Name: purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells
Uploaded: 2017-07-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות ל Biosecurity המושבה הטיקאית (מחלקת קווינסלנד לחקלאות ודיג באוסטרליה) על אספקת Rhipicephalus microplus קרציות מנוצל עבור מחקר זה, ו לוקאס Karbanowicz לעזרה עם צילומי וידאו.

1. דיסקציה של אפיתל גוט מ ר microplus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף קרציות חצי מבושל מן הבקר ביום הניסוי. לנתח מתקתק בתוך 24 שעות לאחר הסרת מן המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדבוק רצועת סרט ...

<ol>
	<li>Rodriguez-Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+Bm86+against+Hyalomma+dromedarii+and+Amblyomma+cajennense+tick+infestations+in+camels+and+cattle.">Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle.</a> Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).</li><li>De Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bm86+antigen+induces+a+protective+immune-response+against+Boophilus+microplus+following+DNA+and+protein+vaccination+in+sheep.">Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).</li><li>Garc&#237;a-Garc&#237;a, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variations+in+the+Boophilus+microplus+Bm86+locus+and+implications+for+immunoprotection+in+cattle+vaccinated+with+this+antigen.">Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen.</a> Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).</li><li>Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acaricide+resistance+in+cattle+ticks+and+approaches+to+its+management:+The+state+of+play.">Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play.</a> Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).</li><li>Kearney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).</li><li>Foil, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+the+prevalence+of+acaricide+resistance+and+tick-borne+diseases.">Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases.</a> Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+expression+of+the+B.+microplus+Bm86+antigen+in+the+yeast+Pichia+pastoris+forming+highly+immunogenic+particles+for+cattle.">High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle.</a> J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+vaccination+with+a+recombinant+Bm86+antigen+preparation+on+natural+infestations+of+Boophilus+microplus+in+grazing+dairy+and+beef+pure+and+cross-bred+cattle+in+Brazil.">Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil.</a> Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).</li><li>Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+reverse+vaccinology+approaches+for+the+development+of+vaccines+against+ticks+and+tick+borne+diseases.">A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases.</a> Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).</li><li>Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+removal+and+characterization+of+the+microvillar+membranes+isolated+from+two+midgut+regions+of+Spodoptera+frugiperda+(Lepidoptera).">Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera).</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).</li><li>Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+separate+apical,+lateral+and+basal+plasma+membrane+from+cells+of+an+insect+epithelium.+A+procedure+based+on+tissue+organization+and+ultrastructure.">Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure.</a> Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).</li><li>Koefoed, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+method+to+isolate+the+basal+lamina+of+insect+midgut+epithelial+cells.">A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells.</a> Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).</li><li>Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membranes+from+insect+midgut+cells.">Plasma membranes from insect midgut cells.</a> An. Acad. Bras. Ci&#234;nc. 78, 255-269 (2006).</li><li>Vargas, A. E., Markoski, M. M., Ca&#241;edo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Stem Cells. 879, 479-490 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li><li>Karhemo, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+isolation+of+biotinylated+cell+surface+proteins+reveals+novel+players+in+cancer+metastasis.">An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis.</a> J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).</li><li>Obenchain, F. R., Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Ticks.">Physiology of Ticks.</a> Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).</li><li>Sonenshine, D., Roe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.1.">Chapter 3.1.</a> &amp;#34;Biology of Ticks&amp;#34. 1, (2014).</li><li>Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &amp;#34;An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure&amp;#34 (English Translation). , (1983).</li></ol>

התפשטות בקר קרים מהווים בעיה רצינית עבור תעשיית הבקר באזורים טרופיים וסובטרופיים של העולם, עם השיטה הנפוצה ביותר של שליטה להסתמך על שימוש אקריצידים 1 , 4 . Bm86 זוהה בעבר בתוך השטח האפיתל במעיים לתקתק כמו אנטיגן המגן נגד ר microplus שריצה ...

Rhipicephalus microplus , סמן בקר, הוא ectoparasite משמעותי ביותר במונחים של השפעה כלכלית על תעשיית הבקר של אזורים טרופיים תת טרופיים כפי שהוא נוקט קדחת הבקר קדחת (babesiosis), anaplasmosis ו piroplasmosis סוס 1 , 2 , 3 , 4 . המאמצים הוקדשו לבקרת סמן בקר, כדי להפחית את ההשפעה המזיקה, אולם לשיטות קונבנציונליות כגון שימוש בחומרי אקריצידים כימיים יש חסרונות משתמעים, כגון נוכחות של שאריות כימיות בחלב ובבשר, ועלייה בשכיחות של קרציות עמידות כימית 5 , 6 , 7 . כתוצאה מכך, פיתוח שיטות חלופיות של בקרת טיקים נחקרו, כגון שימוש בבקר התנגדות טבעי, בקרה ביולוגית (biopesticides) וחיסוןInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . במרדף אחר חלבונים המסוגלים לשמש מועמדים לחיסונים, המחקר הנוכחי מתמקד במעי הגס. קיר midgut בנוי משכבה אחת של תאים אפיתל מנוחה על לאמידה בסיסית דקה, עם החיצוני של הלמידה הבסיסית להרכיב רשת של שרירים. אור ותצפיות מיקרוסקופ אלקטרונים מציינות כי midgut מורכב משלושה סוגים של תאים: מילואים (לא מובחנים), הפרשה, ומערכת העיכול. מספר סוגי התאים משתנה במידה ניכרת בהתאם לשלב הפיזיולוגי. תאי הפרשה ותאי העיכול מקורם בתאי מילואים 18 , 19 , 20 . בניית ספריות cDNAכדי לבחון את ההרכב של המעיים סמן גרמה לזיהוי של חלבונים אנטיגניים, כגון Bm86, כמו מועמדים חיסונים פוטנציאליים 2 , 3 , 4 . Glycoprotein Bm86 הוא מקומי על פני השטח של תאים מעיים לתקתק וגורם תגובה חיסונית מגן נגד סמן בקר ( ר microplus ) בבקר מחוסן. Anti-Bm86 IgGs המיוצר על ידי המארח החוסן הם ingested על ידי סמן, לזהות אנטיגן זה על פני השטח של תאים מעיים לתקתק, ולאחר מכן להפריע לתפקוד רקמות המעיים ואת היושרה. חיסונים המבוססים על אנטיגנים Bm86 הראו שליטה אפקטיבית של ר &#39; microplus ו Rhipicephalus annulatus, על ידי הקטנת מספר, משקל ויכולת הרבייה של נקבות נקבות, וכתוצאה מכך הפחתת הזחל מופחת בדורות דלקת הבאים 4 . עם זאת, חיסונים המבוססים על Bm86 אינם יעילים כנגד כל שלבי הסימוןהוכיחו יעילות משביעת רצון נגד כמה זנים גיאוגרפיים של ר &#39;microplus , וכתוצאה מכך את בשר בקר תעשיות חלב אימצו כראוי חיסונים אלה 2 , 4 . היכולת לבודד תאים אפיתל מן המעיים סמן הוא חידוש משמעותי אשר יאפשר את התקדמות המחקר כדי לקבוע הרכב חלבון חלבון כולל מורפולוגיה ופיזיולוגיה בתנאים סביבתיים שונים. השיטה המתוארת כאן מנצל את הסוכן chelating ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ואת הסוכן הפחתת tris (2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) לשחרר את האפיתל מן הרקמות תמיכה תת אפיתל שלה 10 . אפיתל הוא התאושש בעקבות שיבוש מכני של הרקמות על ידי רועד, ואחריו צנטריפוגה שיפוע רציפה Percoll. מאמר זה מתאר טכניקה ריאלי ו אפשרי לבידוד של מעי גס epiהתאים. חלבונים משטח התא biotinylated, מבודדים מפני השטח של תאים אלה אפיתל ניתח לאחר מכן ביישומים במורד הזרם כגון FACS ו / או LC-MS / MS- ניתוח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mM Carbonate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL centrifuge tubes with sealing cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0016</td>
			<td>Cool in ice prior to gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0440</td>
			<td>Stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Labscene</td>
			<td>BSPA5.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-MOPS Gel</td>
			<td>Gen Script</td>
			<td>M42015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Chloro-1-naphthol tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning Blue</td>
			<td></td>
			<td>30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP15 filter paper</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AO1504200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Type A) Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab102865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP Manager&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>2.2.1.195</td>
			<td>Cell imagery software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duct Tape</td>
			<td>Home Handyman</td>
			<td></td>
			<td>48mm x 25mm Duct Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>DMEM - ice cold for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F96 Maxisorp Immuno Plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>&#160;Olympus&#160;</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>#9 Dumont - Switerzland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol for molecular biology &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-Held Counter</td>
			<td>Officeworks</td>
			<td>JA0376230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>H9394</td>
			<td>HBSS &#8211; ice cold for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Optik Lakor</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione oxidized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separation Stand</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>-</td>
			<td>4-Tube Magnetic Separation Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZRXQ003WW</td>
			<td>Integral Water Purification System for Ultrapure Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>66485</td>
			<td>30cm x 3M pure nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained protein Ladder</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>SM0671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1644-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7518-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>37573</td>
			<td>Stored at 4C. Blocking Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8215-5ML</td>
			<td>PIC &#8211; stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford Dye Reagent 1x</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>500-0205</td>
			<td>For Bradford Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start BSA Standards</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td>BSA standards for Bradford Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Lab. Co</td>
			<td></td>
			<td>Size 11 Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SilverQuest TM Staining Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue TM Safe Stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall C6+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue - Ultra Fast Mini</td>
			<td>UHU</td>
			<td></td>
			<td>UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>VM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>GD100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells

Rhipicephalus microplus - תווית בקר - הוא ectoparasite משמעותי ביותר במונחים של השפעה כלכלית על בעלי חיים כמו וקטור של מספר פתוגנים. המאמצים הוקדשו לשלוט בקר בקר כדי להפחית את ההשפעות המזיקות שלה, עם דגש על גילוי של מועמדים חיסון, כגון BM86, הממוקם על פני השטח של תאים מעיים לתאי אפיתל. המחקר הנוכחי מתמקד בשימוש של cDNA וגנום ספריות, כדי המסך עבור מועמדים חיסון אחרים. הבידוד של תאים מעיים לתקתק מהווה יתרון חשוב בחקירת הרכב של חלבונים פני השטח על קרום תאים בטן קרום. מאמר זה מהווה שיטה חדשנית וראוי לבידוד של תאי אפיתל, מן התוכן מעיים לתקתק של מיקרופלוס חצי רתומה למחצה . פרוטוקול זה מנצל TCEP ו EDTA לשחרר את התאים אפיתל מן הרקמות תמיכה subepithelial ו צפיפות רציפה צנטריפוגה gradieNt לתאי אפיתל נפרדים מסוגי תאים אחרים. חלבונים משטח התא היו biotinylated ומבודדים מן התאים בטן אפיתל בטן, באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מקושר המאפשר עבור יישומים במורד FACS או LC-MS / MS- ניתוח.

תאים אפיתל היו מבודדים מרקמות המעיים של ר microplus לפי סכימה הציג באיור 1 . נציג מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקרינה של תאים מעיים לתאי אפיתל מוכן באמצעות פרוטוקול זה מוצגים בתרשים 2A ו 2 ב.</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells at JoVE.com

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

צפיפות שונה צנטריפוגה מבוססי מתודולוגיה שיפוע מבוסס נוצל לבודד תאים אפיתל מ רקמה Rhipicephalus רקמת microplus . משטח חלבונים הקשורים היו biotinylated ו מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin עבור יישומים במורד הזרם.

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, שילוב של צעד אחד של חלבונים ממברנות לתוך ביוטילדיסקי Peptiquick עבור כריכת חלבון מפושטת

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...