Name: metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Vi tackar L. D. Nguyen för korrekturläsning manuskriptet och för givande diskussioner. Dessutom tackar vi J. Dernedde och H. G. Nguyen för att hjälpa oss förbereda video shoot. De flesta scener av videon sköts i laboratorierna i R. Tauber. Vi tackar också Max Planck-institutet för kolloider och gränssnitt, och för att ge oss fri tillgång till deras masspektrometri anläggning. RH stöddes av DFGEN (ProMoAge).

1. beredning av buffertar och reagenser
<ol><li>
Beredning av 3 mM natrium methoxide lösning
	<ol>
<li>Lös upp 8,1 mg natrium methoxide i 50 mL metanol (3 mM) i en 100 mL glasflaska med uppståndelse bar. Förvara i rumstemperatur (RT) i flera veckor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beredning av Tris-HCl buffert
	<ol>
<li>Kombinera 8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl och 146 mg EDTA i en 100 mL glasflaska med en uppståndelse bar och lös i 80 mL vatten.</li>
		<li>Lägg till natriumhydroxid (1 M,...

Om kemiskt syntetiserade ManNAc derivat, ManNProp och ManNBut analyseras via masspektrometri, bör bara de rätta massa peak för båda exemplaren identifieras. Produkterna kan därför antas ha en renhetsgrad på 99%. Små mängder Neu5Gc, som normalt inte finns i mänskliga celler29, upptäcks i membran fraktioner av lyserat cellerna. Detta sker sannolikt genom en bärgning gångstig som rekryterar Neu5Gc från fetalt bovint serum sialoglycoconjugates i media30. Behandlin...

Sialic acid är en monosackarid som kan vanligtvis hittas på icke-reducerande termini av Glykokonjugat, till exempel N- och O- glycans eller glykolipider. Bland alla monosackarider har sialic acid vissa unika kemiska egenskaper. Den har en ryggrad för 9 C-atom, en karboxylsyror grupp i c-1 position, som är deprotonated och därmed negativt laddade under fysiologiska betingelser och en amino funktion i c-5 position. Även om över 50 naturligt förekommande varianter av sialic acid har präglats till datum1, är dominerande form av sialic acid hittade hos människa N- acetylneuraminic syra (Neu5Ac). Andra däggdjur också uttrycka högre mängder av N- glycolylneuraminic acid (Neu5Gc)2,3.
På grund av sin utsatta position i Glykokonjugat, är sialic acid involverad i en uppsjö av receptor-ligand interaktioner, exempelvis hemagglutinin beroende bindningen av influensavirus att host celler4. Ett sialic acid epitop med viktiga biologiska funktioner, särskilt under embryogenes och i nervsystemet, är polysialic syra. Polysialic syra är en polymer av upp till 200 alfa 2,8-länkade sialic syror. Den stora protein bäraren av polysialic syra är neurala cell adhesion molekyl (NCAM). Polysialic acid uttryck modulerar NCAM självhäftande egendom däri polysialic syra uttryck minskar vidhäftning och ökar plasticitet med nervsystemet5.
Förändringar i uttrycket av (poly) sialic acid kommer i slutändan att påverka en mängd olika biologiska interaktioner. Detta kan användas för att studera kända sialic acid beroende processer på molekylär nivå, att avslöja roman glycoconjugate interaktioner, eller utforska möjliga behandlingsmetoder. Det finns olika metoder tillgängliga som ett uttryck för sialic acid på cellytan kan anpassas, till exempel behandling med sialic acid särskilda glycosidases (sialidases), hämning av enzymer som är involverade i sialic acid biosyntesen6 ,7,8, eller knacka ner eller ändra uttrycket av det nyckel-enzymet av sialic acid biosyntes9.
En annan mångsidig metod att modulera sialic acid uttryck är MGE (kallas även metabola oligosackarid engineering, MOE). Häri, behandlas celler, vävnader eller även djur med icke-naturlig derivat av ManNAc som bär C2-amino ändringar. Att vara föregångare molekyler för sialic acid, efter cellernas upptag, dessa ManNAc analoger är enkelriktad metaboliseras till icke naturliga sialic syror och kan uttryckas på sialylated Glykokonjugat. Celler behandlas med ManNAc derivat transporterar alifatiska C2-ändringar, såsom ManNProp eller ManNBut, införliva N- propionylneuraminic syra (Neu5Prop) eller N- butanoylneuraminic syra (Neu5But) i deras Glykokonjugat10 , 11. genom att använda funktionella grupper introducerade till C2-ställning ManNAc, förekommande icke naturliga sialic syror kan kopplas, exempelvis via den Staudinger ligation eller den natriumazid alkine cykloadditionen, med fluorescerande färgämnen och därför visualiseras på cell surface12.
Uttrycket av dessa icke-naturlig sialic syror har spännande effekter på många biologiska processer, inklusive patogen infektioner, adhesion och migration av tumörceller, allmänna celladhesion, samt vaskularisering och differentiering (för granskning Se: Wratil et al. 13). intressant, MGE med N-acyl modified mannosamines kan också användas för att störa uttrycket av polysialic syra. Polysialic syra genereras av två olika polysialyltransferases (ST8SiaII och ST8SiaIV). Det har visats, att polysialyltransferase ST8SiaII hämmas av onaturliga sialic acid prekursorer, såsom ManNProp eller ManNBut14,15. Dessutom har det visats i mänskliga neuroblastomceller att ManNProp eller ManNBut ansökan också minskar sialylation i totalt15.
MGE med N-acyl modified mannosamines är lätt att tillämpa metod som har använts framgångsrikt, inte bara i däggdjurs- och bakterier cellkultur men också i hela djur av olika arter, såsom Caenorhabditis elegans16, Zebrafiskar17eller möss18,19,20,21. Särskilt ManNAc derivat med alifatiska ändringar, inklusive ManNProp och ManNBut, är negligibly cytotoxiska, även vid millimolar koncentrationer i cellodlingsmedium eller blodplasma. Vidare är de relativt lätt att syntetisera.
Här, vi ger detaljer om hur du använder MGE med N-acetyl modified mannosamines. Först, den kemiska syntesen av två av de mest använda ManNAc derivat i området, ManNProp och ManNBut, förklaras. Nästa, vi visar hur MGE kan tillämpas i ett in-vivo -experiment. Som ett exempel, den neuroblastom cellinje Kelly valdes att visa minskad uttryck för den polysialic epitop av Western blot efter behandling med ManNAc derivat. Icke-naturlig sialic syror på cellytan var kvantifieras genom HPLC och ytterligare analyseras via masspektrometri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 ml tissue culture flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37190.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SDS Gel/Blot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3019.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau red</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5938.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF 0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4784-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS3548-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-10MG</td>
			<td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109614-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4435-E0</td>
			<td>110 &#197;, 3 &#181;m particle size, 4.6 x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannosamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4670-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56302-50ML-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>36.5-38.0%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T169.2</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-D-mannosamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8176-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0812-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Glycolylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9793-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P51559-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13438-1L-R-D</td>
			<td>40%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>1.0 M, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium methoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>164992-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-100ML-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-019100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T905.1</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel 60</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>9779.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

Sialic acid (Sia) är en mycket viktig beståndsdel av Glykokonjugat, till exempel N- och O- glycans eller glykolipider. På grund av dess ställning på icke-reducerande termini oligo - och polysackarider, samt dess unika kemiska egenskaper, är sialic acid involverad i en mängd olika receptor-ligand interaktioner. Genom att ändra uttrycket av sialic acid på cellytan, påverkas följaktligen sialic acid-beroende interaktioner. Detta kan vara bra att undersöka sialic acid-beroende interaktioner och har potential att påverka vissa sjukdomar på ett fördelaktigt sätt. Via metabola glycoengineering (MGE), kan uttryck av sialic acid på cellytan anpassas. Häri, behandlas celler, vävnader eller ens hela djur med C2-modifierade derivat av N- acetylmannosamine (ManNAc). Dessa amino socker är fungerar som sialic acid föregångare molekyler och därför metaboliseras till motsvarande arter av sialic acid och uttryckt på Glykokonjugat. Tillämpa denna metod ger spännande effekter på olika biologiska processer. Till exempel det kan drastiskt minska uttryck för polysialic syra (polySia) i behandlade neuronala celler och påverkar därmed neuronal tillväxt och differentiering. Här visar vi den kemiska syntesen av två av de vanligaste C2-modifierade N- acylmannosamine derivat, N- propionylmannosamine (ManNProp) samt N- butanoylmannosamine (ManNBut), och ytterligare Visa hur dessa icke-naturlig Amino socker kan tillämpas i cell kultur experiment. Uttrycket av modifierade sialic acid arter är kvantifieras av högtrycksvätskekromatografi (HPLC) och ytterligare analyseras via masspektrometri. Effekterna på polysialic syra uttryck belyses via Western blot använder en kommersiellt tillgänglig polysialic syra antikropp.

HPLC kromatogram av den fluorescerande märkt Neu5Ac och Neu5Gc standarder avbildas i figur 2. Häri beskrivna metoden, eluerar DMB-märkt Neu5Gc vanligtvis mellan 7-9 min eluering tid och DMB-Neu5Ac mellan 10-12 min. Flera mindre toppar i kromatogrammet visas vanligtvis mellan 2-6 min. Dessa toppar representerar oreagerad DMB och reaktion intermediärer25.
<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid är en typisk monosackarid-enhet finns i Glykokonjugat. Det är involverade i en uppsjö av molekylära och cellulära interaktioner. Här presenterar vi en metod för att ändra cellen ytbehandlar sialic acid uttryck med metabola glycoengineering med N- acetylmannosamine derivat.

Metaboliska Glycoengineering av Sialic Acid använder N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned Ytor Study Hyaluronsyra Interaktioner med cancerceller

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

FIBS-aktiverade Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Realtidsövervakning av intracellulär Bile Acid Dynamics hjälp av en genetiskt kodad FRET-baserade Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

En Facile och miljövänlig väg till Tillverka Poly (mjölksyra) ställningar med Graded Porstorlek

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Sustained Administration of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Polylactic-co-glycolic acid Microspheres

Ihållande Administration av β-cellsmitogener intakt mus cellöar<em&gt; Ex vivo</em&gt; Använda Biodegradable Poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) mikrosfärer

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Metabolt stöd av censurerade, levande hjärnans vävnader under magnetresonans mikroskopi förvärvet

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Förberedelse, rening och användning av fettsyra-innehållande liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Hyaluronsyra baserat hydrogeler för 3-dimensionell kultur av patientderiverade Glioblastoma celler

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

En tripeptid-stabiliserad Nanoemulsion oljesyra

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Mätning av globala Cellular Matrix metalloproteinas och metabolisk aktivitet i 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...