Name: metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Agradecemos L. D. Nguyen pela revisão do manuscrito e frutíferos debates. Além disso, agradecemos J. Dernedde e H. G. Nguyen nos ajudar a preparar a gravação do vídeo. A maioria das cenas do vídeo foram filmadas nos laboratórios da R. Tauber. Agradecemos também o Instituto Max Planck de coloides e interfaces e por nos dar livre acesso a suas instalações de espectrometria de massa. RH foi apoiado pelo DFG (ProMoAge).

1. preparação dos reagentes e Buffers
<ol><li>
Preparação da solução de metóxido de sódio 3 mM
	<ol>
<li>Dissolva o metóxido de sódio 8,1 mg em 50 mL de metanol (3 mM) em um frasco de vidro de 100 mL com uma barra de agitação. Armazenar em temperatura ambiente (RT) durante várias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de tampão Tris-HCl
	<ol>
<li>Combinar a 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl e 146 mg de EDTA em uma garrafa de vidro de 100 mL com uma barra de agitação ...

Se os derivados quimicamente sintetizados do ManNAc, ManNProp e ManNBut são analisados através de espectrometria de massa, apenas o pico de massa correto para ambas as amostras deve ser identificado. Portanto, os produtos podem ser considerados para ter um grau de pureza superior a 99%. Pequenas quantidades de Neu5Gc, que normalmente não é encontrada em células humanas29, são detectadas nas fracções da membrana das células lisadas. Isto provavelmente ocorre através de uma via de salvamen...

Ácido siálico é um monossacarídeo que normalmente pode ser encontrado na termini não-redução de glicoconjugados, tais como N- e O- os glicanos ou glicolipídeos. Entre todos os monossacarídeos, ácido siálico tem algumas características químicas únicas. Tem um backbone de átomo C 9, um grupo carboxílico na posição C-1, que é deprotonado e, assim, negativamente carregadas sob condições fisiológicas e uma função amino na posição C-5. Embora a data1, caracterizaram-se mais de 50 naturais variantes de ácido siálico, a forma predominante de ácido siálico, encontrado em seres humanos é N- acetilneuramínico ácido (Neu5Ac). Outros mamíferos também expressam quantidades mais elevadas de N- glycolylneuraminic ácido (Neu5Gc)2,3.
Devido à sua posição exposta em glicoconjugados, ácido siálico é envolvido em uma infinidade de interações ligante-receptor, por exemplo, a vinculação dependente de hemaglutinina do vírus da gripe ao anfitrião células4. Um epítopo de ácido siálico, com importantes funções biológicas, especialmente durante a embriogênese e no sistema nervoso, é o ácido polysialic. O ácido Polysialic é um polímero de até 200 ácidos siálicos de 2,8-lig alfa. O portador de proteína principal do ácido polysialic é a molécula de adesão celular neural (NCAM). Polysialic ácido expressão modula a propriedade adesiva da NCAM em que polysialic ácido expressão diminui a adesão e aumenta a plasticidade com o sistema nervoso5.
Alterações na expressão de ácido siálico de (poli) acabará por afectar uma infinidade de interações biológicas diferentes. Isso pode ser usado para estudar processos dependentes de conhecido de ácido siálico em um nível molecular, para descobrir o romance glicoconjugado interações, ou explorar possíveis abordagens terapêuticas. Existem diferentes métodos disponíveis pelo qual a expressão de ácido siálico na superfície da pilha pode ser modulada, por exemplo, tratamento com ácido siálico glicosidases específico (sialidases), inibição de enzimas envolvidas na biossíntese de ácido siálico6 ,7,8, ou derrubando ou mudar a expressão da enzima chave da biossíntese de ácido siálico9.
Outro método versátil para modular a expressão de ácido siálico é MGE (engenharia metabólica também conhecido como oligossacarídeo, MOE). Neste documento, células, tecidos ou até os animais são tratados com não-naturais derivados de ManNAc que levam a modificações C2-amino. Sendo moléculas precursoras para o ácido siálico, após a absorção celular, estes análogos de ManNAc são metabolizados para não-natural unidirecionais siálico ácidos e podem ser expressa na sialylated glicoconjugados. As células tratadocom com derivados de ManNAc carregando C2-modificações alifáticas, tais como ManNProp ou ManNBut, incorporar ácido de N- propionylneuraminic (Neu5Prop) ou N- butanoylneuraminic acid (Neu5But) em seus glicoconjugados10 , 11. usando grupos funcionais apresentados a posição C2 de ManNAc, podem ser acoplados os ocorrendo ácidos siálicos não-naturais, por exemplo, através da ligadura de Staudinger ou a azida alkine cicloadição, com corantes fluorescentes e, portanto, visualizado na superfície celular12.
A expressão destes ácidos siálicos do não-natural tem efeitos intrigantes em muitos processos biológicos, incluindo infecções do patógeno, a adesão e migração de células tumorais, adesão celular geral, bem como vascularização e diferenciação (para revisão Ver: Wratil et al . 13). Curiosamente, MGE com N-acil modificado mannosamines também pode ser usado para interferir com a expressão de ácido polysialic. O ácido Polysialic é gerado por dois polysialyltransferases diferentes (ST8SiaII e ST8SiaIV). Foi demonstrado, que polysialyltransferase ST8SiaII é inibida pela natural ácido siálico precursores, tais como ManNProp ou ManNBut de14,15. Além disso, foi demonstrado em células de neuroblastoma humano que ManNProp ou ManNBut aplicativo reduz também sialylation no total15.
MGE com N-acil modificado mannosamines é um fácil de aplicar o método que tem sido utilizado com sucesso, não só em mamíferos e cultura de células de bactérias mas também em toda animais de diferentes espécies, tais como Caenorhabditis elegans16, zebrafish17ou18,de ratos a19,20,21. Especialmente ManNAc derivados alifáticas modificações, incluindo ManNProp e ManNBut, do rolamento são insignificante citotóxicos, mesmo em concentrações milimolar em meio de cultura celular ou plasma sanguíneo. Além disso, eles são relativamente fáceis de sintetizar.
Aqui, nós fornecemos detalhes sobre como usar o MGE com N-acetil modificado mannosamines. Primeiro, a síntese química de dois dos mais utilizados derivativos ManNAc neste campo, ManNProp e ManNBut, é explicado. Em seguida, mostramos como MGE pode ser aplicada em um experimento na vivo . Como exemplo, a linhagem de células de neuroblastoma Kelly foi escolhida para demonstrar a diminuição da expressão do epítopo polysialic por Western blot após o tratamento com os derivados de ManNAc. Os ácidos siálicos não-natural na superfície da pilha foram quantificados por CLAE e mais analisados através de espectrometria de massa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 ml tissue culture flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37190.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SDS Gel/Blot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3019.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau red</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5938.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF 0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4784-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS3548-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-10MG</td>
			<td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109614-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4435-E0</td>
			<td>110 &#197;, 3 &#181;m particle size, 4.6 x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannosamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4670-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56302-50ML-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>36.5-38.0%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T169.2</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-D-mannosamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8176-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0812-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Glycolylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9793-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P51559-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13438-1L-R-D</td>
			<td>40%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>1.0 M, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium methoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>164992-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-100ML-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-019100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T905.1</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel 60</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>9779.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

Ácido siálico (Sia) é um componente altamente importante de glicoconjugados, tais como N- e O- os glicanos ou glicolipídeos. Devido à sua posição na termini não-redução de oligo - e polissacarídeos, bem como suas características químicas únicas, ácido siálico é envolvido em uma infinidade de interações ligante-receptor diferente. Modificando a expressão de ácido siálico na superfície das células, dependentes de ácido siálico interações serão influenciadas consequentemente. Isto pode ser útil para investigar interações ácido siálico-dependente e tem o potencial para influenciar certas doenças de uma forma benéfica. Via metabólica glycoengineering (MGE), a expressão de ácido siálico na superfície da pilha pode ser modulada. Neste documento, células, tecidos ou mesmo todo animais são tratados com C2-modificado derivados de N- acetylmannosamine (ManNAc). Estes aminoácidos açúcares atuam como moléculas de ácido siálico precursor e, portanto, são metabolizados para ácido siálico espécie correspondente e expressa na glicoconjugados. Aplicar este método produz efeitos intrigantes sobre diversos processos biológicos. Por exemplo, ele pode reduzir drasticamente a expressão de ácido polysialic (polySia) em células neuronais tratadas e afeta, portanto, diferenciação e crescimento neuronal. Aqui, nós mostramos a síntese química de duas das mais comuns derivadas - acylmannosamine C2-modificado N, N- propionylmannosamine (ManNProp) bem como o N- butanoylmannosamine (ManNBut) e ainda mostrar como esses não-naturais aminoácidos açúcares podem ser aplicados em experiências da cultura de pilha. A expressão de espécies modificadas ácido siálico é quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e mais analisada através de espectrometria de massa. Os efeitos sobre a expressão de ácido polysialic são elucidados através de Western blot utilizando um anticorpo ácido polysialic comercialmente disponível.

Cromatogramas HPLC do fluorescente etiquetado Neu5Ac e os padrões de Neu5Gc estão representadas na Figura 2. Usando o método descrito neste documento, Neu5Gc DMB-rotulado elutes tipicamente entre 7-9 min tempo de eluição e DMB-Neu5Ac entre 10 a 12 min. Vários pequenos picos no cromatograma costumam aparecem entre 2-6 min. Estes picos representam não tenha reagido DMB e reação intermediários25.
<p class="jove_content" fo:k...

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Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Ácido siálico é uma monossacarídeo-unidade típica encontrada em glicoconjugados. Está envolvido em uma infinidade de interações moleculares e celulares. Aqui nós apresentamos um método para modificar a expressão de superfície de ácido siálico célula usando glycoengineering metabólica com derivados de N- acetylmannosamine.

Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando N-acil-modificado Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

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