Name: detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory at JoVE.com

Questo progetto è stato finanziato dalla accensione finanziamenti a TME e AMR da Louisiana Tech University e Furman University, rispettivamente. Finanziamenti supplementari è stato fornito da una sovvenzione di avanzamento 2015 facoltà di AMR e TME da The Associated collegi del sud, una sovvenzione Louisiana EPSCoR Pfund TME dal National Science Foundation e la Louisiana Board of Regents e un viaggio premio a TME dalla Università del sud. Ringraziamo il Dr. David Eubanks (Furman) per assistenza con analisi statistiche e Mr. Christopher Moore per "darci una mano" durante le riprese.

1. preparazione reagenti
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	<li>Preparare il supporto di glucosio e galattosio mescolando 6,7 g lievito azoto base, 20 g di destrosio o galattosio, solfato di adenina 20 mg (aggiunto come 10 mL di una soluzione acquosa stock di 200 mg/100 mL), uracile 20mg (aggiunto come 10 mL di una soluzione acquosa stock di 200 mg/100 mL) , leucina 60mg (aggiunto come 6 mL di una soluzione acquosa 1 g/100 mL) e 20 mg istidina (aggiunto come 2 mL di una soluzione acquosa 1 g/100 mL) in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 1 L. sterilizzare mediante filtrazione (filtro 0,2 µm). Media può essere memorizzato a 4 ° C per diverse settimane.</li>
	<li>Preparare estradiolo (E2) standard di dissoluzione in polvere E2 in etanolo anidro e diluire le concentrazioni di lavoro appropriato (227.5 nM &#38; 9.75 nM) in etanolo al 50%. Nota: Se l'estradiolo è acquistato come una fiala da 1 mg, aggiungere 1 mL di etanolo direttamente al flaconcino per sciogliere la polvere di estradiolo. Questo produce uno stock di 3,67 mM #1.  Diluire 10 μL di stock #1 in etanolo al 990 μL di rendere 1 mL di brodo μM 36,71 #2.  Quindi, diluire 10 μL di stock #2 in etanolo al 50% 990 μL di rendere 1 mL di brodo di 367.13 nM #3.  Per rendere il lavoro delle scorte, diluire stock μL 619.7 #3 in etanolo di 50% 380.3 μL di rendere 1 mL di 227.5 nM lavoro magazzino utilizzato per creare curve standard con lievito che esprimono ERα.  Diluire il magazzino μL 26.56 #3 in etanolo al 50% 973.44 μL per fare 1 mL di 9,75 nM lavoro magazzino utilizzato per creare curve standard con lievito esprimendo ERβ. Guarnizione standard con parafilm e conservare a -20 o -70 ° C. Attenzione: E2 è un sospetto cancerogeno e tossico riproduttiva. È nocivo se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle. E2 può provocare danni all'allattamento al seno i bambini e feti. E2 è molto tossico per la vita acquatica. Utilizzare protettivi appropriati (guanti, cappa aspirante, mascherina antipolvere) ed evitare l'esposizione durante la gravidanza e l'allattamento. Alienare E2 come rifiuti pericolosi e non rilasciano nell'ambiente.</li>
	<li>Preparare il tampone di LacZ mescolando 8,52 g Na2HPO4, 5,52 g NaH2PO4•H2O, mg 95,21 MgCl2, 745,5 mg KCl, sale di sodio di 2 g N-lauroylsarcosine e ONPG (400 mg) o CPRG (77,7 mg) in acqua deionizzata per un finale volume di 1 L. Store LacZ tampone in aliquote di mL 20 a-20 ° C. Nota: Un 20ml aliquota è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Preparare il carbonato di sodio mescolando 105,9 g di carbonato di sodio in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 1 L. negozio a TA.</li>
	<li>Preparare 1 M ditiotreitolo (DTT) in acqua. Congelare 25 aliquote µ l di DTT a-20 ° C. Attenzione: Il DTT è un'acuta della pelle e irritante per gli occhi. Utilizzare indumenti protettivi appropriati (guanti, cappa aspirante, mascherina antipolvere) per evitare la pelle e contatto con gli occhi, inalazione e ingestione. Nota: Ciascuna aliquota è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti.</li>
</ol>
2. preparazione di campioni e controlli di estrazione
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	<li>Prelevare campioni da testare. Nota: Questo articolo presenta i dati per quindici PCPs, tra cui sapone, crema per capelli, shampoo, crema solare, burrocacao, Fondazione, crema da barba, smalto e lozione.</li>
	<li>Unire 1 g del campione con 10 mL di etanolo anidro in una provetta conica da 15 mL. Preparare un controllo negativo estrazione costituito da 11 mL di etanolo in una provetta conica da 15 mL. Preparare replicati. Nota: Per il disegno sperimentale presentato, sono state preparate tre aliquote di tutti i 15 PCPs e soluzioni di controllo estrazione triplicate, producendo un totale di 48 campioni, ciascuno dei quali è stato analizzato in triplice copia utilizzando il protocollo nella sezione 4. Un piatto unico può ospitare fino a 23 campioni in triplici copie. Etanolo anidro è usato in questo passaggio perché evapora prontamente. Utilizzare i controlli negativi estrazione per verificare che gli estrogeni non sono lisciviazione in campioni da provette coniche.</li>
	<li>Da una combinazione di agitazione manuale e Vortex o agitando tubi su un vortex multi-provette, omogeneizzare tubo contenuto per 30 min.</li>
	<li>Centrifugare provette coniche alla massima velocità consentita in una centrifuga di secchio per 10 min. decantare il supernatante da ciascuna provetta attraverso un colino di cella di 40 µm in una provetta conica da 50 mL. Vuoto contenuto di ogni provetta da 50 mL in un flacone di vetro scintillazione.</li>
	<li>Fiale di lasciare aperto in un cappuccio ventilato per una settimana consentire etanolo farlo evaporare completamente. In alternativa, asciugare i campioni in un cappuccio ventilato sotto azoto o con un evaporatore rotante. Per evitare la degradazione dei costituenti sensibili luce, proteggere i campioni essiccazione dalla luce (ad esempio, il tessuto opaco posto sopra porta cappuccio ventilato).</li>
	<li>Ricostituire i campioni in 1,0 mL di etanolo al 50% e vortexare per omogeneizzare.</li>
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3. messa in coltura e subcoltura lievito14
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	<li>Mantenere le colture di lievito attivo (ceppo batterico di W303a di S. cerevisiae14) incubando lievito nei mezzi di glucosio filtro-sterilizzato a 30 ° C. Lievito di sottocultura settimanale media fresco glucosio filtro-sterilizzato.</li>
	<li>Due notti (circa 42 h) prima di preparare le piastre Sì, sottocultura lievito aggiungendo 0,1 mL di colture di lievito attivo a 10 mL di media filtro-sterilizzato glucosio utilizzando una tecnica sterile.  Incubare a 30 ° C per due notti.  Agitazione non è necessaria se lievito vengono coltivata come culture poco profonde in sterile 250 mL Erlenmeyer boccette. Nota: Lievito può essere conservato anche su piastre di agar refrigerati per diversi mesi. Per archiviazione a lungo termine (anni), unire culture O/N con glicerolo sterile 15-50%, vortice e congelare a-70 ° C. Per preparare il glicerolo sterile, è necessario utilizzare una siringa per trasferire 300 glicerolo µ l in un cryovial ed autoclave con il tappo svitato. Quindi aggiungere 1.200 coltura di lievito O/N µ l utilizzando una tecnica sterile.</li>
</ol>
4. preparazione sì piastre (giorno 1 del dosaggio)
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	<li>In un becher di sterile e utilizzando una tecnica sterile, diluire il lievito da passo 3.2 a una densità ottica di 0.065 ± 0.005 a 610 nm (OD610) in media filtro-sterilizzato galattosio.<ol>
		<li>Confermare la densità ottica di pipettaggio 120 µ l di ogni campione di lievito in triplice copia insieme con spazi vuoti galattosio triplicate in un piatto chiaro polistirolo (piastra non deve necessariamente essere sterile).  Utilizzare uno spettrofotometro di piastra per verificare che la coltura di lievito diluito ha un netto OD610 di 0,065 ± 0.005 sottrarre OD610 letture di spazi di galattosio da letture di610 OD lievito per determinare netto OD610 del lievito. Preparare un volume finale di almeno 30 lievito mL diluito per ogni piastra a 96 pozzetti. Nota: Spettrofotometro filtri misurare l'assorbanza tra 610 e 595 nm possono essere utilizzati per questa misura.</li></ol></li></ol>Un approssimativo rapporto 1:6 v: v: media del lievito in genere produce un OD610 vicino 0,065, quindi iniziare con l'aggiunta di lievito di 4,5 mL ai media di 30 mL e aggiungere più lievito o supporti appropriati ottenere un netOD610 tra 0.060 e 0.070.
	
	
	<li>Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere questa sospensione di lievito diluito ai pozzetti di una sterile, polipropilene, micropiastra a 96 pozzetti in base al layout della piastra (Figura 1). Durante il pipettaggio, mantenere la fonte lievito sospesa continuamente agitando il contenitore o la miscelazione con la pipetta. Per questo passaggio, è utile usare un pipettatore ripetuto con una punta di siringa sterile. Nota: Placche in polipropilene sono sterilizzati con due piastre impilate in autoclave, avvolti in carta stagnola.  La piastra superiore funge da un coperchio per piatto del campione e può essere lavato, re-autoclavato e riutilizzato.</li>
	<li>Aggiungere 120 µ l filtro-sterilizzato galattosio media a 3 ulteriori pozzi (H10 - 12) in base al layout della piastra (Figura 1). Questi pozzi servono come controlli multimediali per contabilizzare assorbanza contribuito dai media da solo.</li>
	<li>Costruire una curva standard in ogni piastra diluendo in modo seriale triplici copie di standard lavorativi E2 (227.5 nM per ERα, 9.75 nM per ERβ) in pozzetti contenenti la sospensione di lievito (A1 - G3) in base al layout della piastra (Figura 1).  Iniziare aggiungendo 5 µ l di standard di E2 pozzetti A1 e A3. Mescolare microtiter contenuto pipettando e poi diluire in serie questa sospensione spostando µ l 205 da pozzetti A1 - 3 nei pozzetti B1 - 3. Ripetere la miscelazione e il trasferimento di µ l 205 attraverso riga G. Nota: Una volta completata la diluizione seriale, scartare 205 μL da pozzi G1 - 3. Alla fine di questo passaggio, tutti i pozzetti standard dovrebbero contenere 120 μL. La diluizione seriale produrrà le concentrazioni finali di E2 elencate nella tabella 1. Per i passaggi di diluizione seriale, è utile usare un pipettatore multicanale con puntali sterili.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l del veicolo (50% di etanolo) nei pozzetti di controllo del veicolo contenente la sospensione di lievito (H1 - 3) in base al layout della piastra (Figura 1). Nota: I pozzetti di controllo del veicolo vengono utilizzati per quantificare dell'assorbanza di fondo connesso con i media e le cellule di lievito. Inoltre, citotossicità o crescita promuovendo effetti del test campioni possono essere rilevati confrontando i valori di610 OD di testare pozzetti con quelli dei pozzetti di controllo del veicolo.</li>
	<li>Aggiungere 5 triplici copie µ l dei campioni ed estrazione negativa dei pozzetti contenente la sospensione di lievito secondo il layout della piastra (Figura 1). Nota: Prendere nota dei quali campioni o estrazione negativa controlli vengono aggiunti a ciascun pozzetto.  Per tenere traccia di quali pozzi hanno campioni e che non lo fanno, iniziare con una scatola di fresca di suggerimenti e utilizzare punte dalle stesse posizioni nella casella le posizioni dei rispettivi pozzetti della piastra. Una piastra a 96 pozzetti può ospitare fino a 23 campioni in triplice copia.</li>
	<li>Mescolare il contenuto del campione, controllo di estrazione e pozzetti di controllo del veicolo di pipettaggio. Regolare i volumi di questi pozzi a 120 µ l rimuovendo µ l 205 da ciascuno come descritto nella legenda per Figura 1.</li>
	<li>Sigillare le piastre con un film sterile, adesiva, porosa. Etichettare le piastre e incubare per 17 ore a 30 ° C. La piastra non deve necessariamente essere agitato durante l'incubazione</li>

5. elaborazione sì piastre (giorno 2 del dosaggio)
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	<li>Dopo le 17 ore di incubazione a 30 ° C, è necessario rimuovere piastre dall'incubatrice. Se piastre saranno evasi immediatamente, passare al punto 5.1.1. Se piastre saranno trattati in un secondo momento, passare al punto 5.1.2.<ol>
		<li>Utilizzare un pipettatore multicanale per mescolare il contenuto di ogni fila di pozzetti e quindi trasferire 50 µ l di sospensione di lievito da ogni pozzetto per il corrispondente bene di una micropiastra chiara, polistirolo, 96 pozzetti. Nota: Lastre di polistirolo non è necessario essere sterile ma dovrebbero avere un coperchio. Utilizzare nuove punte di pipetta per ogni fila di pozzetti per evitare la cross-contaminazione pozzi, anche se pipettaggio attraverso triplici copie con una pipetta multicanale 8-punta, suggerimenti solo bisogno di essere cambiato tra insiemi triplicate.<ol>
			<li>Etichettare la nuova piastra. Procedere al punto 5.2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Per memorizzare le piastre prima dell'elaborazione, eseguirne il wrapping in involucro di plastica. Conservare in frigorifero avvolti piastre a 4 ° C per 6 d. in seguito, rimuovere le piastre dal frigorifero, scartare li e trasferire il contenuto di tutti i pozzetti pipettando come descritto al punto 5.1.1. Procedere al punto 5.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di 1 M DTT a 20 mL di tampone di LacZ scongelati, temperatura per una concentrazione finale di 1 millimetro DTT. Buffer di LacZ mix bene. Se utilizzando una pipetta multicanale, dispensare in un serbatoio di reagente. Attenzione: Indossare guanti e lavorare con DTT in una cappa, se possibile</li>
	<li>Usando sia una pipetta multicanale o ripetendo pipettatore, aggiungere 200 µ l di tampone di LacZ contenente DTT e ONPG o CPRG in tutti i pozzetti della piastra in polistirolo e immediatamente misurare e registrare il OD610 di tutti i pozzetti usando uno spettrofotometro di piastra. Ripetere per piastre aggiuntive. Nota: Le letture di610 OD sono utilizzate nel denominatore del calcolo LacZ (punto 6.1). Per questo motivo, ottenere le letture immediatamente dopo il pipettaggio e prima settle di cellule o vengono lisate dai buffer di LacZ. Se i valori di610 OD per pozzetti sono notevolmente superiori o inferiori ai valori di610 OD per pozzetti di controllo del veicolo, gli estratti di campione sono dipromozione o citotossici ai lieviti, rispettivamente. LacZ calcolo verrà corretto per piccole differenze nella densità delle cellule attraverso pozzi, ma se le differenze superino il 30% in entrambe le direzioni, quindi diluire il campione ricostituito (dal punto 2.6) in ulteriori 50% etanolo e verificare nuovamente il campione restituendo al punto 3.2 12.</li>
	<li>Coprire le piastre con un coperchio. Incubare piastre contenenti lievito quello espresso ERα14 a 30 ° C per 40 min (per ONPG) o 3 h (per CPRG). Incubare piastre contenenti lievito quello espresso ERβ14 a 30 ° C per 70 min (per ONPG) o 4 h (per CPRG). Nota: Quando si lavora con CPRG, tempi di incubazione sono flessibili; Incubare per 2-4 h produce risultati idonei con entrambi i recettori, con incubazioni più lunghe, aumentando la sensibilità del test.</li>
	<li>Dopo incubazione piastre, utilizzare una pipetta multicanale o ripetuta pipettatore per aggiungere 100 µ l di carbonato di sodio in ciascun pozzetto. Carbonato di sodio aumenta il pH e interrompe la reazione di β-galattosidasi.</li>
	<li>Misurare e registrare il OD405 (per ONPG) o OD574 (per CPRG) di tutti i pozzetti usando uno spettrofotometro di piastra.</li>
</ol>
6.Calcolo dei valori LacZ
Nota: I valori LacZ quantificare il grado di cambiamento di colore per ogni campione e offrono un metodo normalizzato di confrontare valori tra saggi separati di contabilità per diverse variabili (ad es., densità ottica lievito, densità ottica media e incubazione tempo se Questo differisce tra pozzi sulla stessa piastra)12.
<ol>
	<li>Calcolare mezzo di valori di610 OD triplici per pozzetti di controllo multimediale (galattosio) (H10-12) e calcolare mezzo di triplice copia OD405 o valori574 OD per comandi del veicolo (50% di etanolo) (H1-3). Utilizzare questi mezzi ed il tempo di incubazione (t) in ore per la piastra per cambiare colore (punto 5.5) per calcolare i valori di LacZ (corrispondente al grado di cambiamento di colore in ogni pozzetto) per tutti gli standard e campione pozzi utilizzando le seguenti equazioni: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq1.jpg"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq2.jpg">
	<ol>
		<li>In alternativa, utilizzare l'applicazione automatizzata nell'appendice 1 per calcolare valori di LacZ per standard e campioni. Nota: Il layout di piastra utilizzato con l'applicazione deve essere identico al layout del piatto presentato nella Figura 1. Se non sono stati utilizzati alcuni pozzetti, mantenere letture di assorbenza dei pozzi vuoti come segnaposto nel dataset assorbanza viene incollato nell'applicazione LacZ appendice 1 .  Ciò mantiene la disposizione spaziale della piastra nell'applicazione ed assicura che i pozzetti di controllo multimediale sono nella loro posizione richiesta.  Inoltre, l'applicazione non verrà eseguito se non ci sono celle vuote.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcolare mezzo di triplice copia LacZ valori per ogni standard di E2 e di ogni campione. Segnalare i valori medi di LacZ come µ l-1h-1. Registro-trasformazione delle concentrazioni di ciascun E2 standard e generare un documento di foglio di calcolo, formattato come file CSV (appendice 2).</li>
</ol>
7. campione estradiolo equivalenti (EEQs) utilizzando la regressione logistica 4 parametri di interpolazione
Nota: EEQs riguardano valori di esempio LacZ (cambiamento di colore) i valori di LacZ della curva standard creato con E2. EEQs così determinare quanto campione è necessaria per suscitare la stessa risposta di cambiamento di colore come una concentrazione nota di E2.
<ol>
	<li>Per calcolare EEQs per campioni di prova, prima di tracciare la curva standard. Misura i valori medi di LacZ per E2 standard (asse y) e il registro-trasformate E2 concentrazioni corrispondenti (asse x) per un modello di regressione logistica quattro-parametro.</li>
	<li>Utilizzare il modello per interpolare EEQs per i valori di test campione LacZ. Condurre i calcoli di regressione logistica di EEQs utilizzando il software statistico come descritto nell'appendice 2.</li>
</ol>
8. standardizzazione EEQs (ng/mL) alla massa del campione di PCP
<ol>
	<li>Di relazionarsi EEQs con la quantità di campione di PCP aggiunto a ciascun pozzetto nel passaggio 4.5, moltiplicare EEQ (ng/mL) per il volume totale placcato nei pozzetti (325 µ l) ed poi dividere per il volume di campione estratto aggiunto ad ogni pozzetto (5 µ l). Nota: Questi valori rappresentano EEQ per mL di campione estratto. Se i campioni sono stati preparati usando 1 g di PCP, questi valori rappresentano anche EEQ per grammo di PCP (ng/g). Espresso in questo modo, valori EEQ (ng/g) possono essere confrontati attraverso valori diversi PCPs. EEQ (ng/g) per i prodotti di cura personale testati in questo studio sono riportati nella tabella 2, e raccolti in tutta l'intero protocollo di dati di esempio sono inclusi in Appendice 3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+healthy+Mediterranean+diet:+estrogenic+activity+of+plants+used+as+food+and+flavoring+agents.">Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents.</a> Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).</li><li>Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+soybeans+(Glycine+max)+varies+by+plant+organ+and+developmental+stage.">Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage.</a> Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).</li><li>Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. 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A., Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+plasmids+expressing+human+steroid+hormone+receptors+and+a+reporter+gene+for+use+in+yeast+signaling+assays.">Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays.</a> Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).</li><li>Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaill&#232;s, V., Balaguer, P., Bourguet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+profiling+of+environmental+ligands+for+estrogen+receptors.">Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors.</a> Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).</li><li>Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+beta-galactosidase+tissue+levels+in+a+tumor+cell+xenograft+model.">Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model.</a> Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).</li><li>Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+beta-galactosidase+activity+in+tissue+in+the+presence+of+blood.">Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood.</a> J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).</li><li>Gray, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+alcohol+tolerance+of+yeasts.">Studies on the alcohol tolerance of yeasts.</a> J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).</li><li>Schug, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+endocrine+disruption+out+of+the+next+generation+of+chemicals.">Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals.</a> Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo sì è un metodo a basso costo utilizzato per rilevare estrogenici ligandi in campioni ambientali, quali acqua, cibo, tessuti vegetali o prodotti di cura personale. I dati presentati qui confrontare 2 recettori per gli estrogeni (ERα ed ERβ), 2 substrati (ONPG e CPRG) e 2 linee temporali (protocollo 2 d senza refrigerazione) e protocollo di sette giorni con refrigerazione per misurare estrogenicità nei prodotti di cura personale via l'analisi Sì. La 7D, refrigerato protocollo utilizzando CPRG e lievito che esprimono ERα e/o ERβ meglio quantifica EEQs mentre anche essendo compatibile con i vincoli di tempo imposto da corsi di laboratorio dello studente non laureato che si incontrano solo una volta / settimana per diverse ore. Infatti, rispetto al dosaggio 2 d senza refrigerazione, il dosaggio di refrigerati di sette giorni è stato associato con varianza ridotta attraverso piastra replicati. Inoltre, la parte lineare della curva standard è stato leggermente ampliata per i dati raccolti mediante il saggio refrigerato. La parte lineare della curva standard definisce la gamma di rilevazione di analisi ed è l'unica parte della curva standard che può essere utilizzata per interpolare campione EEQs.
In tutti, ma uno dei campioni testati, EEQs misurato utilizzando CPRG erano inferiori rispetto a quelli quantificati con ONPG. Con un più elevato coefficiente di estinzione e inferiore Km e Vmax, CPRG è dieci volte più sensibile di ONPG17. Così, CPRG possono essere usate alle concentrazioni più basse e può essere utilizzato per rilevare gli importi più bassi di β-galattosidasi. Per questi motivi, è in genere preferibile CPRG ONPG18,19. Tuttavia, una maggiore sensibilità di substrato non spiega i valori inferiori di EEQ rilevato con CPRG. I valori più elevati di EEQ rilevati con ONPG potrebbero essere a causa dell'interferenza di matrice con il dosaggio, come osservato da altri autori2,18. Pigmenti gialli da estratti di prodotto di cura personale potrebbero gonfiare i valori EEQ rilevati con ONPG. Altri hanno aggirato questo problema includendo i controlli del pigmento nel loro disegno sperimentale2, un approccio che raddoppia il numero di piastre in un esperimento. Quando interferenze di matrice possono essere problematica, CPRG potrebbe essere un substrato preferibile per il dosaggio di sì, anche se è più costoso e richiede tempi di incubazione più lunghi rispetto a ONPG. Inoltre, il cambiamento di colore indotto tramite la fenditura del substrato di β-galattosidasi è più drammatico con CPRG, rendendo più facile per gli studenti a visualizzare i risultati.
Miller et al. (2010), chi ingegnerizzato il lievito utilizzato nel presente protocollo, notato che il lievito esprimendo ERβ erano più sensibili al 17 β-estradiolo che lievito che esprimono ERα, un'individuazione suffragata da nostri dati14x 30. Oltre a potenziali sfumature nella costruzione del plasmide, Miller et al. (2010) non poteva spiegare questa differenza di sensibilità14. Una differenza tra i due costrutti di plasmide è che ERα espressione è regolata da galattosio, mentre ERβ espressione è regolata da glucosio o galattosio. Il lievito usato per il test di sì sono coltivate in media del glucosio e solo dato galattosio quando essi sono diluiti all'inizio del test. Di conseguenza, lievito esprimendo ERβ potrebbe accumulare più alti numeri di copia di proteine recettoriali prima dell'inizio del test, quindi che conferisce maggiore sensibilità ai leganti estrogenici.
La minore sensibilità di lievito che esprimono ERα può spiegare i tassi più elevati di mancato rilevamento di estrogenicità nei campioni misurati con ERα confrontato con ERβ. Per aumentare le probabilità che EEQs il campione verrà rilevato, gli utenti potrebbero impiegare metodi e solventi di estrazione differenti o aggiungere maggiori volumi di campione al lievito. Se vengono utilizzati più elevati volumi di campione, le concentrazioni di E2 standard devono essere regolate tale che lo stesso volume di standard e di campioni può essere utilizzato nell'analisi. Una limitazione di aggiunta più campione è che il lievito può tollerare solo 6-10% di etanolo, con migliore tolleranza alle temperature di incubazione di 30 vs 35 ° C20. Per controllare per gli effetti di etanolo sui lieviti, gli investigatori dovrebbero aggiungere triplice copia "lievito solo" pozzi al layout della piastra e confermare che il OD610 di questi pozzi "lievito solo" è paragonabile alla OD610 di pozzetti di controllo del veicolo immediatamente dopo l'aggiunta del LacZ buffer. In alternativa, possono essere aggiunti campioni disciolti in etanolo a piastre microtiter asciutto e l'etanolo evaporato fuori prima di lievito vengono aggiunti. Dimetilsulfossido (DMSO) è anche usato come un solvente di campione in sì saggi, ma la concentrazione finale del lavoro di DMSO con lievito dovrebbe essere limitata a 1%12.
Il dosaggio di sì è uno strumento di screening potente per la rilevazione estrogenicità in campioni ambientali. In particolare, lo sì rileva ligandi che legano i recettori per gli estrogeni nucleari che interagiscono con gli elementi di risposta dell'estrogeno per dirigere gene espressione14. Tuttavia, lo sì ha anche alcune importanti limitazioni. Lo sì non rileva EEs che funzionano attraverso meccanismi non-nucleari come recettori di membrana estrogeno o meccanismi che coinvolgono elementi aggiuntivi come fattori di trascrizione di attivatore della proteina 1 (AP-1). Inoltre, perché il lievito non hanno la stessa capacità metabolica come cellule di mammifero, lo sì non riesce a rilevare ligandi che richiedono l'attivazione metabolica di essere estrogenici.
Inoltre, il dosaggio di sì prontamente non può distinguere tra estrogeni e anti-estrogenici ligandi in campioni complessi. Invece, misura estrogenicità netto , che è l'effetto della somma dei ligandi estrogeniche e anti-estrogenici. Per quantificare la concentrazione di antagonisti ER o valutare l'attività inibitoria di miscele, il dosaggio può essere modificato incubando il lievito con l'agonista standard (17 β-estradiolo) e una gamma di concentrazioni di prova campione12. Questo processo determina se antagonisti nei campioni possono diminuire l'attività del reporter indotta da agonista e fornisce uno schermo utile per identificare la presenza di antagonisti di ER in campioni.
Il protocollo qui presentato può ospitare una varietà di tipi di campione, anche se alcuni campioni potrebbero richiedere modifiche per la procedura di preparazione di estrazione e campione. Ad esempio, EEQs varia ampiamente tra replica di alcuni prodotti di cura personale. I campioni più variabili tendevano a contenere le goccioline di olio o altrimenti non erano completamente omogenei, che indica che un solvente più lipofilico come etere dietilico sarebbe utile. In alternativa, oli e cera in prodotti di cura personale potrebbe escludersi estraendo campioni con etanolo al 50% invece di etanolo al 100%.Un'estrazione di etanolo 50% anche catturare altri ligandi estrogenici solubile in acqua (ad es., alcuni pigmenti). Tuttavia, l'etanolo 50% evapora più lentamente di etanolo al 100% e così può estendere il tempo di estrazione. Inoltre, alcuni campioni (ad esempio saponi) erano citotossici ai lieviti, conseguente misure di densità riduttrice delle cellule (OD610). Volpe et al. (2008) suggeriscono che tali campioni devono essere diluiti e ritestati se differenze di densità delle cellule superino il 30% rispetto al veicolo controllo pozzi12.
Se l'analisi Sì è usata per scopi di ricerca analitica, curve di diluizione delle piscine di campione possono essere testate per determinare preventivamente volumi appropriati di Estratto da aggiungere al lievito al punto 4.5. In alternativa, gli estratti possono essere testati contemporaneamente a più volumi (per esempio, 5 µ l e 20 µ l di Estratto aggiunto al lievito nel passaggio 4.5) o diluizioni che si estendono su ordini di grandezza (ad es., 0,2 µ l, 2 µ l e 20 µ l). "Appropriati" volumi dell'estratto sono quelli che identificano estrogenicità abbinando LacZ valori lungo la parte lineare della curva standard. Ottimizzazione previene i problemi causati dall'aggiunta di campione troppo o troppo poco al lievito, quali citotossicità, falsi negativi o estrogenicità che supera la curva standard. Come accennato in precedenza, i volumi di campioni ed E2 standard devono essere regolati quando diverse quantità di legante vengono utilizzati tali che lievito sono esposti a un volume costante e la concentrazione di etanolo o altro veicolo su tutta la piastra.
Nonostante il potenziale di falsi negativi, il dosaggio di sì è stato identificato come uno strumento di test di livello 3 per gli interferenti endocrini di Schug et al. (2013), che ha sviluppato un protocollo completo di Tiered per endocrino (TiPED)21. Per la formazione universitaria, il dosaggio è prezioso per l'insegnamento di concetti relazionati alla endocrino, coltura cellulare, grippaggio del ricevitore, l'attività dell'enzima, ingegneria genetica, statistiche e disegno sperimentale. Gli studenti che usano l'analisi praticano anche competenze di laboratorio fondamentali e largamente applicabile ad esempio diluendo in modo seriale standard; estrazione di campioni; rendendo le soluzioni; costruzione e interpolando curve standard; calcolo delle concentrazioni; rendendo le soluzioni; dimostrazione tecnica sterile; coltura delle cellule; identificazione di variabili e controlli; raccolta, organizzazione e analisi dei dati; costruire e interpretare grafici; e utilizzando attrezzature di laboratorio comuni quali micropipettors e spettrofotometri.

Il lievito dell'estrogeno Screen (Sì) viene ampiamente utilizzato per quantificare ligandi che imitano l'estradiolo (E2 o 17 β-estradiolo) in una varietà di matrici, tra cui acqua, tessuti vegetali, prodotti di consumo e alimenti1,2,3, 4. Collettivamente, tali ligandi sono chiamati "Estrogeni ambientali (EEs)." Lo sì è stato originariamente sviluppato come un basso costo, in vitro alternativa alle prove di in vivo come il roditore uterotrofico dosaggio5,6 e la trota iridea alimentazione dosaggio7. Lo scopo di queste prove è quello di determinare se un prodotto contiene sostanze chimiche che stimolano o bloccano meccanismi estrogeno-dipendenti. Rilevamento della SEO è fondamentale, perché possono interferire con la segnalazione, particolarmente durante lo sviluppo fetale normale dell'estrogeno endogeno. Questa interferenza compromette la salute aumentando il rischio di obesità, sterilità, cancro e perdita conoscitiva8.
Nonostante l'importanza della SEO e altri EDCs per la salute pubblica, endocrino non è comunemente incluso nei programmi di studio dello studente non laureato. Questa carenza è parzialmente a causa di una carenza di attività che illustrano i principi coinvolti mentre anche essere accessibile a studenti universitari. Inoltre, esistono numerose varianti del protocollo Sì9,10,11,12,13, e questa diversità rende saggio ottimizzazione richiede molto tempo per coordinatori di laboratorio non specificamente addestrati nelle tecniche pertinenti. Infine, sì analisi vengono completate solitamente lunga oltre 1 giorno o 2 giorni consecutivi con un'incubazione di O/N. Questa tempistica non è compatibile con il formato dei corsi di laboratorio dello studente non laureato, che in genere si incontrano una volta / settimana per diverse ore.
In risposta a queste esigenze, questo manoscritto segnala un protocollo ottimizzato di sì 96 pozzetti che include metodi di estrazione etanolica per Personal Care Products (PCPs)3 e un passo di refrigerazione di 6 giorni per ospitare riunioni settimanali di laboratorio. Etanolo assoluto è un solvente organico versatile che può sciogliere una varietà di soluti polari e non polari. Inoltre, è indicato per i corsi di laurea perché è prontamente disponibile, relativamente non tossico, a prezzi accessibili e miscibile con l'acqua; evapora facilmente anche senza attrezzature speciali. Tuttavia, l'etanolo non è ideale per l'estrazione fortemente idrofobici interferenti endocrini o molti oli e cere, gli ultimi due ingredienti comuni in PCPs. efficienza di estrazione povera aumenta il rischio di risultati falsi negativi. Con questo vincolo in mente, gli investigatori dovrebbero scegliere le procedure di estrazione (ad es., estrazione etanolica o estrazione in fase solida) che le caratteristiche del campione di indirizzo e soddisfare obiettivi di studio (ricerca contro istruzione dello studente non laureato).
Lo sì si basa su ricombinante Saccharomyces cerevisiae originariamente creato da Dr. Charles Miller all'Università di Tulane. Si prega di vedere Miller et al. (2010) per una mappa completa del plasmide derivati dal14. Lievito trasformato con questi plasmidi costitutivamente espresso umano ERα nucleare o ERβ (anche chiamato ESR1 ed ESR2, rispettivamente) quando coltivate in media che contengono galattosio (per ERα) o glucosio o galattosio (per ERβ). Se estrogenici prodotti chimici sono presenti nei media, si legano ai recettori, creazione di complessi ligando-recettore che attivare l'espressione di β-galattosidasi (lacZ) ad un livello proporzionale alla concentrazione di sostanze chimiche estrogenici. Cellule di lievito vengono poi lisate per rilasciare la β-galattosidasi accumulata. Il buffer di lisi contiene ONPG o CPRG, che sono scisso dalla β-galattosidasi per produrre prodotti di gialli o rossi, rispettivamente. Colorimetrici prodotti possono essere quantificati misurando l'assorbanza usando uno spettrofotometro di piastra microtiter. Il grado di cambiamento di colore è proporzionale alla concentrazione di ligandi estrogeniche a cui era esposto il lievito.
La scelta del substrato (CPRG o ONPG) dipende dal potenziale dell'assorbanza di fondo derivanti dai campioni in fase di test. Ad esempio, estratti di piante spesso aggiungerà una tonalità gialla ai media che gonfia artificialmente misure estrogenicità se ONPG (quantificato a 405 nm) è usato come substrato per la β-galattosidasi. Con estratti della pianta, CPRG (quantificato a 574 nm) può essere un substrato colorimetrico più appropriato. CPRG è più costoso di ONPG ma è usato a un decimo la molarità. Questo articolo presenta estrogenicities di PCP estratti quantificati utilizzando sia ONPG e CPRG.
Quantificare la estrogenicità di campioni ambientali utilizzando sia ERα ed ERβ è un approccio più globale rispetto all'utilizzo di uno solo di questi recettori. Negli animali, questi recettori espositivo distribuzione tissutale differenziale, attività di carattere normativo e affinità di legame per ligandi estrogenica e anti-estrogenici15. Ad esempio, i fitoestrogeni vegetali in genere associare ERβ più fortemente2, considerando che prodotti chimici sintetici possono mostrare preferenza per ERα o ERβ o possono essere associati sia recettori ugualmente ben15. Di conseguenza, un estrogeno recettore non necessariamente prevedere associazione a altra.
Sebbene SEO si trovata in molti prodotti di consumo (ad es., pesticidi, detergenti, adesivi, lubrificanti, materie plastiche, alimenti e prodotti farmaceutici) così come le piante, i dati presentati sono stati ottenuti utilizzando una selezione di PCPs. PCPs sono convincenti, prontamente disponibile, buon rapporto qualità-prezzo e ambientali rilevanti per gli studenti universitari. Gli studenti possono essere invitati a portare loro PCPs preferita da casa per testare in laboratorio. Possono anche cercare il database Skin Deep, sviluppato Environmental Working Group16 per generare confronti basati su ipotesi di PCPs con alta e bassi punteggi di tossicità. In questo modo, gli studenti possono sviluppare contemporaneamente competenze di laboratorio avanzato; impegnarsi nell'apprendimento auto-diretto, basata sull'indagine; ed esplorare questioni emergenti in scienze ambientali e la salute.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex Mixer (for single or multiple tubes)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-215-365</td>
			<td >Any mixer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bucket centrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >75-063-839</td>
			<td >Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bunsen burner</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >17-012-823</td>
			<td >Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >50125590H</td>
			<td >Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate reader</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >EPOCH2</td>
			<td >A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gen5 microplate reader and imager software</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >GEN5</td>
			<td >Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05LREEFSA</td>
			<td >Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-681-15E</td>
			<td >Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144562G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144565G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 multichannel pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FBE1200300</td>
			<td >Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164001G</td>
			<td >Must be able to deliver 100-320 &#181;l; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Supplies</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15-ml conical tubes with caps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05-539-801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass scintillation vials</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >03-337-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12565501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid&#160;</td>
			<td >Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td>
			<td >EW-01728-81</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 ml glass beakers</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-539H</td>
			<td >Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 ml glass Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td>FB500250</td>
			<td >Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, adhesive, porous film&#160;</td>
			<td >VWR (www.vwr.com)</td>
			<td >60941-086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metal forceps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12-000-157</td>
			<td >Any metal forceps will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent reservoir</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >07-200-127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration units (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >09-761-52</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Squirt bottle (for ethanol)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-897-10</td>
			<td >Any laboratory squirt bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclavable storage bottles</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >06-414-1D</td>
			<td >Any autoclavable glass storage bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27F</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27C</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-3810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-8810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-9810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe tips for repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164150G</td>
			<td >Only required if a repeating pipettor is used.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile petri dishes</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FB0875712</td>
			<td >Any sterile petri dishes will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >S37440</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a)</td>
			<td >American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)</td>
			<td >MYA-151</td>
			<td >Recombinant yeast are also available upon request from the authors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#945;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#946;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemicals</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Difco agar</td>
			<td >BD (www.bd.com)</td>
			<td >214530</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >D0632</td>
			<td >CAUTION:&#160; Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.&#160; Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >N1127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >10884308001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>Y0626</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G8270</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Galactose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G5388</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine sulfate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >A9126</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uracil</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >U0750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leucine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Histidine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >H8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >17 &#946;-Estradiol&#160;</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MP Biomedicals&#160;</td>
			<td >E8875-250 mg&#160;&#160;&#160;&#160; 0219456401 - 1 mg</td>
			<td >CAUTION:&#160; Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.&#160; It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.&#160; Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.&#160; Estradiol is very toxic to aquatic life.&#160; Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.&#160; Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% ethanol</td>
			<td >Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td>
			<td >111000200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S9638</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate dibasic (anhydrous)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S0876</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >M8266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >P9333</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L5125</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium carbonate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S7795</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Excel spreadsheet software</td>
			<td >Microsoft&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Java software (required for Appendix 1 application)&#160;</td>
			<td >Oracle Corporation</td>
			<td ></td>
			<td >To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.&#160; LacZ results created by the application can be copied by pressing &#34;control (ctrl) + c&#34; on PC keyboards, or &#34;command + c&#34; on Mac keyboards.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JMP statistical software version 13.0.0</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td ></td>
			<td >Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.&#160; The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >R statistical computing and graphics software</td>
			<td >R Foundation</td>
			<td ></td>
			<td >Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.&#160; Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory

Il lievito dell'estrogeno Screen (Sì) viene utilizzato per rilevare estrogenici ligandi in campioni ambientali ed è stato ampiamente applicato negli studi dell'endocrino. Ligandi estrogenici comprendono sia naturali che artificiali "estrogeni ambientali" (EEs) trovato in molti beni di consumo, tra cui Personal Care Products (PCPs), plastica, pesticidi e alimenti. EEs perturbare ormone segnalazione negli esseri umani e altri animali, potenzialmente riducendo fertilità e aumentando il rischio di malattia. Nonostante l'importanza della SEO e altri Endocrine interrompere Chemicals (EDCs) per la salute pubblica, endocrino non è in genere incluso nei programmi di studio dello studente non laureato. Questa lacuna è in parte a causa di una mancanza di attività di laboratorio pertinenti che illustrano i principi coinvolti mentre anche essere accessibile a studenti universitari. Questo articolo presenta un ottimizzato Sì per quantificare ligandi in prodotti di cura personale che legano l'alfa recettori dell'estrogeno (ERα) e/o beta (ERβ). Il metodo incorpora uno dei due substrati colorimetrici (ortho- nitrofenil-β-D-galattopiranoside (ONPG) o clorofenoli rosso-β-D-galattopiranoside (CPRG)) che sono scisso dalla β-galattosidasi, un'incubazione refrigerata 6 giorni passo per facilitare l'uso nei corsi di laboratorio dello studente non laureato, un programma automatico per calcoli LacZ e codice R per l'analisi di regressione logistica di associato 4 parametri. Il protocollo è stato progettato per consentire agli studenti universitari di sviluppare e condurre esperimenti in cui hanno schermo i prodotti di loro scelta per estrogeno imita. Nel processo, imparano circa endocrino, coltura cellulare, grippaggio del ricevitore, l'attività dell'enzima, ingegneria genetica, statistiche e disegno sperimentale. Contemporaneamente, si esercitano anche competenze di laboratorio fondamentali e ampiamente applicabili, come: calcolo delle concentrazioni; rendendo le soluzioni; dimostrazione tecnica sterile; diluizione in serie standard; costruzione e interpolando curve standard; identificazione di variabili e controlli; raccolta, organizzazione e analisi dei dati; costruire e interpretare grafici; e utilizzando attrezzature di laboratorio comuni quali micropipettors e spettrofotometri. Così, questo saggio di esecuzione incoraggia gli studenti a impegnarsi nell'apprendimento basato sulla ricerca esplorando questioni emergenti in scienze ambientali e la salute.

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Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Questo articolo presenta una schermata di estrogeno ottimizzato lievito per quantificare ligandi in prodotti di cura personale (PCPs) che legano l'alfa recettori dell'estrogeno (ERα) e/o beta (ERβ). Il metodo incorpora due opzioni di substrato colorimetrico, una sei giorni incubazione refrigerata per uso nei corsi di laurea e gli strumenti statistici per l'analisi dei dati.

Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

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