Name: metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Мы благодарим Нгуен D. L. для корректуры рукописи и плодотворных обсуждений. Кроме того мы благодарим за помощь в подготовке съемок J. Dernedde и H. G. Нгуен. Большинство сцен видео были расстреляны в лабораториях р. Таубер. Мы также благодарим Институт Макса Планка для коллоидов и интерфейсов и за предоставленную нам бесплатный доступ к их объекте масс-спектрометрии. RH была поддержана DFG (ProMoAge).

1. Подготовка буферов и реагенты
<ol><li>
Подготовка раствор метоксида натрия 3 мм
	<ol>
<li>8.1 мг натрия метоксида в 50 мл метанола (3 мм) растворяют в стеклянная бутылка 100 мл с баром перемешать. Хранить при комнатной температуре (RT) на несколько недель.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Подготовка буфер?...

Если химически синтезированные производные ManNAc, ManNProp и ManNBut анализируются через масс-спектрометрии, только правильное массового пик для обоих образцов должны быть определены. Таким образом можно предположить продукты иметь чистоту свыше 99%. Небольшое количество Neu5Gc, который обычно не ...

Сиаловая кислота является моносахаридов, которые обычно могут быть найдены на-уменьшение Термини гликоконъюгаты, как N-, O- гликанов или гликолипидов. Среди всех моносахаридов сиаловая кислота имеет некоторые уникальные химические характеристики. Она имеет 9 C-атом позвоночника, карбоксильные группы в положении C-1, что депротонированная и тем самым отрицательно заряженных в физиологических условиях и аминокислоты функцию в C-5 положении. Хотя более 50 естественные варианты сиаловые кислоты характеризовались Дата1, преобладающей формой сиаловые кислоты найдены в организме человека является N- ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac). Другие млекопитающие также выразить большее количество N- glycolylneuraminic кислоты (Neu5Gc)2,3.
Благодаря своей открытой позиции в гликоконъюгаты сиаловая кислота участвует во множестве рецептор лиганд взаимодействий, например, зависимые привязки гемагглютинина вируса гриппа принимающей ячейки4. Сиаловая кислота epitope с важных биологических функций, особенно во время эмбриогенеза и в нервной системе, является polysialic кислоты. Polysialic кислота является полимером до 200 альфа 2,8-связаны сиаловых кислот. Основной белок перевозчик polysialic кислоты является нейронных клеток молекулы адгезии (NCAM). Polysialic кислоты выражение модулирует адгезивные свойства NCAM в том, что выражение polysialic кислоты уменьшает адгезию и повышает пластичность нервной системы5.
Изменения в выражении (поли) сиаловые кислоты будет в конечном итоге влияет на множество различных биологических взаимодействий. Это могут быть использованы для изучения известных сиаловая кислота зависимых процессов на молекулярном уровне, чтобы раскрыть Роман гликоконъюгаты взаимодействия, или исследовать возможные терапевтические подходы. Существуют различные методы, которыми можно модулировать выражение сиаловые кислоты на поверхности клетки, например лечение с конкретным основу сиаловая кислота (sialidases), ингибирование ферментов, участвующих в биосинтезе сиаловая кислота6 ,7,8, или стучать вниз или изменение выражения ключевых ферментов биосинтеза сиаловая кислота9.
Еще один универсальный метод, чтобы модулировать сиаловая кислота выражение является MGE (также известный как метаболические олигосахарида инжиниринг, МО). Здесь клетки, ткани или даже животные лечатся ненатуральных производные ManNAc, которые несут C2-аминокислоты изменения. Будучи прекурсоров молекулы для сиаловая кислота, после клеточного поглощения, эти ManNAc аналогов однонаправленный метаболизируется ненатуральных сиаловые кислоты и может быть выражена на sialylated гликоконъюгаты. Клетки лечат ManNAc производные, перевозящих алифатических C2-модификации, такие как ManNProp или ManNBut, N- propionylneuraminic кислоты (Neu5Prop) или N- butanoylneuraminic кислоты (Neu5But) в их гликоконъюгаты10 , 11. с помощью функциональных групп представлен в C2-положение ManNAc, происходя ненатуральных сиаловые кислоты могут быть связаны, например, через Штаудингера перевязки или азид среднесульфидная циклоприсоединения, флуоресцентными красителями и поэтому визуализируется на поверхности клеток12.
Выражение этих ненатуральных сиаловые кислоты имеет интригующий воздействие на многие биологические процессы, включая возбудителя инфекции, адгезии и миграции опухолевых клеток, общей клеточной адгезии, а также васкуляризации и дифференциации (для обзора см.: Wratil и др. 13). интересно, что МГЕ с N-ацил изменения mannosamines может также использоваться для вмешиваться с выражением polysialic кислоты. Polysialic кислота вырабатывается два разных polysialyltransferases (ST8SiaII и ST8SiaIV). Было продемонстрировано, что polysialyltransferase ST8SiaII тормозится неестественным сиаловая кислота прекурсоров, таких как ManNProp или ManNBut14,15. Кроме того было продемонстрировано в клетках человека нейробластомы ManNProp или ManNBut приложений также снижает sialylation всего15.
МГЕ с N-ацил изменения mannosamines это легко применять метод, который успешно используется, не только в млекопитающих и культуры клеток бактерий, но и во всей животных разных видов, таких как Caenorhabditis elegans16, Данио рерио17, или мышей18,19,,2021. Подшипник алифатического ряда изменений, в том числе ManNProp и ManNBut, особенно на ManNAc производные пренебрежимо цитотоксических, даже в millimolar концентрациях в ячейку культуры среднего или плазме крови. Кроме того они относительно легко синтезировать.
Здесь, мы предоставляем подробную информацию о том, как использовать МГЕ с N-ацетил изменение mannosamines. Во-первых химический синтез двух из наиболее широко используемых производных ManNAc в этой области, ManNProp и ManNBut, объяснил. Далее мы покажем, как МГЕ могут быть применены в качестве эксперимента в естественных условиях . В качестве примера, нейробластома клеточная линия Келли был выбран продемонстрировать уменьшение выражение polysialic epitope западной помарки после лечения с ManNAc производные. Ненатуральных сиаловых кислот на поверхности клеток были количественно ВЭЖХ и далее анализируются через масс-спектрометрии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 ml tissue culture flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37190.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SDS Gel/Blot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3019.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau red</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5938.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF 0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4784-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS3548-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-10MG</td>
			<td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109614-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4435-E0</td>
			<td>110 &#197;, 3 &#181;m particle size, 4.6 x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannosamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4670-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56302-50ML-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>36.5-38.0%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T169.2</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-D-mannosamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8176-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0812-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Glycolylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9793-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P51559-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13438-1L-R-D</td>
			<td>40%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>1.0 M, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium methoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>164992-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-100ML-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-019100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T905.1</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel 60</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>9779.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

Сиаловая кислота (Sia) является очень важной составляющей гликоконъюгаты, как N-, O- гликанов или гликолипидов. Благодаря своей позиции в Термини-уменьшение олиго - и полисахаридов, а также его уникальных химических характеристик сиаловая кислота участвует в множество различных рецептор лиганд взаимодействий. Изменяя выражение сиаловые кислоты на поверхности клеток, поэтому будет влиять сиаловая кислота зависимые взаимодействия. Это может быть полезно исследовать сиаловая кислота зависимые взаимодействия и имеет потенциал, чтобы влияние некоторых заболеваний в выгодным способом. Через обменные glycoengineering (MGE) можно модулировать выражение сиаловые кислоты на поверхности клеток. Здесь клетки, ткани или даже целые животных относятся с C2-модифицированные производные N- acetylmannosamine (ManNAc). Эти аминокислоты сахара выступать в качестве прекурсоров молекулы сиаловые кислоты и поэтому метаболизируется до соответствующих видов сиаловая кислота и выразил на гликоконъюгаты. Применяя этот метод производит интригующим воздействие на различных биологических процессов. Например он может резко сократить выражение polysialic кислоты (polySia) в обработанных нейрональных клеток и таким образом влияет на нейрональных роста и дифференцировки. Здесь, мы показываем химического синтеза двух наиболее распространенных производных - acylmannosamine C2-изменение N, N- propionylmannosamine (ManNProp), а также N- butanoylmannosamine (ManNBut) и далее показать, как эти ненатуральных Амино сахара могут быть применены в культуре клеток экспериментов. Выражение видов модифицированных сиаловая кислота количественно высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и далее анализируется через масс-спектрометрии. Воздействие на polysialic кислоты выражение освещены через западную помарку использование коммерчески доступных polysialic кислоты антитела.

ВЭЖХ хроматограммы люминесцентные, Neu5Ac и Neu5Gc стандарты изображены на рисунке 2. С помощью метода здесь описано, DMB-меченых Neu5Gc обычно elutes между 7-9 мин элюции время и DMB-Neu5Ac между 10-12 мин. Несколько меньше пиков в Хроматограмма обычно появляются между 2-6 мин...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Сиаловая кислота — это типичный моносахаридов единица в гликоконъюгаты. Он участвует в многочисленных молекулярных и клеточных взаимодействий. Здесь мы представляем метод изменения клеток поверхности сиаловая кислота выражение с использованием метаболических glycoengineering с N- acetylmannosamine производных.

Метаболизм Glycoengineering, сиаловые кислоты, с помощью N-ацил-изменение Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned Поверхности по изучению Гиалуроновая кислота Взаимодействие с раковыми клетками

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

ФИБС поддержкой неинвазивной метаболического профилирования

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Недвижимость Мониторинг Время внутриклеточного желчных кислот Dynamics Использование генетически кодируемых FRET основе желчных кислот датчик

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

Facile и экологически чистый маршрут сфабриковать поли (молочная кислота) Строительные леса с градуированными Размер пор

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Sustained Administration of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Polylactic-co-glycolic acid Microspheres

Поступательный Администрация β-клеток митогенами к неповрежденной островки Mouse<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Использование Биоразлагаемые поли (молочной-гликолевой кислоты) микросферы

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Метаболические поддержке подакцизным, живые ткани мозга во время приобретения микроскопии магнитного резонанса

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Подготовка, очистки и использования липосомы, содержащие жирные кислоты

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Гиалуроновой кислоты на основе гидрогелей для 3-мерного культуры клеток пациента производные глиобластомы

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Трипептид стабилизированный Nanoemulsion олеиновой кислоты

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Измерение глобального сотовой матрицы металлопротеиназ и метаболической активности в 3D гидрогели

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...