אפקטים מסקרן על תהליכים ביולוגיים שונים. לדוגמה, הוא יכול להפחית באופן דרסטי את הביטוי של חומצה polysialic (polySia) התייחס תאים עצביים, ובכך משפיע על גדילה עצביים ובידול. . הנה, אנחנו מראים את הסינתזה של שני נגזרות - acylmannosamine הנפוץ ביותר C2-השתנה N, N- propionylmannosamine (ManNProp) כמו גם N- butanoylmannosamine (ManNBut), בהמשך להראות כיצד אלה הלא טבעי ניתן להחיל אמינו סוכרים בניסויים התרבות תאים. הביטוי של חומצה sialic ששונה מינים לכמת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC), בהמשך נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה. ההשפעות על הביטוי חומצה polysialic הם הובהר באמצעות תספיג באמצעות נוגדן חומצה polysialic זמינים מסחרית.

Chromatograms HPLC של פלורסנט תווית Neu5Ac ואת הסטנדרטים Neu5Gc מתוארת באיור2. באמצעות השיטה המתוארת במסמך זה, התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות Neu5Gc בדרך כלל elutes בין 7-9 דקות • תנאי הזמן, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Ac בין 10-12 דקות. מספר פסגות ההרים קטנים יותר chromatogram מופיעים ...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

חומצה sialic היא אופיינית חד-סוכר-יחידה נמצאו ב- glycoconjugates. זה מעורב שפע של אינטראקציות מולקולרית, תאית. כאן אנו מציגים שיטה כדי לשנות את תא השטח חומצה sialic הביטוי תוך שימוש glycoengineering מטבולית עם N- acetylmannosamine נגזרים.

Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

קליל ידידותי לסביבת כביש לפברק פולי (החומצה לקטית) פיגומים עם גודל מדורג נקבובי

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Sustained Administration of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Polylactic-co-glycolic acid Microspheres

מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שימוש פוליפוני מתכלה (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) מיקרוסכמות

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

תמיכה מטבולית של טוחנות, חי ברקמות המוח במהלך רכישת מיקרוסקופ תהודה מגנטית

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים המכילים חומצת שומן

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

חומצה היאלורונית מבוסס Hydrogels לתרבות תלת-ממדי של החולה-Derived גליובלסטומה תאים

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Nanoemulsion מיוצב Tripeptide של חומצה אולאית

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...