Name: metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

우리 감사 합니다 L. D. 구 엔 원고를 교정에 대 한 유익한 토론. 또한, 우리 감사 제이 Dernedde와 H. G. 구 엔 비디오 촬영을 준비 하는 데 도움. 비디오의 대부분 장면 R. 타우버의 실험실에서 촬영 했다. 우리는 또한 콜 로이드 및 인터페이스, 그리고 우리에 게 그들의 질량 분석 시설을 무료로 이용할에 대 한 최대 플랑크 연구소 감사 합니다. RH는 DFG (ProMoAge)에 의해 지원 되었다.

1입니다. 버퍼 및 시 약의 준비
<ol><li>
3mm 나트륨 methoxide 솔루션의 준비
	<ol>
<li>8.1 mg 나트륨 methoxide 메탄올 50 mL (3 m m)에 저 어 바 100 mL 유리 용기에 녹. 몇 주 동안 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tris HCl 버퍼의 준비
	<ol>
<li>저 어 바 8.766 g NaCl, 157 mg Tris HCl 및 146 mg 100 mL 유리병에 EDTA 결합 하 고 80 mL 물에 용 해.</li>
		<li>PH-미터, pH를 관찰 하는 동안 교 반 솔?...

화학적 합성된 ManNAc 파생 상품, ManNProp 및 ManNBut는 질량 분석을 통해 분석 하는 경우만 두 표본에 대 한 올바른 대량 피크 식별 되어야 합니다. 따라서, 제품 99% 이상의 순도가지고 추측 될 수 있다. 일반적으로 찾을 수 없는 인간의 셀29에, Neu5Gc의 적은 양은 lysed 세포의 막 분수에서 검색 됩니다. 이 대부분 미디어30에 소 태아 혈 청 sialoglycoconjugates에서 Neu5Gc 신병 ?...

Sialic acid glycoconjugates N-및 O-glycans 또는 glycolipids 등의 비 감소 테르미니에서 일반적으로 찾을 수 있는 단 당 류 이다. 모든 단 중 sialic acid는 몇 가지 독특한 화학 특성이 있다. 9 C 원자 백본, deprotonated 이며 그로 인하여 부정 청구에서 생리 적 조건, C-1 위치에 carboxylic 그룹 및 아미노 기능 C-5 위치에 있다. 날짜1, 자연스럽 게 sialic acid의 변종 발생 50 이상 성격 되었습니다 sialic acid 인간에서 발견의 주된 형태는 N-acetylneuraminic 산 (Neu5Ac). 다른 포유동물은 또한 N-glycolylneuraminic 산 (Neu5Gc)2,3의 더 높은 금액을 표현 한다.
Glycoconjugates, 노출된 위치로 인해 sialic acid 수용 체 ligand 상호 작용의 과다 한 예를 들어, 호스트 셀4인플루엔자 바이러스의 조류 종속 바인딩 포함 된다. 중요 한 생물 학적 기능, 특히 embryogenesis 동안와 신 경계에 sialic acid epitope polysialic 산 이다. Polysialic 산 최대 200 알파 2, 8-연결 sialic 아미노산의 중합체 이다. Polysialic 산의 주요 단백질 캐리어는 신경 세포 접착 분자 (여). Polysialic 산 식 polysialic 산 식 접착을 감소 하 고 신 경계5가 소성을 증가 보안의 접착제 속성을 조절 한다.
변화 (폴 리) sialic acid의 식에서 궁극적으로 여러 다른 생물 학적 상호 작용을 영향을 줍니다. 이 알려진된 sialic acid 종속 프로세스 밝히기 소설 glycoconjugate 상호 작용, 또는 가능한 치료 방법 탐구를 분자 수준에서 연구를 사용할 수 있습니다. 다른 방법이 있다 사용할 수 있는 세포 표면에 sialic acid의 표현을 변조 수, sialic acid 특정 glycosidases (sialidases),6 sialic 산 생 합성에 관련 된 효소의 억제와 치료 예 ,7,8또는 노크 하거나 sialic 산 생 합성9의 주요 효소의 표현 변경.
또 다른 다재 다능 한 sialic acid 식 변조 하 방법은 MGE (일컬어 대사 처리한후 공학, 모에)입니다. 여기, 세포, 조직, 또는 심지어 동물 아닌 자연의 파생 상품 ManNAc는 c 2-아미노 수정 처리 됩니다. 세포질 통풍 관 후 sialic acid에 대 한 선구자 분자 이기 때문에, 이러한 ManNAc 아날로그 단방향 비 자연적인 대사 sialic 산 이며 sialylated glycoconjugates에 표현 될 수 있습니다. 와 같은 ManNProp 또는 ManNBut, N-propionylneuraminic 산 (Neu5Prop) 또는 그들의 glycoconjugates10 N-butanoylneuraminic 산 (Neu5But)를 통합 할 셀 들고 지방 족 C2-수정, ManNAc 유도체로 치료 , 11. ManNAc의 C2 위치에 도입 하는 기능적인 그룹을 사용 하 여 발생 비 자연적인 sialic 산 결합 될 수 있다, 예를 들어, Staudinger 결 찰 이나 아 지 드 alkine cycloaddition 형광 염료를 통해 따라서 12셀 표면 시각.
이러한 비 자연적인 sialic이 표현 병원 체 감염, 접착 및 종양 세포, 일반 세포 접착으로 vascularization와 차별화 (검토를 위해의 마이그레이션 등 많은 생물 학적 과정에 흥미로운 효과가 참조: Wratil 외. 13). 흥미롭게도, MGE n-acyl 수정 mannosamines polysialic 산의 표현에 방해가 사용할 수 있습니다. Polysialic 산 (ST8SiaII 및 ST8SiaIV) 두 개의 서로 다른 polysialyltransferases에 의해 생성 됩니다. 그것은 입증 되었습니다, 그 polysialyltransferase ST8SiaII ManNProp 또는 ManNBut,1415등 부자연 스러운 sialic acid 선구자에 의해 저해. 또한, 그것은 증명 되었습니다 인간의 신경 세포에서 ManNProp 또는 ManNBut 응용 프로그램 또한 총15sialylation를 감소 시킨다.
MGE n-acyl 수정 mannosamines는 성공적으로, 뿐만 아니라 포유류와 꼬마 선 충16, 같은 다른 종족의 전체 동물에 뿐만 아니라 박테리아 세포 배양에 사용 된 메서드를 적용 하 게 쉬운 zebrafish17또는 쥐18,19,,2021. 특히 ManNAc 파생 상품 지방 족 수정, ManNProp 및 ManNBut, 포함 한 베어링은 사소, 셀 문화 매체 또는 혈액 플라스마 millimolar 농도 에서도 세포 독성. 또한, 그들은 비교적 쉽게 합성 하기입니다.
여기, 우리는 nMGE를 사용 하는 방법에 세부 정보를 제공-틸 수정 mannosamines. 첫째, ManNProp 및 ManNBut,이 분야에서 가장 널리 사용 되는 ManNAc 파생 상품의 2의 화학 합성은 설명 했다. 다음으로, 우리는 어떻게 MGE vivo에서 실험에 적용할 수 보여줍니다. 예를 들어, 신경 세포 선 켈리 선정 되었다 polysialic epitope의 감소 식 보여 서양 오 점 ManNAc 유도체 치료 후. 세포 표면에 비 자연 sialic 산 HPLC로 정량 이었고 더 질량 분석을 통해 분석.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 ml tissue culture flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37190.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SDS Gel/Blot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3019.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau red</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5938.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF 0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4784-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS3548-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-10MG</td>
			<td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109614-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4435-E0</td>
			<td>110 &#197;, 3 &#181;m particle size, 4.6 x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannosamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4670-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56302-50ML-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>36.5-38.0%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T169.2</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-D-mannosamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8176-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0812-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Glycolylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9793-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P51559-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13438-1L-R-D</td>
			<td>40%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>1.0 M, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium methoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>164992-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-100ML-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-019100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T905.1</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel 60</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>9779.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

Sialic acid (Sia) glycoconjugates N-및 O-glycans 또는 glycolipids 등의 매우 중요 한 구성입니다. 올리고-및 다 당 류, 뿐만 아니라 독특한 화학 특성의 비 감소 테르미니에서 그것의 위치 때문 sialic acid는 다른 수용 체 ligand 상호 작용의 무리에 포함 된다. 세포 표면에 sialic acid의 식을 수정 하 여 sialic acid 종속 상호 작용 따라서 좌우 될. 이 sialic acid 종속 상호 작용을 조사 하는 데 도움이 될 수 있습니다 하 고 유익한 방식으로 특정 질병에 영향을 미칠 가능성이 있다. 신진 대사 glycoengineering (MGE)을 통해 세포 표면에 sialic acid의 식이 변조 수 있습니다. 여기, 세포, 조직, 또는 심지어 전체 동물 N-acetylmannosamine (ManNAc)의 파생 상품 c 2 수정 처리 됩니다. 이러한 아미노 설탕 sialic 산 성 선구자 분자 역할 따라서는 해당 sialic acid 종 대사와 glycoconjugates에 표현. 이 방법을 적용 다양 한 생물학 과정에 흥미로운 효과 생성 합니다. 예, 그것은 치료 신경 세포에 있는 polysialic 산 (polySia)의 식을 획기적으로 줄일 수 있다 고 따라서 신경 성장과 분화에 영향을 줍니다. 자, 우리 N-butanoylmannosamine (ManNBut), 뿐만 아니라 가장 일반적인 C2 수정 N-acylmannosamine 유도체, N-propionylmannosamine (ManNProp)의 2의 화학 합성을 보여 더 보여 어떻게이 아닌 자연 아미노 설탕은 세포 배양 실험에 적용할 수 있습니다. 수정된 sialic acid 종의 식 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 계량 하 고 더욱더 질량 분석을 통해 분석. Polysialic 산 식에 대 한 효과 서쪽 오 점 상용 polysialic 산 성 항 체를 사용 하 여 통해 해명.

Neu5Ac 그리고 Neu5Gc 표준 형광의 HPLC chromatograms는 그림 2에 묘사 된다. 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여, DMB 라는 Neu5Gc 일반적으로 elutes 7-9 분 차입, 시간과 DMB-Neu5Ac 10-12 분 사이. 여러 작은 봉우리는 크로마는 일반적으로 2-6 분 사이 나타납니다. 이러한 봉우리 unreacted DMB 나타내고 반응 중개자25.
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Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid는 전형적인 단 당 류 단위 glycoconjugates에서 발견입니다. 그것은 분자 및 세포 상호 작용의 과다에 관여. 여기 우리가 N-acetylmannosamine 유도체와 대사 glycoengineering를 사용 하 여 셀 표면 sialic 산 식을 수정 하는 방법을 제시.

N을 사용 하 여 Sialic Acid의 대사 Glycoengineering-acyl-Mannosamines를 수정

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