Name: metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Biz L. ö Nguyen için el yazması yazım denetleme ve verimli tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca, biz J. Dernedde ve H. G. Nguyen video çekimi hazırlanıyor bize yardımcı olduğunuz için teşekkür ederiz. Çoğu sahneleri video R. Tauber laboratuvarlarda çekildi. Ayrıca Max Planck Enstitüsü Kolloidler ve arabirimleri ile ilgili ve bize kütle spektrometresi tesislerini ücretsiz erişim verdiğiniz için teşekkür ederiz. RH DFG (ProMoAge) tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlanması arabellekleri ve Kimyasalları
<ol><li>
3 mM sodyum methoxide çözüm hazırlanması
	<ol>
<li>8.1 mg sodyum methoxide 50 mL metanol (3 mM) içinde bir heyecan çizgiyle 100 mL cam şişede geçiyoruz. Oda sıcaklığında (RT) birkaç hafta için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tris-HCl tampon hazırlanması
	<ol>
<li>8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl ve 146 mg 100 mL cam şişe içinde EDTA bir heyecan bar ile birleştirin ve 80 mL suda çözülür.</li>
		<li>Sodyu...

Kimyasal sentez ManNAc türevleri, ManNProp ve ManNBut kütle spektrometresi ile analiz edilir, sadece doğru kitle tepe her iki örnekleri için tespit edilmelidir. Bu nedenle, ürünler üzerinde % 99 saflık için kabul edilebilir. İnsan hücreleri29normalde bulunmazsa, Neu5Gc az miktarda lysed hücre membran kesirler tespit edilir. Bu en olası fetal sığır serum sialoglycoconjugates medya30' dan Neu5Gc acemi bir kurtarma yol boyunca oluşur. Sialik asit biyosentezi,...

Sialik asit glycoconjugates, N- ve O- glukanlardir veya glikolipitler gibi sigara azaltarak termini genellikle bulunabilir bir yaşam var. Tüm bol arasında sialik asit bazı benzersiz kimyasal özelliklere sahiptir. C-5 bulunduğu bir 9 C-atom omurga, karboksilik grubu deprotonated ve böylece olumsuz altında ücret fizyolojik şartlarda C-1 pozisyonda ve amino bir işlevi vardır. Sialik asit türevleri doğal olarak meydana gelen 50'in üzerinde tarihi1olarak nitelendirmiştir rağmen en baskın sialik asit insanlarda bulunan N- asetilnöraminik asit (Neu5Ac) biçimidir. Diğer memeliler de N- glycolylneuraminic asit (Neu5Gc)2,3daha yüksek miktarda hızlı.
Glycoconjugates nedeniyle maruz konumunu, sialik asit reseptör-ligand etkileşimleri, Örneğin, ana bilgisayar hücreleri4grip virüsü hemagglutinin bağımlı bağlantısını bir bolluk ilgilenmektedir. Sialik asit epitope önemli biyolojik fonksiyonları, özellikle sırasında embriyo ve sinir sisteminde polysialic asittir. Polysialic asit 200 alfa 2,8 bağlı sialik asit bir polimerdir. Polysialic asit büyük protein taşıyıcı sinir hücre adezyon molekülü (NCAM) olduğunu. Polysialic asit ifade yapışma azalır ve plastisite sinir sistemi5ile artar Polysialic asit ifade NCAM yapışkanlı mülkiyeti modüle.
Değişiklikler (poli) sialik asit ifadesi sonuçta bir çok farklı biyolojik etkileşimlerin etkiler. Bu bilinen sialik asit bağımlı işlemler roman glycoconjugate etkileşimleri ortaya çıkarmak veya olası tedavi edici yaklaşımlar keşfetmek için moleküler düzeyde eğitim için kullanılabilir. Farklı yöntem kullanılabilir örneğin sialik asit belirli glycosidases (sialidases), enzimler sialik asit biyosentezi6 dahil inhibisyonu ile tedavi hangi sialik asit hücre yüzeyinde ifade modülasyonlu, vardır ,7,8, ya da vurma veya anahtar enzim sialik asit biyosentezi9ifade değiştirme.
Sialik asit ifade modüle için başka bir çok yönlü MGE (olarak da bilinen metabolik oligosakkarit mühendislik, MOE) yöntemidir. Burada, hücre, doku veya hayvanlar için bile C2-amino değişiklikleri taşıyan doğal olmayan türevleri ManNAc ile tedavi edilir. Habercisi moleküller sialik asit, sonra hücresel alımını olmak, bu ManNAc analogları tek yönlü doğal olmayan metabolize sialik asit vardır ve sialylated glycoconjugates ifade edilebilir. ManNProp veya ManNBut, dahil N- propionylneuraminic asit (Neu5Prop) veya N- butanoylneuraminic asit (Neu5But) onların glycoconjugates10 olarak hücreleri Alifatik C2-değişiklikler, taşıma ManNAc türevleri ile kabul edilir , 11. fonksiyonel ManNAc C2-pozisyon tanıttı gruplarını kullanarak, meydana gelen doğal olmayan sialik asit birleştiğinde olabilir, mesela Staudinger ligasyonu veya floresan boyalar ile azid alkine cycloaddition üzerinden ve bu nedenle hücre yüzey12görüntülenir.
Bu doğal olmayan sialik asit ifade patojen enfeksiyonlar, yapışma ve göç tümör hücreleri, genel hücre adezyon, yanı sıra vaskülarizasyon ve farklılaşma (gözden geçirme için de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçleri üzerinde ilginç etkileri vardır bkz: Wratil vd. 13). İlginçtir, MGE ile N-modifiye asil mannosamines polysialic asit ifade ile müdahale için de kullanılabilir. Polysialic asit tarafından iki farklı polysialyltransferases (ST8SiaII ve ST8SiaIV) oluşturulur. Bu göstermiştir, bu polysialyltransferase ST8SiaII ManNProp veya ManNBut14,15gibi doğal olmayan sialik asit öncüleri tarafından engellenir. Buna ek olarak, bu insan Nöroblastom hücrelerde ManNProp veya ManNBut uygulaması da toplam15sialylation azalttığı gösterilmiştir.
MGE ile N-modifiye asil mannosamines başarılı bir şekilde, sadece memeli ve bakteri hücre kültürü Caenorhabditis elegans16gibi farklı türlerin tüm hayvanlarda aynı zamanda kullanılmıştır yöntemi uygulamak kolay bir şey Zebra balığı17, ya da fareler18,19,20,21. Özellikle ManNProp ve ManNBut, dahil olmak üzere Alifatik değişiklik taşıyan ManNAc türevleri negligibly sitotoksik hücre kültür orta veya kan plazması millimolar konsantrasyonlarda bile. Ayrıca, onlar sentez nispeten kolaydır.
Burada, MGE Nile kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak-asetil değiştiren mannosamines. İlk olarak, iki ManNProp ve ManNBut, bu alanda en yaygın olarak kullanılan ManNAc türevlerinin kimyasal sentez açıkladı. Daha sonra biz MGE vivo içinde deney uygulanabilir nasıl gösterir. Örnek olarak, Nöroblastom hücre kültürünü Kelly seçildi polysialic epitope azalmış ifade göstermek için tarafından Western blot tedavi ManNAc türevleri ile sonra. Doğal olmayan sialik asit hücre yüzeyinde HPLC tarafından sayısal ve daha fazla kütle spektrometresi ile analiz edildi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92110411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 ml tissue culture flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Serva</td>
			<td>37190.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SDS Gel/Blot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3019.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau red</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5938.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF 0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430791-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4784-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS3548-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Corning)</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1153-10MG</td>
			<td>lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butyryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109614-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4435-E0</td>
			<td>110 &#197;, 3 &#181;m particle size, 4.6 x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannosamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4670-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56302-50ML-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>36.5-38.0%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T169.2</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-D-mannosamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8176-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0812-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Glycolylneuraminic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9793-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionyl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P51559-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13438-1L-R-D</td>
			<td>40%, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429-500G-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319511-500ML</td>
			<td>1.0 M, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium methoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>164992-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-100ML-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-019100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>T905.1</td>
			<td>HPLC gradient grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Gel 60</td>
			<td>Carl-Roth</td>
			<td>9779.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic glycoengineering of sialic acid using n-acyl-modified mannosamines

Sialik asit (SIA) glycoconjugates, N- ve O- glukanlardir veya glikolipitler gibi son derece önemli bir kurucu olduğunu. Sigara azaltarak termini adlı oligo - ve polisakkaritler, aynı zamanda benzersiz kimyasal özellikleri onun konumunu nedeniyle çok sayıda farklı Reseptör-ligand etkileşimleri sialik asit ilgilenmektedir. Sialik asit hücre yüzeyinde ifade değiştirerek, sialik asit bağımlı etkileşimleri sonuç olarak etkilenir. Bu sialik asit bağımlı etkileşimleri araştırmak yararlı olabilir ve bazı hastalıklara yararlı bir şekilde etkilemek için bir potansiyele sahiptir. (MGE) metabolik glycoengineering sialik asit hücre yüzeyinde ifade modülasyonlu. Burada, hücre, doku veya hatta tüm hayvanlar N- acetylmannosamine (ManNAc) C2-modified türevleri ile tedavi edilir. Bu amino şeker sialik asit öncül molekül olarak hareket ve bu nedenle ilgili sialik asit tür metabolize edilir ve glycoconjugates üzerinde dile getirdi. Bu yöntemi uygulayarak çeşitli biyolojik süreçleri ilginç etkiler üretir. Örneğin, bu ifade polysialic asit (polySia) tedavi nöronal hücre önemli ölçüde azaltır ve böylece nöronal büyüme ve farklılaşma etkiler. İşte, N- butanoylmannosamine (ManNBut), yanı sıra iki en yaygın C2-modified N- acylmannosamine türevleri, N- propionylmannosamine (ManNProp) kimyasal sentez göstermektedir ve daha fazla nasıl bu doğal olmayan göster amino şeker hücre kültür deneylerde uygulanabilir. Ifade değiştirilmiş sialik asit türlerin yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) sayılabilir ve kütle spektrometresi ile daha fazla analiz. Polysialic asit ifade üzerinde etkileri bir piyasada bulunan polysialic asit antikor kullanarak Western blot yolu ile aydınlatılmamıştır.

HPLC chromatograms Neu5Ac ve Neu5Gc standartları etiketli Floresan, Şekil 2' de tasvir edilmektedir. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, DMB etiketli Neu5Gc genellikle 7-9 dk elüsyon süresi ile DMB-Neu5Ac arasında 10-12 dk arasında elutes. Kromatografik birkaç daha küçük tepeler genellikle 2-6 dk arasında görünür. Bu tepeler unreacted DMB temsil ve reaksiyon25ara ürün.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines at JoVE.com

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

Bir Facile ve çevre dostu Rota Kademeli Gözenek Boyutu Poli (Laktik Asit) iskeleleri imal etmek için

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Sustained Administration of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Polylactic-co-glycolic acid Microspheres

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Metabolik destek çıkardım, yaşam beyin dokuları manyetik rezonans mikroskobu Alım sırasında

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Tripeptit stabilize Nanoemulsion oleik asit

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...