Name: detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory at JoVE.com

Dette projekt blev finansieret af start-up finansiering til TME og AMR fra Louisiana Tech University og Furman University, henholdsvis. Yderligere støtte blev leveret af 2015 Fakultet avancement tilskud til AMR og TME fra The forbundet gymnasier i syd, Louisiana EPSCoR Pfund tilskud til TME fra National Science Foundation og Louisiana Board of Regents og en travel award til TME fra den Universitet i syd. Vi takker Dr. David Eubanks (Furman) for assistance med statistiske analyser og Mr. Christopher Moore "giver os en hånd" under optagelserne.

1. making reagenser
<ol>
	<li>Forberede glucose og galactose medier ved at blande 6,7 g gær nitrogen base, 20 g dextrose eller galactose, 20 mg adenin sulfat (tilføjet som 10 mL af en 200 mg/100 mL vandig stamopløsning), 20 mg uracil (tilføjet som 10 mL af en 200 mg/100 mL vandig stamopløsning) , 60 mg leucin (tilføjet som 6 mL af en 1 g/100 mL vandig stamopløsning), og 20 mg histidin (tilføjet som 2 mL af en 1 g/100 mL vandig stamopløsning) i ionbyttet vand til en endelige mængden af 1 L. Sterilize ved filtrering (0,2 µm filter). Medierne kan opbevares ved 4 ° C i flere uger.</li>
	<li>Forberede estradiol (E2) standarder ved at opløse pulveriseret E2 i vandfri ethanol og fortynding til de relevante arbejdsgruppe koncentrationer (227.5 nM &#38; 9,75 nM) i 50% ethanol. Bemærk: Hvis estradiol er købt som et hætteglas af 1 mg, tilsættes 1 mL ethanol direkte til hætteglas opløses estradiol pulver. Dette giver en 3,67 mM bestand #1.  Fortyndet 10 μL af stock #1 i 990 μL ethanol at gøre 1 mL af 36.71 μM stock #2.  Derefter fortyndes 10 μL af stock #2 990 μL 50% ethanol at gøre 1 mL af 367.13 nM stock #3.  For at gøre arbejder bestande, fortyndes 619.7 μL stock #3 i 380.3 μL 50% ethanol at gøre 1 mL af 227.5 nM arbejder stock bruges til at oprette standard kurver med gær udtryk for ERα.  Fortynd 26.56 μL stock #3 i 973.44 μL 50% ethanol at gøre 1 mL af 9,75 nM arbejder stock bruges til at oprette standard kurver med gær at udtrykke ERβ. Forsegle standarder med parafilm og opbevares ved -20 eller -70 ° C. Forsigtig: E2 er en formodet kræftfremkaldende og reproduktive giftstoffet. Det er skadeligt hvis indåndes, sluges eller optages gennem huden. E2 kan forårsage skade på amning børn og fostre. E2 er meget giftige for vandlevende organismer. Bruge relevante personlige værnemidler (handsker, stinkskab, støvmaske) og undgå eksponering under graviditet og amning. Afhænde E2 som farligt affald og ikke frigive i miljøet.</li>
	<li>Forberede LacZ buffer ved at blande 8,52 g Na2HPO4, 5.52 g NaH2PO4•H2O, 95.21 mg MgCl2, 745.5 mg KCl, 2 g N-lauroylsarcosine natriumsalt, og enten ONPG (400 mg) eller CPRG (77,7 mg) i ionbyttet vand til en finale bind 1 L. butik LacZ buffer i 20 mL alikvoter ved-20 ° C. Bemærk: En 20 mL alikvot er tilstrækkelig for en 96-brønd plade.</li>
	<li>Forberede natriumcarbonat ved at blande 105.9 g natriumcarbonat i ionbyttet vand til en endelige mængden af 1 L. butik på RT.</li>
	<li>Forberede 1 M dithiothreitol (DTT) i vand. Fryse 25 µL delprøver af DTT ved-20 ° C. Forsigtig: DTT er en akut hud og øje irriterende. Bruge relevante personlige værnemidler (handsker, stinkskab, støvmaske) for at undgå hud og øjenkontakt, indånding og indtagelse. Bemærk: Hver delprøve er tilstrækkelig for en 96-brønd plade.</li>
</ol>
2. forberedelse af prøver og udvinding kontrol
<ol>
	<li>Vælg prøver at teste. Bemærk: Denne artikel præsenterer data for femten PCPs, herunder sæbe, hår creme, shampoo, solcreme, læbepomade, foundation, barberskum, neglelak og lotion.</li>
	<li>Kombiner 1 g af prøven med 10 mL af vandfri ethanol i en 15 mL konisk slange. Forberede en negativ udvinding kontrol består af 11 mL ethanol i en 15 mL konisk slange. Forberede flergangsbestemmelser, efter behov. Bemærk: For præsenteres eksperimentelle design, tre delprøver af alle 15 PCPs og tredobbelt udvinding styringsløsninger blev udarbejdet, giver i alt 48 prøver, som hver blev analyseret i tre eksemplarer med protokollen i afsnit 4. En enkelt plade kan rumme op til 23 prøver i tre. Vandfri ethanol anvendes i dette trin, fordi det fordamper let. Brug negative udvinding kontrol til at kontrollere, at østrogener ikke udvaskning i prøver fra de koniske rør.</li>
	<li>Homogeniseres tube indholdet i 30 min ved en kombination af manuel omrystning og vortexing eller ved at ryste rør på en multi tube vortexer.</li>
	<li>Centrifugeres koniske rør ved den maksimale tilladte hastighed i en spand centrifugeres i 10 min. Decant supernatanten fra hver tube gennem en 40 µm celle si i en 50 mL konisk slange. Tom indholdet af hver 50 mL tube i et glas scintillation hætteglas.</li>
	<li>Efterlad hætteglas åbne i en ventileret hood for en uge at tillade ethanol til at fordampe fuldstændig. Alternativt, tørre prøver i en ventileret hood under nitrogen eller med en rotationsfordamper. For at undgå nedbrydning af lys følsomme vælgere, beskytte tørring prøver fra lys (f.eks.sted uigennemsigtigt stof over ventilerede hood døren).</li>
	<li>Rekonstruere prøver i 1,0 mL 50% ethanol og vortex at homogenisere.</li>
</ol>
3. dyrkning og podning gær14
<ol>
	<li>Opretholde aktive gær kulturer (rekombinante W303a stamme af S. cerevisiae14) ved at inkubere gær i filter-steriliseret glukose medier ved 30 ° C. Subkultur gær ugentligt i frisk filter-steriliseret glukose medier.</li>
	<li>To nætter (ca 42 h) før forberede ja plader, subkultur gær ved at tilføje 0,1 mL af aktive gær kulturer til 10 mL af filter-steriliseret glukose medier ved hjælp af steril teknik.  Der inkuberes ved 30 ° C i to nætter.  Ryster er ikke påkrævet, hvis gær er vokset som lavvandede kulturer i sterile 250 mL Erlenmeyerkolbe kolber. Bemærk: Gær kan også være gemt på nedkølet agar plader i flere måneder. For længere opbevaring (år), kombinere O/N kulturer med 15-50% steril glycerol, vortex og fryse ved-70 ° C. For at forberede steril glycerol, skal du bruge en sprøjte til at overføre 300 µL glycerol til en cryovial og autoklave med fælles landbrugspolitik løsnes. Derefter tilføje 1.200 µL O/N gær kultur ved hjælp af steril teknik.</li>
</ol>
4. forberedelse ja plader (dag 1 i analysen)
<ol>
	<li>I et sterilt bæger og ved hjælp af steril teknik, fortyndes gær fra trin 3.2 til en optisk tæthed af 0.065 ±0.005 på 610 nm (OD610) i filter-steriliseret galactose medier.<ol>
		<li>Bekræfte Ekstinktionen af pipettering 120 μL af hver gær prøve i tre eksemplarer samt tredobbelt galactose tomme felter i en klar polystyren plade (plade behøver ikke at være steril).  Bruge Spektrofotometer plade til at kontrollere, at den fortyndede gær kultur har en netto OD610 af 0.065 ±0.005 trækker OD610 aflæsninger af galaktose blanks fra gær OD610 aflæsninger at bestemme netto OD610 af gær. Forberede en endelige mængden af mindst 30 mL fortyndet gær for hver 96-brønd plade. Bemærk: Spektrofotometer filtre måling af absorbans mellem 595 og 610 nm kan bruges til denne måling.</li></ol></li></ol>En omtrentlige 1:6 v: v ratio af gær: medier typisk giver en OD610 tæt på 0,065, så start ved at føje 4,5 mL gær til 30 mL medier og tilføje mere gær eller medier som hensigtsmæssigt at opnå en netOD610 mellem 0.060 og 0.070.
	
	
	<li>Brug steril teknik, tilføje denne fortyndede gær suspension til brønde i en steril, polypropylen, 96-brønd mikrotiterplade ifølge plade layout (figur 1). Under pipettering, holde kilden gær suspenderet af løbende hvirvlende beholderen eller blande med pipetten. For dette trin er det nyttigt at bruge en gentaget pipette med en steril sprøjte spids. Bemærk: Polypropylen plader er steriliseret ved autoklavering to stablede skilte i folie.  Den øverste plade tjener som et låg til prøve plade og kan blive vasket, re-autoklaveres og genbruges.</li>
	<li>Tilføje 120 µL filter-steriliseret galactose medier til 3 yderligere wells (H10 - 12) efter plade layout (figur 1). Disse brønde fungere som medier kontrol for at tage højde for absorbans bidraget af medierne alene.</li>
	<li>Konstruere en standardkurve i hver tallerken ved seriel fortynding af tre af E2 arbejdsstandarder (227.5 nM for ERα, 9,75 nM for ERβ) i wells indeholdende gær suspension (A1 - G3) Ifølge plade layout (figur 1).  Indledningsvis ved at tilføje 5 µL af E2 standarder brønde A1 gennem A3. Bland microwell indholdet af pipettering, og derefter seriefremstillede fortyndes denne suspension ved at flytte 205 µL fra brønde A1 - 3 i boringer B1 - 3. Gentag blanding og overførsel af 205 µL gennem rækken G. Bemærk: Efter seriel fortynding er afsluttet, kassere 205 μL fra brønde G1 - 3. I slutningen af dette skridt, bør alle standard wells indeholder 120 μL. Seriel fortynding vil give de endelige E2 koncentrationer der er anført i tabel 1. For seriel fortynding skridt er det nyttigt at bruge en mulitkanalpipette med steril tips.</li>
	<li>Tilføj 5 µL af køretøjet (50% ethanol) til køretøjet kontrolhullerne indeholdende gær suspension (H1 - 3) Ifølge plade layout (figur 1). Bemærk: Køretøj kontrolhullerne bruges til at kvantificere baggrundsabsorbansen forbundet med gærceller og medier. Derudover cytotoksicitet eller vækst fremme effekter af test prøver kan påvises ved at sammenligne OD610 værdier af test brønde med de af køretøjets kontrolhullerne.</li>
	<li>Tilføje 5 µL tre prøver og negative udvinding kontrolelementer til brønde indeholdende gær suspension efter plade layout (figur 1). Bemærk: Noter som prøver eller negative udvinding kontrolelementer er tilføjet til hver brønd.  At holde styr på hvilke brønde med prøver og som ikke, starter med en frisk kasse med tips og bruge tips fra de samme steder i boksen som placeringen af de tilsvarende brønde i pladen. En 96-brønd plade kan rumme op til 23 prøver i tre eksemplarer.</li>
	<li>Bland indholdet af prøven, udvinding kontrol og køretøj kontrolhullerne af pipettering. Justere mængden af disse brønde til 120 µL af fjerner 205 µL af hver, som beskrevet i forklaringen til figur 1.</li>
	<li>Forsegle skilte med en steril, selvklæbende, porøse film. Etiket plader og inkuberes i 17 h ved 30 ° C. Pladen behøver ikke at blive rystet under inkubation</li>

5. forarbejdning ja plader (dag 2 af analysen)
<ol>
	<li>Efter 17 h inkubation ved 30 ° C, skal du fjerne plader fra rugemaskinen. Hvis plader vil blive behandlet straks, Fortsæt til trin 5.1.1. Hvis plader vil blive behandlet på et senere tidspunkt, skal du gå videre til trin 5.1.2.<ol>
		<li>Bruge en mulitkanalpipette for at blande indholdet af hver række af brønde, og derefter overføre 50 µL af gær suspension fra hver brønd til tilsvarende godt af en klar, polystyren, 96-brønd mikrotiterplade. Bemærk: Polystyren plader behøver ikke at være steril men bør have et låg. Brug nye pipette tips for hver række i wells for at undgå cross-forurenende wells, selv hvis pipettering på tværs af tre med en 8-tip multikanalpipette, tips kun skal ændres mellem tredobbelt sæt.<ol>
			<li>Mærke den nye plade. Fortsæt til trin 5.2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hvis du vil gemme plader før behandling, pak dem i plastikfolie. Opbevares i køleskab indpakket plader ved 4 ° C for 6 d. bagefter, fjerne pladerne fra køleskabet, pak dem og overføre indholdet af alle brønde af pipettering som i trin 5.1.1. Fortsæt til trin 5.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tilføj 20 µL 1 m DTT til 20 mL af optøede, stuetemperatur LacZ buffer til en endelig koncentration på 1 mM DTT. Mix LacZ buffer godt. Hvis brug af en multikanal-pipette, dispensere til et reagens reservoir. Forsigtig: Brug handsker og arbejde med DTT i en hætte, hvis det er muligt</li>
	<li>Ved hjælp af enten en multikanalpipette eller gentage pipette, tilføje 200 µL af LacZ buffer indeholdende DTT og enten ONPG eller CPRG til alle pladens huller, polystyren, og straks måle og registrere OD610 af alle brønde ved hjælp af en plade Spektrofotometer. Gentag efter behov for ekstra plader. Bemærk: OD610 aflæsninger anvendes som nævner i beregningen LacZ (trin 6.1). Derfor får behandlinger umiddelbart efter pipettering og før celler settle eller er mængden af LacZ buffer. Hvis OD610 værdier for prøven brønde er mærkbart højere eller lavere end OD610 værdier for køretøjet kontrolhullerne, er prøveekstrakter enten vækstfremmende eller cytotoksiske til gær, henholdsvis. LacZ beregning vil korrigere for små forskelle i celle tætheder på tværs af brønde, men hvis forskelle overstiger 30% i begge retninger, derefter fortyndes den rekonstituerede prøve (fra trin 2.6) i yderligere 50% ethanol og teste prøven ved at vende tilbage til trin 3.2 12.</li>
	<li>Dække plader med låg. Inkuber plader der indeholder gær at udtrykke ERα14 ved 30 ° C i 40 min (for ONPG) eller 3 h (for CPRG). Inkuber plader der indeholder gær at udtrykke ERβ14 ved 30 ° C til 70 min. (til ONPG) eller 4 h (for CPRG). Bemærk: Når du arbejder med CPRG, inkubation times er fleksibelt; inkubere for 2-4 h giver passende resultater med både receptorer, med længere inkubationer stigende assay følsomhed.</li>
	<li>Efter inkubation plader, skal du bruge en multikanalpipette eller gentagne pipette til Tilsæt 100 µL af natriumcarbonat til hver brønd. Natriumcarbonat hæver pH og stopper β-galactosidase reaktion.</li>
	<li>Måle og registrere OD405 (for ONPG) eller OD574 (for CPRG) i alle brønde ved hjælp af en plade Spektrofotometer.</li>
</ol>
6.Beregning af LacZ værdier
Bemærk: LacZ værdier kvantificere graden af farveskift for hver prøve og tilbyde en standardiseret metode til sammenligning af værdier blandt separat assays af regnskab for flere variabler (fx, gær optisk tæthed, medier optisk tæthed og inkubering tid hvis Dette adskiller sig blandt brønde på den samme plade)12.
<ol>
	<li>Beregne middel til tredobbelt OD610 værdier for medier (galactose) kontrolhullerne (H10-12), og beregne tredobbelt OD405 eller OD574 værdier for køretøjet (50% ethanol) kontrolelementer (H1-3). Bruge disse midler og Inkubationstiden (t) i timer for pladen til at ændre farve (trin 5.5) for at beregne LacZ værdier (svarende til graden af farveændring i hver brønd) for alle standard og prøve brønde ved hjælp af følgende ligninger: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq1.jpg"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq2.jpg">
	<ol>
		<li>Alternativt, brug den automatiseret program i tillæg 1 til at beregne LacZ værdier for standarder og prøver. Bemærk: Plade layout bruges sammen med ansøgningen skal være identisk med layoutet plade præsenteret i figur 1. Hvis nogle prøve wells ikke blev brugt, bevare absorbans aflæsninger fra de tomme brønde som sted indehavere i absorbans datasættet er indsat i tillæg 1 LacZ ansøgning.  Dette bevarer den rumlige layout af pladen i ansøgningen og sikrer, at media-kontrolhullerne i deres krævede placering.  Derudover vil programmet ikke køre hvis der er tomme celler.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Beregne middel til tredobbelt LacZ værdier for hver E2 standard og hver prøve. Rapport LacZ middelværdier som µL-1h-1. Log-transform koncentrationerne af hver standard E2, og generere et regnearksdokument formateret som i filen template.csv (tillæg 2).</li>
</ol>
7. interpolering prøve Estradiol ækvivalenter (EEQs) bruge 4-Parameter logistisk Regression
Bemærk: EEQs vedrører prøve LacZ værdier (farveændring) LacZ værdier på standardkurven lavet med E2. EEQs således afgøre, hvor meget er forpligtet til at fremkalde den samme farve ændring reaktion som en kendt koncentration af E2.
<ol>
	<li>For at beregne EEQs for prøver, først plot standardkurven. Passer LacZ middelværdier for E2 standarder (y-akse) og de tilsvarende log-transformeret E2 koncentrationer (x-aksen) til en fire-parameter logistisk regressionsmodel.</li>
	<li>Bruge modellen til at interpolere EEQs for test stikprøven LacZ værdier. Gennemføre logistisk regression beregninger af EEQs ved hjælp af statistisk software som beskrevet i tillæg 2.</li>
</ol>
8. standardisering EEQs (ng/mL) til PCP prøve masse
<ol>
	<li>For at relatere EEQs til mængden af PCP prøve tilføjes hver godt i trin 4.5, formere EEQ (ng/mL) af den samlede mængde belagt i stikprøven brønde (325 µL) og derefter dividere med udpakkede prøvemængden tilføjet til hver brønd (5 µL). Bemærk: Disse værdier repræsenterer EEQ pr. mL af udtrukne udsnit. Hvis prøverne er fremstillet ved hjælp af 1 g af PCP, repræsenterer disse værdier også EEQ per gram af PCP (ng/g). Udtrykt på denne måde, kan EEQ værdierne (ng/g) sammenlignes på tværs af forskellige PCPs. EEQ (ng/g) værdier for personlig plejeprodukter testet i denne undersøgelse er vist i tabel 2, og prøveeksemplar data indsamlet i hele den hele protokol er inkluderet i Tillæg 3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+healthy+Mediterranean+diet:+estrogenic+activity+of+plants+used+as+food+and+flavoring+agents.">Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents.</a> Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).</li><li>Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+soybeans+(Glycine+max)+varies+by+plant+organ+and+developmental+stage.">Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage.</a> Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).</li><li>Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+and+anti-estrogenic+activity+of+off-the-shelf+hair+and+skin+care+products.">Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products.</a> J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).</li><li>Wagner, M., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors+in+bottled+mineral+water:+estrogenic+activity+in+the+E-Screen.">Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).</li><li>Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J., McLachlan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+estrogen+screen+for+examining+the+relative+exposure+of+cells+to+natural+and+xenoestrogens.">A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens.</a> Environ Health Perspect. 104 (5), 544-548 (1996).</li><li>Odum, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rodent+uterotrophic+assay:+critical+protocol+features,+studies+with+nonyl+phenols,+and+comparison+with+a+yeast+estrogenicity+assay.">The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 25 (2), 176-188 (1997).</li><li>Mellanen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood-derived+estrogens:+studies+in+vitro+with+breast+cancer+cell+lines+and+in+vivo+in+trout.">Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 136 (2), 381-388 (1996).</li><li>Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+four-hour+yeast+bioassay+for+the+direct+measure+of+estrogenic+activity+in+wastewater+without+sample+extraction,+concentration,+or+sterilization.">A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization.</a> Sci Total Environ. 408 (6), 1422-1429 (2010).</li><li>Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+recombinant+yeast+cell+estrogen+screening+assay.">Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay.</a> Environ Health Perspect. 105 (7), 734-742 (1997).</li><li>De Boever, P., Demar&#233;, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+yeast+estrogen+screen+and+its+applicability+to+study+the+release+of+estrogenic+isoflavones+from+a+soygerm+powder.">Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder.</a> Environ Health Perspect. 109 (7), 691-697 (2001).</li><li>Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+ligands+and+dissecting+nuclear+receptor-signaling+pathways+using+recombinant+strains+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protoc. 3 (3), 637-645 (2008).</li><li>Routledge, E. J., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+activity+of+surfactants+and+some+of+their+degradation+products+assessed+using+a+recombinant+yeast+screen.">Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen.</a> Environ Toxicol Chem. 15 (3), 241-248 (1996).</li><li>Miller, C. A., Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+plasmids+expressing+human+steroid+hormone+receptors+and+a+reporter+gene+for+use+in+yeast+signaling+assays.">Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays.</a> Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).</li><li>Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaill&#232;s, V., Balaguer, P., Bourguet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+profiling+of+environmental+ligands+for+estrogen+receptors.">Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors.</a> Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).</li><li>Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+detection+of+beta-galactosidase+in+transfected+mammalian+cells.">A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells.</a> Biotechniques. 11 (6), (1991).</li><li>Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+beta-galactosidase+tissue+levels+in+a+tumor+cell+xenograft+model.">Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model.</a> Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).</li><li>Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+beta-galactosidase+activity+in+tissue+in+the+presence+of+blood.">Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood.</a> J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).</li><li>Gray, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+alcohol+tolerance+of+yeasts.">Studies on the alcohol tolerance of yeasts.</a> J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).</li><li>Schug, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+endocrine+disruption+out+of+the+next+generation+of+chemicals.">Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals.</a> Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Ja er en billig metode til at registrere østrogene ligander i miljøprøver, såsom vand, mad, plantevæv eller produkter til personlig pleje. Data præsenteres her Sammenlign 2 østrogenreceptorer (ERα og ERβ), 2 substrater (ONPG og CPRG) og 2 tidslinjer (2 d-uden køling) og syv-dages protokollen med køleanlæg til måling af estrogenicity i personlig plejeprodukter via ja assay. 7 d, nedkølet protokollen ved hjælp af CPRG og gær udtryk for ERα og/eller ERβ bedste kvantificerer EEQs mens også er kompatibel med tidsbegrænsninger pålagt af bachelorstuderende laboratorium kurser, som mødes én gang / uge i flere timer. Faktisk var i forhold til 2 d assayet uden køling, syv-dages nedkølet analysen forbundet med reduceret variansen på tværs af plade replikater. Den lineære del af standardkurven var derudover lidt udvidet for data indsamlet ved hjælp af den kølede assay. Den lineære del af standardkurven definerer assay registreringsområde og er den eneste del af standardkurven, der kan bruges til at interpolere prøve EEQs.
I alle, men en af de testede prøver var EEQs målt ved hjælp af CPRG lavere end de tal med ONPG. Med en højere extinction koefficient og lavere Km og Vmaxer CPRG ti gange mere følsom end ONPG17. Således CPRG kan anvendes ved lavere koncentrationer og kan bruges til at registrere lavere mængder af β-galactosidase. Af disse grunde er CPRG generelt foretrækkes over ONPG18,19. Større substrat følsomhed forklarer imidlertid ikke de lavere EEQ værdier fundet med CPRG. De højere EEQ værdier fundet med ONPG kan skyldes matrix interferens med analysen, som bemærket af andre forfattere2,18. Gule pigmenter fra personlig pleje produkt ekstrakter kunne puste EEQ værdier fundet med ONPG. Andre har omgået dette problem ved at inkludere pigment kontrol i deres eksperimentelle design2, en tilgang, der fordobler antallet af plader i et eksperiment. Når matrix forstyrrelser kan være problematisk, kan CPRG være at foretrække substrat for ja assay, selvom det er dyrere og kræver længere inkuberingstider end ONPG. Derudover er farveændringen induceret af kløvningen af substrat af β-galactosidase mere dramatisk med CPRG, hvilket gør det lettere for studerende at visualisere resultater.
Miller et al. (2010), der manipuleret gæren bruges i denne protokol, bemærkes, at gær at udtrykke ERβ var 30 x mere følsomme over for 17β-østradiol end gær udtryk for ERα, en konstatering, underbygget af vores data14. Bortset fra potentielle nuancerne i plasmid konstruktion, Miller et al. (2010) kunne ikke forklare denne forskel i følsomhed14. En forskel mellem de to plasmid konstruktioner er at ERα udtryk er reguleret af galaktose, hvorimod ERβ udtryk er reguleret af enten glucose eller galactose. Gæren bruges i ja assay er kulturperler i glucose medier og kun givet galaktose, når de er fortyndet i starten af analysen. Derfor, gær at udtrykke ERβ kan akkumulere højere kopi numre af receptorproteiner forud for starten af analysen, hvilket giver højere følsomhed over for østrogene ligander.
Den lavere følsomhed af ERα-udtrykker gær kan forklare de højere priser for ikke-påvisning af estrogenicity i prøverne målt med ERα sammenlignet med ERβ. For at øge sandsynligheden for vil at prøve EEQs blive opdaget, brugernes kunne ansætte forskellige ekstraktionsmidler og metoder eller tilføje større mængder af prøven til gæren. Hvis højere prøve diskenheder bruges, bør koncentrationen af E2 standarder justeres således, at den samme mængde af standarder og prøver kan bruges i analysen. En begrænsning af tilføjer flere prøve er, at gæren kan tåle kun 6-10% ethanol, med bedre tolerance ved inkubation temperaturer på 30 vs 35 ° C20. For at kontrollere for virkningerne af ethanol på gær, bør efterforskere tilføje tredobbelt "gær kun" brønde til plade layout og bekræfte, at OD610 af disse "gær kun" wells er sammenlignelig med OD610 af køretøjet kontrolhullerne straks efter tilsætning af LacZ buffer. Alternativt, prøver opløst i ethanol kan føjes til tørre microwell plader og ethanol fordampet ud før gær er tilføjet. Dimethylsulfoxide (DMSO) er også brugt som prøve opløsningsmiddel i ja-undersøgelser, men den endelige arbejde koncentration af DMSO med gær bør begrænses til 1%12.
Ja assay er en kraftfuld screeningsværktøj til påvisning af estrogenicity i miljøprøver. Specifikt, registrerer ja ligander, der binder nukleare østrogen-receptorer, der interagerer med østrogen svar elementer til direkte gene expression14. Ja har imidlertid også vigtige begrænsninger. Ja registrerer ikke EBS, der arbejder gennem ikke-nukleare mekanismer såsom membran østrogenreceptorer eller mekanismer, der indebærer yderligere elementer som aktivator Protein 1 (AP-1) transkriptionsfaktorer. Desuden, fordi gær ikke har de samme metaboliske kapacitet som pattedyrceller, ja ikke kan registrere ligander, der kræver metabolisk aktivering skal østrogene.
Derudover kan ja assay let skelne mellem østrogene og anti-østrogene ligander i komplekse prøver. I stedet, det måler net estrogenicity, som er den samlede effekt af østrogene og anti-østrogene ligander. For at kvantificere koncentrationen af ER antagonister eller evaluere de hæmmende aktivitet af blandinger, kan analysen ændres ved at inkubere gær med både den standard agonist (17β-estradiol) og en række test stikprøven koncentrationer12. Denne proces bestemmer hvis antagonister i prøverne kan mindske agonist-induceret reporter aktivitet og giver en nyttig skærmen for at identificere tilstedeværelsen af ER antagonister i prøver.
Protokollen præsenteres her kan rumme en række forskellige typer prøve, selvom nogle prøver kan kræve ændringer i forberedelsestrin udvinding og prøve. For eksempel, EEQs varierede meget blandt replikater af nogle produkter til personlig pleje. De mere variable prøver en tendens til at indeholde olie dråber eller ellers var ikke helt homogen, der angiver, at en mere lipofile opløsningsmiddel som diethylether ville være nyttigt. Alternativt, olier og voks i produkter til personlig pleje kan udelukkes ved at udtrække prøver med 50% ethanol i stedet for 100% ethanol.En 50% ethanol udvinding vil også fange mere vandopløselige østrogene ligander (fx, nogle pigmenter). Men 50% ethanol fordamper langsommere end 100% ethanol og dermed kan forlænge udvindingen tid. Derudover var nogle prøver (såsom sæber) cytotoksiske til gær, hvilket resulterer i reducerede celle tæthed målinger (OD610). Fox et al. (2008) tyder på, at prøverne fortyndes og testes igen hvis celle tæthed forskelle overstiger 30% i forhold til koeretoejets styring wells12.
Hvis ja analysen bruges til analytiske forskning, kan fortynding kurver af prøven puljer testes Bestem preemptively passende mængde ekstrakt tilføjes til gær i trin 4.5. Alternativt, ekstrakter kan testes samtidigt på flere diskenheder (f.eks.5 µL og 20 µL ekstrakt tilsættes gær i trin 4,5) eller fortyndinger, der spænder over størrelsesordener (f.eks.0,2 µL, 2 µL og 20 µL). "Passende" bind af ekstrakt er dem, der identificerer estrogenicity af tilsvarende LacZ værdier langs den lineære del af standardkurven. Optimering forhindrer problemer forårsaget ved at tilføje for meget eller for lidt prøve gær, som cytotoksicitet, falske negativer eller estrogenicity, der overstiger standardkurven. Som nævnt ovenfor, bør mængder af prøver og E2 standarder justeres, når forskellige mængder af ligand bruges sådan, at gær er udsat for en konsekvent mængde og koncentration af ethanol eller andre køretøjer i hele pladen.
Trods potentialet for falske negativer, er ja assay blevet identificeret som en Tier 3 test værktøj for hormonforstyrrende stoffer af Schug et al. (2013), der har udviklet en omfattende differentieret protokol for endokrine forstyrrelser (TiPED)21. For uddannelsen af de studerende er analysen værdifulde til undervisning i begreber i relation til hormonforstyrrelser, cellekultur, receptor binding, enzymaktivitet, genteknologi, statistik og eksperimenterende design. Studerende, der bruger analysen også øve grundlæggende og bredt anvendelige laboratorium færdigheder såsom seriel fortynding standarder; uddrager prøver; at lave løsninger; konstruere og interpolering standard kurver; beregning af koncentrationer; at lave løsninger; demonstrere steril teknik; dyrkning af celler; identificering af variabler og kontrol; indsamle, organisere og analysere data; opbygge og fortolke grafer; og ved hjælp af fælles laboratorieudstyr såsom micropipettors og spektrofotometre.

Gær østrogen skærm (ja) er almindeligt anvendt til at kvantificere ligander, der efterligner estradiol (E2 eller 17β-estradiol) i en række forskellige matricer, herunder vand, plantevæv, forbrugerprodukter og fødevarer1,2,3, 4. Kollektivt, benævnes disse ligander "Miljømæssige østrogen (EBS)." Ja blev oprindeligt udviklet som en lav pris, in vitro- alternativ til i vivo test som den gnaver uterotrophic assay5,6 og regnbueørred fodring assay7. Formålet med disse test er at afgøre, om et produkt indeholder kemikalier, der stimulerer eller blokere østrogen-afhængige mekanismer. Påvisning af EBS er kritisk, fordi de kan forstyrre normale endogene østrogen signalering, især i løbet af fostrets udvikling. Denne indblanding kompromiser sundhed ved at øge risikoen for fedme, infertilitet, kræft og kognitive tab8.
Trods vigtigheden af EBS og andre EDC for folkesundheden, er hormonforstyrrelser ikke almindeligt inkluderet i undergraduate læseplaner. Denne mangel er dels på grund af mangel på aktiviteter, der illustrerer principperne involveret samtidig også være tilgængeligt for studerende. Derudover flere variationer af ja-protokollen findes9,10,11,12,13, og denne mangfoldighed gør assay optimering tidskrævende for laboratoriet koordinatorer ikke specifikt uddannet i de relevante teknikker. Endelig, ja assays er normalt afsluttet mere end 1 lang dag eller 2 dage i træk med en O/N inkubation. Denne timing er ikke kompatibel med formatet for undergraduate laboratorium kurser, som typisk mødes én gang / uge i flere timer.
Svar på disse behov rapporter dette manuskript en optimeret 96-nå ja protokol, der omfatter ethanoliske udvindingsmetoder for produkter til personlig pleje (PCPs)3 og en 6-dages køle skridt til at rumme ugentlige laboratorium møder. Absolut ethanol er en alsidig organisk opløsningsmiddel, der kan opløse en lang række polære og upolære opløste stoffer. Derudover er det egnet til bachelor kurser, fordi det er let tilgængelige, relativt ugiftige, overkommelig, og blandbar med vand; det fordamper også nemt uden specialudstyr. Men ethanol er ikke ideelt til at udtrække kraftigt hydrofobe hormonforstyrrende stoffer eller mange olier og voks, de to sidstnævnte er almindelige ingredienser i PCPs. fattige ekstraktionseffektivitet øger risikoen for falsk negative resultater. Med denne begrænsning i tankerne, bør efterforskere vælge ekstraktion procedurer (fx, ethanoliske udvinding eller faste fase udvinding) at adresse prøve karakteristika og opfylde undersøgelse mål (forskning versus bachelor instruktion).
Ja er afhængig af rekombinant Saccharomyces cerevisiae oprindeligt lavet af Dr. Charles Miller ved Tulane University. Se venligst Miller et al. (2010) for et komplet kort over manipuleret plasmid14. Gær omdannet med disse plasmider constitutively express menneskelige nukleare ERα eller ERβ (også kaldet ESR1 og ESR2, henholdsvis) når der dyrkes i medier indeholdende galactose (for ERα) eller enten glucose eller galactose (for ERβ). Hvis østrogene kemikalier findes i medierne, binder de til receptorer, oprettelse af ligand-receptor komplekser, der aktiverer β-galactosidase (lacZ) udtryk på et niveau, der er proportional med koncentrationen af østrogene kemikalier. Gærceller er så mængden for at frigive den akkumulerede β-galactosidase. Lysisbuffer indeholder enten ONPG eller CPRG, som er kløvet af β-galactosidase at give gule eller røde produkter, henholdsvis. Kolorimetrisk produkter kan kvantificeres ved måling af absorbans ved hjælp af en microwell plade Spektrofotometer. Graden af farveskift er proportional med koncentrationen af østrogene ligander, gæren blev udsat.
Valget af substrat (CPRG eller ONPG) afhænger af potentialet for baggrundsabsorbansen som følge af de prøver, der testes. For eksempel planteekstrakter ofte vil tilføje en gul nuance til medierne, der kunstigt oppustet estrogenicity foranstaltninger, hvis ONPG (kvantificeres ved 405 nm) er brugt som substrat for β-galactosidase. Med plante ekstrakter, CPRG (kvantificeres på 574 nm) kan være et mere passende kolorimetriske substrat. CPRG er dyrere end ONPG men bruges på en tiendedel af molariteten. Denne artikel præsenterer estrogenicities af PCP ekstrakter kvantificeres ved hjælp af både ONPG og CPRG.
Kvantificere estrogenicity af miljøprøver ved hjælp af både ERα og ERβ er en mere omfattende tilgang end ved hjælp af kun én af disse receptorer. I dyr udstille disse receptorer differential væv distribution, reguleringsvirksomhed og bindende tilhørsforhold til østrogene og anti-østrogene ligander15. For eksempel, bind plante-baserede fytoøstrogener typisk ERβ mere kraftigt2, mens syntetiske kemikalier kan vise præference for enten ERα eller ERβ eller kan binde begge receptorer lige så godt15. Derfor forudsige binding til en østrogen receptor ikke nødvendigvis binding til den anden.
Selv om EBS er fundet i mange forbrugerprodukter (f.eks.pesticider, vaskemidler, klæbemidler, smøremidler, plast, fødevarer og lægemidler) samt planter, de præsenterede data blev indhentet ved hjælp af et udvalg af PCPs. PCPs er overbevisende, let tilgængelige budget-venlige og miljømæssigt relevante for studerende. Eleverne kan opfordres til at bringe deres foretrukne PCPs fra hjem til test i laboratoriet. De kan også søge i huden dyb databasen udviklet af Environmental Working Group16 for at generere hypotese-drevet sammenligninger af PCPs med høj og lav toksicitet scores. På denne måde, kan studerende samtidig udvikle avancerede laboratorium færdigheder; engagere sig i selvstyret, undersøgelse baseret læring; og udforske nye problemstillinger på miljø og sundhed.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex Mixer (for single or multiple tubes)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-215-365</td>
			<td >Any mixer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bucket centrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >75-063-839</td>
			<td >Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bunsen burner</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >17-012-823</td>
			<td >Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >50125590H</td>
			<td >Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate reader</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >EPOCH2</td>
			<td >A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gen5 microplate reader and imager software</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >GEN5</td>
			<td >Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05LREEFSA</td>
			<td >Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-681-15E</td>
			<td >Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144562G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144565G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 multichannel pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FBE1200300</td>
			<td >Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164001G</td>
			<td >Must be able to deliver 100-320 &#181;l; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Supplies</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15-ml conical tubes with caps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05-539-801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass scintillation vials</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >03-337-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12565501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid&#160;</td>
			<td >Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td>
			<td >EW-01728-81</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 ml glass beakers</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-539H</td>
			<td >Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 ml glass Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td>FB500250</td>
			<td >Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, adhesive, porous film&#160;</td>
			<td >VWR (www.vwr.com)</td>
			<td >60941-086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metal forceps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12-000-157</td>
			<td >Any metal forceps will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent reservoir</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >07-200-127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration units (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >09-761-52</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Squirt bottle (for ethanol)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-897-10</td>
			<td >Any laboratory squirt bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclavable storage bottles</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >06-414-1D</td>
			<td >Any autoclavable glass storage bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27F</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27C</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-3810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-8810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-9810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe tips for repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164150G</td>
			<td >Only required if a repeating pipettor is used.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile petri dishes</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FB0875712</td>
			<td >Any sterile petri dishes will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >S37440</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a)</td>
			<td >American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)</td>
			<td >MYA-151</td>
			<td >Recombinant yeast are also available upon request from the authors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#945;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#946;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemicals</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Difco agar</td>
			<td >BD (www.bd.com)</td>
			<td >214530</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >D0632</td>
			<td >CAUTION:&#160; Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.&#160; Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >N1127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >10884308001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>Y0626</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G8270</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Galactose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G5388</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine sulfate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >A9126</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uracil</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >U0750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leucine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Histidine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >H8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >17 &#946;-Estradiol&#160;</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MP Biomedicals&#160;</td>
			<td >E8875-250 mg&#160;&#160;&#160;&#160; 0219456401 - 1 mg</td>
			<td >CAUTION:&#160; Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.&#160; It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.&#160; Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.&#160; Estradiol is very toxic to aquatic life.&#160; Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.&#160; Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% ethanol</td>
			<td >Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td>
			<td >111000200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S9638</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate dibasic (anhydrous)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S0876</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >M8266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >P9333</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L5125</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium carbonate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S7795</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Excel spreadsheet software</td>
			<td >Microsoft&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Java software (required for Appendix 1 application)&#160;</td>
			<td >Oracle Corporation</td>
			<td ></td>
			<td >To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.&#160; LacZ results created by the application can be copied by pressing &#34;control (ctrl) + c&#34; on PC keyboards, or &#34;command + c&#34; on Mac keyboards.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JMP statistical software version 13.0.0</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td ></td>
			<td >Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.&#160; The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >R statistical computing and graphics software</td>
			<td >R Foundation</td>
			<td ></td>
			<td >Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.&#160; Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory

Gær østrogen skærm (ja) bruges til at påvise østrogene ligander i miljøprøver og er blevet bredt anvendt i undersøgelser af endokrine desintegratorer. Østrogene ligander omfatter både naturlige og menneskeskabte "miljømæssige østrogen" (EBS) findes i mange forbrugsvarer herunder produkter til personlig pleje (PCPs), plastik, pesticider og fødevarer. Ebs forstyrre hormon signalering i mennesker og andre dyr, potentielt reducere frugtbarhed og øget risiko for sygdom. Trods vigtigheden af EBS og andre hormonforstyrrende forstyrre kemikalier (EDC) for den offentlige sundhed, er hormonforstyrrelser ikke typisk inkluderet i undergraduate læseplaner. Denne mangel er dels på grund af en mangel på relevante laboratorieaktiviteter, der illustrerer principperne involveret samtidig også være tilgængeligt for studerende. Denne artikel præsenterer en optimeret Ja for kvantificering ligander i produkter til personlig pleje, der binder østrogen receptorer alpha (ERα) og/eller beta (ERβ). Metoden indeholder en af de to kolorimetriske substrater (ortho- nitrophenylfosfat-β-D-galactopyranoside (ONPG) eller chlorphenol rød-β-D-galactopyranoside (CPRG)) som er kløvet af β-galactosidase, en 6-dages nedkølet inkubation trin til lette brugen i undergraduate laboratorium kurser, en automatiseret program for LacZ beregninger og R kode for den tilknyttede 4-parameter logistic regressionsanalyse. Protokollen er udviklet til at tillade studerende at udvikle og gennemføre eksperimenter hvor de skærmen produkter af deres valg til østrogen efterligner. I processen lærer de om endokrine desintegratorer, cellekultur, receptor binding, enzymaktivitet, genteknologi, statistik og eksperimenterende design. Samtidig, de også øve grundlæggende og bredt anvendelige laboratorium færdigheder, såsom: beregning af koncentrationer; at lave løsninger; demonstrere steril teknik; seriel fortynding standarder; konstruere og interpolering standard kurver; identificering af variabler og kontrol; indsamle, organisere og analysere data; opbygge og fortolke grafer; og ved hjælp af fælles laboratorieudstyr såsom micropipettors og spektrofotometre. Således tilskynder gennemfører dette assay eleverne til at deltage i undersøgelse-baseret læring mens udforske nye problemstillinger på miljø og sundhed.

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory at JoVE.com

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Denne artikel præsenterer en optimeret gær østrogen skærmen for kvantificering ligander i personlig plejeprodukter (PCPs) der binder østrogen receptorer alpha (ERα) og/eller beta (ERβ). Metoden indeholder to kolorimetriske substrat muligheder, en seks-dages nedkølet inkubation til brug i undergraduate kurser og statistiske værktøjer til dataanalyse.

Påvisning af østrogene ligander i produkter til personlig pleje ved hjælp af en gær østrogen skærm optimeret for Undergraduate undervisning laboratorium

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Fundamentals

Scientific Inquiry

SCIENTISTS IN ACTION

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Imaging of Estrogen Receptor-ÃƒÅ½Ã‚Â± in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Billeddannelse af østrogen-receptor-α i Rat Pial arterioler ved hjælp af en digital Immunofluorescent mikroskop

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Regelmæssig pleje og vedligeholdelse af en zebrafisk (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorium: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimeret farvning og spredning modelleringsmetoder for celledeling Overvågning ved hjælp cellesporing Farvestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Omvendt Gær To hybrid system til at identificere Mammalian Nuclear receptor Rester at interagere med ligander og / eller-antagonister

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Funktionel Komplementeringsanalyse (FCA): A Laboratory Motion designet og implementeret til supplement af Undervisning i biokemiske veje

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap junktion intercellulær kommunikation: En funktionel biomarkør at vurdere negative virkninger af giftstoffer og toksiner, og Sundhedsmæssige fordele af Naturprodukter

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Måling af laktase enzymatisk aktivitet i undervisningen Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Brug mikrofluidenheder til måling Levetid og cellefænotyper i Single Spirende gærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...