Name: metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Agradecemos a L. D. Nguyen para revisar el manuscrito y fructíferos debates. Además, agradecemos a J. Dernedde y H. G. Nguyen por ayudarnos a preparar la sesión de video. Mayoría de las escenas del video se rodaron en los laboratorios de R. Tauber. También agradecemos al Instituto Max Planck para los coloides y las interfaces y por darnos acceso a sus instalaciones de espectrometría de masas. RH fue apoyada por el DFG (ProMoAge).

1. preparación de tampones y reactivos
<ol><li>
Preparación de solución de metóxido de sodio de 3 mM
	<ol>
<li>Disolver el metóxido de sodio 8,1 mg en 50 mL de metanol (3 mM) en una botella de vidrio de 100 mL con una barra de agitación. Almacenar a temperatura ambiente (RT) por varias semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación del tampón Tris-HCl
	<ol>
<li>Combinar 8,766 g NaCl, 157 mg de Tris-HCl y 146 mg de EDTA en una botella de vidrio de 100 mL con una barra de agitació...

Si los síntesis química derivados de ManNAc, ManNProp y ManNBut son analizados mediante espectrometría de masas, sólo el pico masa correcta para ambos especímenes debe ser identificado. Por lo tanto, los productos se pueden suponer que tiene una pureza de más del 99%. Se detectan pequeñas cantidades de Neu5Gc, que normalmente no se encuentra en las células humanas29, en las fracciones de membrana de las células sometidas a lisis. Esto ocurre probablemente a través de una vía de salvamen...

Ácido siálico es un monosacárido que normalmente se encuentran en el termini de glicoconjugados, tales como N- y O- glicanos o glicolípidos no reductores. Entre los monosacáridos, ácido siálico tiene algunas características químicas únicas. Tiene una red de la troncal 9 C-átomo, un grupo carboxílico en la posición C-1, deprotonated y tal modo negativamente cargadas bajo condiciones fisiológicas y una función amino en la posición de C-5. Aunque más de 50 que naturalmente ocurren variantes de ácido siálico se han caracterizado a fecha1, la forma predominante de ácido siálico encontrado en seres humanos es ácido de N- acetilneuramínico (Neu5Ac). Otros mamíferos también expresan altas cantidades de N- glicolilneurimínico ácido (Neu5Gc)2,3.
Debido a su posición expuesta en glicoconjugados, ácido siálico está involucrado en una gran cantidad de las interacciones receptor-ligando, por ejemplo, la Unión dependiente de hemaglutinina del virus influenza a host células4. Un epítopo de ácido siálico con importantes funciones biológicas, especialmente durante la embriogénesis y en el sistema nervioso, es el ácido polysialic. Polysialic ácido es un polímero de hasta 200 ácidos alfa siálica de 2,8-ligado. El portador de la principal proteína del ácido polysialic es la molécula de adhesión celular neural (NCAM). Expresión ácido Polysialic modula la característica adhesiva de NCAM en que expresión ácido polysialic disminuye la adherencia y aumenta la plasticidad del sistema nervioso5.
Cambios en la expresión de ácidos siálicos de (poli) en última instancia afectará a una multitud de interacciones biológicas diferentes. Esto puede usarse para estudiar procesos dependiente conocido ácido siálico a nivel molecular, para descubrir las interacciones glycoconjugate novela o explorar enfoques terapéuticos posibles. Hay diferentes métodos disponibles que puede modular la expresión de ácido siálico en la superficie celular, por ejemplo el tratamiento con ácido siálico glicosidasas específicas (sialidases), inhibición de enzimas implicadas en la biosíntesis de ácido siálico6 ,7,8, derribar o cambiar la expresión de la enzima clave de la biosíntesis de ácidos siálicos9.
Otro método versátil para modular la expresión de ácido siálico es MGE (ingeniería metabólica también conocido como oligosacáridos, MOE). Aquí, las células, tejidos o incluso animales son tratados con derivados no natural de ManNAc que tener modificaciones C2-amino. Las moléculas precursoras de ácido siálico, después de la absorción celular, estos análogos de ManNAc son unidireccionales los ácidos siálico metabolizados a no natural y pueden expresarse en glicoconjugados sialylated. Las células tratan con derivados de ManNAc llevar alifáticos C2-modificaciones, tales como ManNProp o ManNBut, incorporar ácido de N- propionylneuraminic (Neu5Prop) o el ácido N- butanoylneuraminic (Neu5But) en los glicoconjugados10 , 11. mediante el uso de grupos funcionales introducidos en la posición C2 de ManNAc, se pueden acoplar los no naturales siálico que ocurre, por ejemplo, a través de la ligadura de Staudinger o la cicloadición de azidas alkine, con tintes fluorescentes y por lo tanto visualizado en la superficie de la célula12.
La expresión de estos ácidos siálico de natural no tiene efectos interesantes en muchos procesos biológicos, incluyendo las infecciones del patógeno, la adhesión y migración de las células tumorales, adhesión celular general, así como vascularización y diferenciación (para revisión Ver: Wratil et al. 13). Curiosamente, MGE con N-acil modificado mannosamines puede utilizarse también para interferir con la expresión de ácido polysialic. Polysialic ácido se genera por dos polysialyltransferases diferentes (ST8SiaII y ST8SiaIV). Se ha demostrado, que polysialyltransferase ST8SiaII es inhibida por el ácido siálico antinatural precursores, tales como ManNProp o ManNBut de14,15. Además, se ha demostrado en células de neuroblastoma humano que uso ManNProp o ManNBut también reduce asimismo en total15.
MGE con N-acil modificado mannosamines es fácil aplicar el método que se ha utilizado con éxito, no sólo en mamíferos y cultivo celular de las bacterias sino también en todos animales de diferentes especies, como Caenorhabditis elegans16, pez cebra17, o ratones18,19,20,21. Especialmente los derivados de ManNAc teniendo modificaciones alifáticos, incluyendo ManNProp y ManNBut, son insignificante citotóxicos, incluso en concentración milimolar en medio de cultivo celular o plasma de la sangre. Además, son relativamente fáciles de sintetizar.
Aquí, nos proporcionan detalles sobre cómo usar el MGE con N-acetil modificado mannosamines. En primer lugar, la síntesis química de dos de los derivados de ManNAc más utilizados en este campo, ManNProp y ManNBut, se explica. A continuación, te mostramos cómo MGE puede ser aplicado en un experimento en vivo . Por ejemplo, la línea celular de neuroblastoma Kelly fue elegida para demostrar la expresión disminuida del epitopo polysialic por Western blot después del tratamiento con los derivados de ManNAc. Los ácidos siálicos de no natural en la superficie celular fueron cuantificados por HPLC y más analizados mediante espectrometría de masas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 ml tissue culture flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37190.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SDS Gel/Blot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3019.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau red</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5938.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF 0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4784-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS3548-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-10MG</td>
			<td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109614-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4435-E0</td>
			<td>110 &#197;, 3 &#181;m particle size, 4.6 x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannosamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4670-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56302-50ML-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>36.5-38.0%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T169.2</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-D-mannosamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8176-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0812-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Glycolylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9793-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P51559-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13438-1L-R-D</td>
			<td>40%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>1.0 M, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium methoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>164992-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-100ML-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-019100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T905.1</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel 60</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>9779.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

Ácido siálico (Sia) es un componente muy importante de los glicoconjugados, tales como N- y O- glicanos o glicolípidos. Debido a su posición en el termini no reductores de oligo - y polisacáridos, así como sus características químicas únicas, ácido siálico está implicado en una multiplicidad de las interacciones receptor-ligando diferentes. Modificando la expresión de ácido siálico en la superficie celular, por lo tanto se verá afectadas interacciones dependientes de ácido siálico. Esto puede ser útil para investigar las interacciones dependientes de ácido siálico y tiene el potencial para influir en ciertas enfermedades de una manera beneficiosa. Vía metabólica glycoengineering (MGE), puede modular la expresión de ácido siálico en la superficie celular. Aquí, las células, tejidos o incluso todo animales son tratados con C2 modificados derivados de N- acetylmannosamine (ManNAc). Estos aminos azúcares actúan como moléculas precursoras de ácido siálico y por lo tanto son metabolizados a las especies correspondientes de ácido siálico y expresó en glicoconjugados. Aplicando este método produce interesantes efectos sobre diversos procesos biológicos. Por ejemplo, puede reducir drásticamente la expresión de ácido polysialic (polySia) en células neuronales tratadas y por lo tanto afecta la diferenciación y el crecimiento neuronal. A continuación, os mostramos la síntesis química de dos de los más comunes derivados de C2 modificado N- acylmannosamine, N- propionylmannosamine (ManNProp) y N- butanoylmannosamine (ManNBut) y además mostrar cómo estos no natural aminos azúcares pueden aplicarse en los experimentos de cultivo celular. La expresión de especies modificadas el ácido siálico es cuantificada por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y más analizada mediante espectrometría de masas. Los efectos sobre la expresión de ácido polysialic son aclados mediante Western blot utilizando un anticuerpo ácido polysialic disponibles en el mercado.

Cromatogramas HPLC del fluorescente etiquetado Neu5Ac y los estándares de Neu5Gc están representados en la figura 2. Usando el método descrito en este documento, marca DMB Neu5Gc típicamente elutes entre 7-9 min tiempo de elución y DMB-Neu5Ac entre 10-12 min. Varios pequeños picos en el cromatograma generalmente aparecen entre 2-6 min. Estos picos representan DMB no reaccionado y reacción intermedios25.
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Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Ácido siálico es una típica unidad de monosacárido encontrada en glicoconjugados. Participa en una gran cantidad de interacciones moleculares y celulares. Aquí presentamos un método para modificar la expresión de superficie ácido siálico celular con glycoengineering metabólico derivados de N- acetylmannosamine.

Glycoengineering metabólico del ácido siálico utilizando N-acil-modificado Mannosamines

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