Name: purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells
Uploaded: 2017-07-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells at JoVE.com

저자들은이 연구에 활용 된 Rhipicephalus microplus ticks와 Lucas Karbanowicz가 비디오 촬영에 도움을 주도록 Biosecurity Tick Colony (Queensland Agriculture &amp; Fisheries, Australia)에 감사 드리고자합니다.

1. R. microplus 의 Gut Epithelium 해부 <ol><li> 실험 당일에 가축에서 반 엔 다당류 진드기를 수집합니다. 호스트에서 제거한 후 24 시간 이내에 진드기를 해부합니다. </li><li> 92mm x 16mm 페트리 접시 바닥에 덕트 테이프를 붙입니다. 슈퍼 접착제 한 방울을 테이프에 추가하십시오. 진드기, 복부면을 슈퍼 접착제 위에 놓고 2 분 동안 건조시킵니다. </li><li> 페트리 접시에 인산염 완충 식염수...

<ol>
	<li>Rodriguez-Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+Bm86+against+Hyalomma+dromedarii+and+Amblyomma+cajennense+tick+infestations+in+camels+and+cattle.">Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle.</a> Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).</li><li>De Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bm86+antigen+induces+a+protective+immune-response+against+Boophilus+microplus+following+DNA+and+protein+vaccination+in+sheep.">Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).</li><li>Garc&#237;a-Garc&#237;a, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variations+in+the+Boophilus+microplus+Bm86+locus+and+implications+for+immunoprotection+in+cattle+vaccinated+with+this+antigen.">Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen.</a> Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).</li><li>Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acaricide+resistance+in+cattle+ticks+and+approaches+to+its+management:+The+state+of+play.">Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play.</a> Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).</li><li>Kearney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).</li><li>Foil, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+the+prevalence+of+acaricide+resistance+and+tick-borne+diseases.">Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases.</a> Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+expression+of+the+B.+microplus+Bm86+antigen+in+the+yeast+Pichia+pastoris+forming+highly+immunogenic+particles+for+cattle.">High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle.</a> J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+vaccination+with+a+recombinant+Bm86+antigen+preparation+on+natural+infestations+of+Boophilus+microplus+in+grazing+dairy+and+beef+pure+and+cross-bred+cattle+in+Brazil.">Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil.</a> Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).</li><li>Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+reverse+vaccinology+approaches+for+the+development+of+vaccines+against+ticks+and+tick+borne+diseases.">A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases.</a> Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).</li><li>Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+removal+and+characterization+of+the+microvillar+membranes+isolated+from+two+midgut+regions+of+Spodoptera+frugiperda+(Lepidoptera).">Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera).</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).</li><li>Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+separate+apical,+lateral+and+basal+plasma+membrane+from+cells+of+an+insect+epithelium.+A+procedure+based+on+tissue+organization+and+ultrastructure.">Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure.</a> Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).</li><li>Koefoed, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+method+to+isolate+the+basal+lamina+of+insect+midgut+epithelial+cells.">A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells.</a> Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).</li><li>Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membranes+from+insect+midgut+cells.">Plasma membranes from insect midgut cells.</a> An. Acad. Bras. Ci&#234;nc. 78, 255-269 (2006).</li><li>Vargas, A. E., Markoski, M. M., Ca&#241;edo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Stem Cells. 879, 479-490 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li><li>Karhemo, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+isolation+of+biotinylated+cell+surface+proteins+reveals+novel+players+in+cancer+metastasis.">An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis.</a> J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).</li><li>Obenchain, F. R., Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Ticks.">Physiology of Ticks.</a> Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).</li><li>Sonenshine, D., Roe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.1.">Chapter 3.1.</a> &amp;#34;Biology of Ticks&amp;#34. 1, (2014).</li><li>Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &amp;#34;An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure&amp;#34 (English Translation). , (1983).</li></ol>

가축 진드기 침입은 살 처분제 1 , 4 의 사용에 의존하는 가장 보편적 인 관리 방법과 함께 전 세계의 열대 및 아열대 지역의 소 산업에서 주요한 문제를 구성합니다. Bm86은 이전에 Bm86 지리적 인 순서 변화와 규칙적인 부스팅 4에 대한 요구 사항으로 인해 백신 전략으로서의 제한된 성공으로 R. microplus의 감염 10 ...

Rhipicephalus microplus 는 가축 진드기 (babineiosis), 아나 플라스마 증 및 말 피토 플라스마 증 1 , 2 , 3 , 4를 매개로하여 열대 및 아열대 지역의 소 산업에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충이다. 화학 살비제의 사용과 같은 기존의 방법은 우유 및 육류의 화학적 잔류 물의 존재와 화학적 내성 진드기의 유행 증가와 같은 암시 적 단점을 가지고 있지만 해로운 진드기를 통제하기위한 노력이 해로운 영향을 줄이기 위해 노력해왔다 5 , 6 , 7 . 결과적으로, 자연 저항성 소, 생물학적 방제 (biopesticides) 및 백신의 사용과 같은 진드기 제어의 대안적인 방법의 개발이 연구되어왔다ines 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . 백신 후보 물질로 활용 될 수있는 단백질을 추구함에있어 현재의 연구는 진드기 장에 초점을 맞추고있다. 중추의 벽은 얇은 기저 층 (basal lamina) 위에 놓여있는 단일 층의 상피 세포로부터 만들어지며, 기저 층의 바깥 쪽은 근육 네트워크를 형성합니다. 빛과 전자 현미경 관측에 따르면 중뇌는 예비 세포 (미분화), 분비 세포, 소화 세포의 3 가지 유형으로 구성되어 있습니다. 세포 유형의 수는 생리 학적 단계에 따라 상당히 다양합니다. 분비 세포와 소화 세포는 모두 예비 세포 18 , 19 , 20 에서 유래합니다. cDNA 라이브러리의 구축진드기의 구성을 조사하여 장내 백신 후보 물질 2 , 3 , 4 로 Bm86과 같은 항원 단백질을 밝혀 냈습니다. 당 단백질 Bm86은 진드기 배아 세포 표면에 국한되어 백신 접종 된 소의 가축 진드기 ( R. microplus )에 대한 방어 면역 반응을 유도한다. 면역화 된 숙주에 의해 생성 된 항 -Bm86 IgG는 진드기에 의해 섭취되고, 진드기 장 세포의 표면에서이 항원을 인식하고,이어서 진드기 장 조직의 기능 및 완전성을 방해한다. Bm86 항원 기초 백신 횟수, 체중 및 후속 틱 4 세대 감소 유충 감염의 결과를 engorging 여성의 생식 능력을 감소시킴으로써, R.의 microplus 및 Rhipicephalus annulatus의 효과적인 제어를 보여준다. 그러나 Bm86 계 백신은 모든 진드기 단계에 효과적이지 않으며R.의 microplus의 일부 지리적 균주에 대한 불만족스러운 효과를 보여, 결과적으로 쇠고기와 낙농 산업은 가난, (4)이 백신 2를 채택했다. 진드기로부터 상피 세포를 분리하는 능력은 상이한 환경 조건 하에서 형태 및 생리를 포함한 단백질 막 조성을 결정하기위한 연구의 진행을 가능하게하는 중요한 혁신이다. 여기에 설명 된 방법은 킬레이트 화제 인 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)와 환원제 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)을 사용하여 상피를 상피지지 조직 10 에서 방출합니다. 상피는 동요에 의한 조직의 기계적 파괴 후 Percoll에서의 불연속 그라디언트 원심 분리에 의해 회복된다. 이 논문은 진드기 창자의 분리를위한 실현 가능하고 참신한 기술을 설명한다.세포. 이러한 상피 세포의 표면에서 분리 된 Biotinylated 세포 표면 단백질은 FACS 및 / 또는 LC-MS / MS 분석과 같은 다운 스트림 응용 프로그램에서이어서 분석 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mM Carbonate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL centrifuge tubes with sealing cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0016</td>
			<td>Cool in ice prior to gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0440</td>
			<td>Stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Labscene</td>
			<td>BSPA5.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-MOPS Gel</td>
			<td>Gen Script</td>
			<td>M42015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Chloro-1-naphthol tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning Blue</td>
			<td></td>
			<td>30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP15 filter paper</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AO1504200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Type A) Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab102865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP Manager&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>2.2.1.195</td>
			<td>Cell imagery software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duct Tape</td>
			<td>Home Handyman</td>
			<td></td>
			<td>48mm x 25mm Duct Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>DMEM - ice cold for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F96 Maxisorp Immuno Plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>&#160;Olympus&#160;</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>#9 Dumont - Switerzland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol for molecular biology &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-Held Counter</td>
			<td>Officeworks</td>
			<td>JA0376230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>H9394</td>
			<td>HBSS &#8211; ice cold for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Optik Lakor</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione oxidized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separation Stand</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>-</td>
			<td>4-Tube Magnetic Separation Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZRXQ003WW</td>
			<td>Integral Water Purification System for Ultrapure Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>66485</td>
			<td>30cm x 3M pure nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained protein Ladder</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>SM0671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1644-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7518-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>37573</td>
			<td>Stored at 4C. Blocking Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8215-5ML</td>
			<td>PIC &#8211; stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford Dye Reagent 1x</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>500-0205</td>
			<td>For Bradford Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start BSA Standards</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td>BSA standards for Bradford Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Lab. Co</td>
			<td></td>
			<td>Size 11 Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SilverQuest TM Staining Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue TM Safe Stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall C6+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue - Ultra Fast Mini</td>
			<td>UHU</td>
			<td></td>
			<td>UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>VM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>GD100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells

Rhipicephalus microplus - 가축 진드기는 여러 병원균의 벡터 인 가축에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충입니다. 진드기 장 상피 세포의 표면에 위치한 BM86과 같은 백신 후보 물질의 발견에 초점을 맞추어 유해한 영향을 줄이기위한 가축 진드기 관리에 전념했다. 현재 연구는 cDNA 및 게놈 라이브러리의 활용에 초점을 맞추고 다른 백신 후보 물질을 스크리닝합니다. 진드기 배아 세포의 분리는 진드기 배트 세포막에서 표면 단백질의 조성을 조사하는데 중요한 이점을 구성한다. 이 논문은 semi-engorged R. microplus 의 진드기 장 내용물로부터 상피 세포를 분리하기위한 새롭고 실현 가능한 방법을 구성한다 . 이 프로토콜은 TCEP와 EDTA를 사용하여 상피 세포를 상피 세포지지 조직과 불연속 밀도 원심 분리 그라데이션에서 분리합니다다른 세포 유형에서 상피 세포를 분리하는 것. FACS 또는 LC-MS / MS 분석에서 다운 스트림 응용 프로그램을 허용 streptavidin - 링크 마그네틱 비즈를 사용하여 세포 표면 단백질은 biotinylated 및 진드기 상피 세포에서 분리되었습니다.

상피 세포는 R. microplus 의 장 조직으로부터 그림 1에 제시된 도식에 따라 분리되었다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 진드기 배 상피 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지를 도 2A에 나타내었다 및 2B. 세포 격리가 semi-engorged R. microplus에서 수행됨에 따라 세포...

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Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus gut tissue로부터 상피 세포를 분리하기 위해 modified density centrifugation gradient-based 방법을 사용 하였다. 표면 결합 단백질은 스트리타비딘 자성 비드를 통해 바이오 티 닐화되고 정제되어 하류 적용에서 이용되었다.

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; 상피 직감 세포

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

연구

생화학

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

1 차 인간 기도 상피 세포의 기도 표면 액체 pH의 실시간 반 자동화 형광 측정

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, 간소화 된 단백질 결합 검정을 위한 생체 면역 펩티디스크에 막 단백질의 한 단계 통합

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...