Name: purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells
Uploaded: 2017-07-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить биозащищенности Tick колонию (Квинсленд Департамент сельского хозяйства и рыболовство, Австралия) для предоставления Rhipicephalus MicroPlus клещи , используемой для данного исследования, и Лукас Karbanowicz за помощью видеосъемки.

1. Рассечение кишечного эпителия от R. microplus <ol><li> Собирайте полупоглощенные клещи от крупного рогатого скота в день эксперимента. Просеивать тики в течение 24 часов после удаления с хозяина. </li><li> Прикрепите полоску клейкой ленты к нижней части чашки Петри размером 92 мм x 16 мм...

<ol>
	<li>Rodriguez-Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+Bm86+against+Hyalomma+dromedarii+and+Amblyomma+cajennense+tick+infestations+in+camels+and+cattle.">Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle.</a> Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).</li><li>De Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bm86+antigen+induces+a+protective+immune-response+against+Boophilus+microplus+following+DNA+and+protein+vaccination+in+sheep.">Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).</li><li>Garc&#237;a-Garc&#237;a, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variations+in+the+Boophilus+microplus+Bm86+locus+and+implications+for+immunoprotection+in+cattle+vaccinated+with+this+antigen.">Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen.</a> Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).</li><li>Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acaricide+resistance+in+cattle+ticks+and+approaches+to+its+management:+The+state+of+play.">Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play.</a> Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).</li><li>Kearney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).</li><li>Foil, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+the+prevalence+of+acaricide+resistance+and+tick-borne+diseases.">Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases.</a> Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+expression+of+the+B.+microplus+Bm86+antigen+in+the+yeast+Pichia+pastoris+forming+highly+immunogenic+particles+for+cattle.">High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle.</a> J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+vaccination+with+a+recombinant+Bm86+antigen+preparation+on+natural+infestations+of+Boophilus+microplus+in+grazing+dairy+and+beef+pure+and+cross-bred+cattle+in+Brazil.">Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil.</a> Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).</li><li>Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+reverse+vaccinology+approaches+for+the+development+of+vaccines+against+ticks+and+tick+borne+diseases.">A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases.</a> Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).</li><li>Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+removal+and+characterization+of+the+microvillar+membranes+isolated+from+two+midgut+regions+of+Spodoptera+frugiperda+(Lepidoptera).">Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera).</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).</li><li>Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+separate+apical,+lateral+and+basal+plasma+membrane+from+cells+of+an+insect+epithelium.+A+procedure+based+on+tissue+organization+and+ultrastructure.">Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure.</a> Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).</li><li>Koefoed, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+method+to+isolate+the+basal+lamina+of+insect+midgut+epithelial+cells.">A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells.</a> Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).</li><li>Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membranes+from+insect+midgut+cells.">Plasma membranes from insect midgut cells.</a> An. Acad. Bras. Ci&#234;nc. 78, 255-269 (2006).</li><li>Vargas, A. E., Markoski, M. M., Ca&#241;edo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Stem Cells. 879, 479-490 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li><li>Karhemo, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+isolation+of+biotinylated+cell+surface+proteins+reveals+novel+players+in+cancer+metastasis.">An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis.</a> J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).</li><li>Obenchain, F. R., Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Ticks.">Physiology of Ticks.</a> Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).</li><li>Sonenshine, D., Roe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.1.">Chapter 3.1.</a> &amp;#34;Biology of Ticks&amp;#34. 1, (2014).</li><li>Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &amp;#34;An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure&amp;#34 (English Translation). , (1983).</li></ol>

Население крупного рогатого скота представляет собой серьезную проблему для крупного рогатого скота в тропических и субтропических регионах мира, причем наиболее распространенный метод контроля зависит от использования акарицидов 1 , 4 . Bm86 ранее был и?...

Rhipicephalus microplus , крупный рогатый скот, является самым значительным эктопаразитом с точки зрения экономического воздействия на крупный рогатый скот в тропических и субтропических регионах, поскольку он переносит лихорадку крупного рогатого скота (бабезиоз), анаплазмоз и конский пироплазмоз 1 , 2 , 3 , 4 . Усилия были направлены на контроль крупного рогатого скота, чтобы уменьшить пагубный эффект, однако обычные методы, такие как использование химических акарицидов, имеют скрытые недостатки, такие как наличие химических остатков в молоке и мясе, а также увеличение распространенности химически устойчивых клещей 5 , 6 , 7 . Следовательно, были изучены разработки альтернативных методов контроля тика, такие как использование натурального скота, биологический контроль (биопестициды) и вакцинация4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . В погоне за белками, которые могут быть использованы в качестве кандидатов на вакцины, текущие исследования сосредоточены на кишке. Стена средней кишки построена из одного слоя эпителиальных клеток, опирающегося на тонкую базальную пластинку, а наружная базальная пластинка образует сеть мышц. Наблюдения света и электронного микроскопа показывают, что средняя кишка состоит из трех типов клеток: резервной (недифференцированной), секреторной и пищеварительной. Количество типов клеток значительно варьируется в зависимости от физиологической фазы. Секреторные и пищеварительные клетки происходят из резервных клеток 18 , 19 , 20 . Построение библиотек кДНКДля изучения состава клещей кишки привело к идентификации антигенных белков, таких как Bm86, в качестве потенциальных кандидатов вакцины 2 , 3 , 4 . Гликопротеин Bm86 локализуется на поверхности клеток кишечника клещей и индуцирует защитный иммунный ответ против клеща крупного рогатого скота ( R. microplus ) у вакцинированного крупного рогатого скота. Анти-Bm86 IgG, продуцируемые иммунизированным хозяином, проглатываются клещей, распознают этот антиген на поверхности клеток кишечника клеща и впоследствии нарушают функцию и целостность ткани кишечника. Вакцины, основанные на антигенах Bm86, показали эффективный контроль R. microplus и Rhipicephalus annulatus за счет сокращения числа, веса и репродуктивной способности сыпучих самок, что привело к снижению личиночной инвазии в последующих клеточных поколениях 4 . Однако вакцины на основе Bm86 не эффективны против всех этапов тика и имеютПродемонстрировали неудовлетворительную эффективность против некоторых географических штаммов R. microplus , поэтому говядина и молочная промышленность плохо приняли эти вакцины 2 , 4 . Способность изолировать эпителиальные клетки от клещей кишечника является важным новшеством, которое позволило бы прогрессировать исследования для определения состава белковой мембраны, включая морфологию и физиологию в различных условиях окружающей среды. Описанный здесь способ использует хелатирующий агент этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и восстановитель трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP) для высвобождения эпителия из его субэпителиальных поддерживающих тканей 10 . Эпителий восстанавливается после механического разрушения тканей путем встряхивания с последующим центрифугированием с разрывом градиента в Percoll. В этой статье описывается возможный и новый метод изоляции клещей кишечника epiТеалиальные клетки. Биотинилированные клеточные поверхностные белки, выделенные с поверхности этих эпителиальных клеток, могут впоследствии анализироваться в нисходящих приложениях, таких как FACS и / или LC-MS / MS-анализ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mM Carbonate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL centrifuge tubes with sealing cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0016</td>
			<td>Cool in ice prior to gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0440</td>
			<td>Stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Labscene</td>
			<td>BSPA5.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-MOPS Gel</td>
			<td>Gen Script</td>
			<td>M42015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Chloro-1-naphthol tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning Blue</td>
			<td></td>
			<td>30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP15 filter paper</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AO1504200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Type A) Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab102865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP Manager&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>2.2.1.195</td>
			<td>Cell imagery software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duct Tape</td>
			<td>Home Handyman</td>
			<td></td>
			<td>48mm x 25mm Duct Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>DMEM - ice cold for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F96 Maxisorp Immuno Plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>&#160;Olympus&#160;</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>#9 Dumont - Switerzland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol for molecular biology &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-Held Counter</td>
			<td>Officeworks</td>
			<td>JA0376230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>H9394</td>
			<td>HBSS &#8211; ice cold for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Optik Lakor</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione oxidized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separation Stand</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>-</td>
			<td>4-Tube Magnetic Separation Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZRXQ003WW</td>
			<td>Integral Water Purification System for Ultrapure Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>66485</td>
			<td>30cm x 3M pure nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained protein Ladder</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>SM0671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1644-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7518-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>37573</td>
			<td>Stored at 4C. Blocking Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8215-5ML</td>
			<td>PIC &#8211; stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford Dye Reagent 1x</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>500-0205</td>
			<td>For Bradford Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start BSA Standards</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td>BSA standards for Bradford Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Lab. Co</td>
			<td></td>
			<td>Size 11 Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SilverQuest TM Staining Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue TM Safe Stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall C6+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue - Ultra Fast Mini</td>
			<td>UHU</td>
			<td></td>
			<td>UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>VM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>GD100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells

Rhipicephalus microplus - клещ крупного рогатого скота - является самым значительным эктопаразитом с точки зрения экономического воздействия на скот в качестве вектора нескольких патогенов. Усилия были направлены на контроль клеща крупного рогатого скота, чтобы уменьшить его пагубные последствия, с упором на открытие кандидатов на вакцины, таких как BM86, расположенных на поверхности эпителиальных клеток кишечника. В текущих исследованиях основное внимание уделяется использованию кДНК и геномных библиотек для скрининга других кандидатов на вакцины. Выделение клеток клещей кишки является важным преимуществом при исследовании состава поверхностных белков на мембране клеток клещей. Эта статья представляет собой новый и осуществимый метод выделения эпителиальных клеток, из содержимого кишечника в виде полупоглощенного R. microplus. В этом протоколе используются TCEP и EDTA для высвобождения эпителиальных клеток из субэпителиальных опорных тканей и градиента дискретной плотности центрифугированияNt для отделения эпителиальных клеток от других типов клеток. Белки клеточной поверхности были биотинилированы и выделены из эпителиальных клеток тикового кишечника, используя магнитные гранулы, связанные с стрептавидином, что позволяет использовать последующие приложения в FACS или LC-MS / MS-анализе.

Эпителиальные клетки были выделены из тканей кишечника R. microplus в соответствии с схемой, представленной на рисунке 1 . Репрезентативные снимки флуоресцентной микроскопии эпителиальных клеток кишечника, полученные с использованием этог?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells at JoVE.com

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Методика, основанная на модифицированном градиенте плотности центрифугирования, была использована для выделения эпителиальных клеток из ткани кишечника Ripicephalus microplus . Поверхностные белки биотинилировали и очищали с помощью стрептовидиновых магнитных гранул для использования в нисходящих приложениях.

Очистка биотинилированных клеточных поверхностных белков от<em&gt; Ripicephalus microplus</em&gt; Эпителиальные кишечные клетки

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Биотинилированным клеток-проникая пептиды для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Очистка гепатоцитов и синусоидальных эндотелиальных клеток от мыши печени перфузии

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Изоляция клубочков и в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

В режиме реального времени, полуавтоматические флуоресцентные измерения воздуха поверхности жидкости рН первичных человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Pepti'uick, одноступенчатая инкорпорация мембранных белков в биотинилатированные пептидиски для оптимизированных белковых связывающих анализов

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Фракционирование клеток U937 методом изопикновой очистки градиента плотности

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Очистка убиквитинированных белков p53 из клеток млекопитающих

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...