Name: detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory at JoVE.com

このプロジェクト立ち上げルイジアナ工科大学、ファーマン大学からそれぞれ TME と AMR に資金によって資金を供給されました。AMR と南から TME に特典旅行とルイジアナ州評議委員会、全米科学財団から TME にルイジアナ州 EPSCoR Pfund グラントの関連付けられている大学から TME 2015 学部発展助成金によって提供された追加資金、南の大学。「私たちに手を与えること"を統計的分析とクリストファー ・ ムーア氏支援のため博士デビッド Eubanks (ファー) を撮影中に感謝いたしますと。

<ol>
	<li>Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+healthy+Mediterranean+diet:+estrogenic+activity+of+plants+used+as+food+and+flavoring+agents.">Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents.</a> Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).</li><li>Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+soybeans+(Glycine+max)+varies+by+plant+organ+and+developmental+stage.">Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage.</a> Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).</li><li>Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+and+anti-estrogenic+activity+of+off-the-shelf+hair+and+skin+care+products.">Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products.</a> J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).</li><li>Wagner, M., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors+in+bottled+mineral+water:+estrogenic+activity+in+the+E-Screen.">Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).</li><li>Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J., McLachlan, J. 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A., Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+plasmids+expressing+human+steroid+hormone+receptors+and+a+reporter+gene+for+use+in+yeast+signaling+assays.">Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays.</a> Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).</li><li>Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaill&#232;s, V., Balaguer, P., Bourguet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+profiling+of+environmental+ligands+for+estrogen+receptors.">Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors.</a> Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).</li><li>Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. 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著者が明らかに何もありません。

はい、水、食品、植物組織、パーソナルケア製品などの環境試料中エストロゲンのリガンドを検出するために使用する低コストの方法です。データ比較 2 のエストロゲンの受容器 (ERα と ERβ)、2 基板 (ONPG および CPRG)、(冷凍せず 2 d プロトコル) と 7 日間プロトコル 2 のタイムラインで紹介冷凍はいアッセイを介してパーソナルケア製品でエストロゲンを測定するため。7 d CPRG および ERα および/または ERβ を最も表現する酵母を使用して冷蔵プロトコルを定量化 EEQs も時間の制約と互換性があるが一度だけ会う学部実験室のコースによって課される間/週いくつかの時間。実際には、冷凍せず 2 d 分析と比較して、7 日間冷蔵アッセイと関連付けられた差異を低減プレート複製間で。さらに、標準曲線の直線部分は、冷蔵の試金を使用して収集されたデータに少し増築。標準曲線の直線部分はアッセイの検出範囲を定義、サンプル EEQs を補間するために使用できる標準的なカーブの部分だけです。
すべてがテストされたサンプルの 1 つで EEQs CPRG を使用して測定された ONPG を定量化したものよりも低かった。高い吸光係数と低 Kmと V最大CPRG は ONPG17よりも 10 倍以上敏感。したがって、CPRG は低濃度で使用することができます、β-ガラクトシダーゼの低い量を検出する使用ことができます。これらの理由から、CPRG は ONPG18,19より一般的に優先されます。ただし、大きい基板感度は低い EEQ 値検出 CPRG を説明しません。その他著者2,18によって書きとめられるように、アッセイのマトリックス干渉のため ONPG で検出された高い EEQ 値可能性があります。パーソナルケア製品の抽出物からの黄色い色素は、ONPG で検出 EEQ 値をふくらませることができました。この問題を回避他の人にがの実験的なデザイン2, 実験で皿の数を 2 倍にするアプローチで顔料を含みます。マトリックス干渉は問題が発生する可能性があります、それはより高価な ONPG より長い培養時間を必要とするが、CPRG ははい試金のための望ましい基板をあります。さらに、β-ガラクトシダーゼによって基板の胸の谷間による色変化は CPRG、やすく結果を視覚化する学生のためのより劇的です。
ミラーら(2010), 誰がこのプロトコルで使われる酵母を設計、その酵母 ERβ 30 x を ERα、私たちのデータ14によって実証されて見つけることを表現する酵母より 17 β-エストラジ オールに敏感だったと指摘しました。プラスミド構築、ミラーらの潜在的なニュアンスとは別(2010 年) はこの感度14の違いを説明できなかった。1 つ 2 つのプラスミドの構造の違いは、ERβ 式はグルコースやガラクトースのいずれかで調整されるに対し、ERα 式がガラクトース、によって調節されていることです。はい試金で使用される酵母はグルコース メディアで培養、彼らは、アッセイの開始時に希釈されたときのみガラクトースを与えられました。したがって、酵母 ERβ を表現するがそれによってエストロゲンのリガンド感受性を授与、アッセイの開始前に受容体タンパク質の高いコピー数を蓄積しました。
ERα 発現酵母の低感度は、ERα ERβ と比較して測定試料中エストロゲンの非検出率を説明するかもしれない。可能性を高めるため、このサンプル EEQs、検出ユーザー可能性があります別の抽出溶剤とメソッドを採用してまたは酵母にサンプルの高いボリュームを追加します。高いサンプル ボリュームを使用すると、標準およびサンプルの同じボリュームことができますアッセイに使用するように E2 の基準の濃度が調整必要があります。追加のより多くのサンプルの 1 つの制限は、酵母が培養温度 30対35 ° C の20で良い耐性を持つ 6-10% エタノールだけを容認することです。酵母のエタノールの効果を制御するため捜査は帳票「酵母のみ」井戸をプレート レイアウトに追加してこれらの「酵母のみ」井戸の外径610がすぐに車両制御井戸の外径610に匹敵することを確認ください。LacZ バッファーの追加。また、エタノールに溶解した試料は、乾燥マイクロウェル プレートと酵母を追加する前に沸騰エタノールに追加できます。また、ジメチルスルホキシド (DMSO) を使用すると、はいサンプル溶剤が試金が、酵母と DMSO の最終作業の濃度は 112に限定されるべき。
はいアッセイは、環境試料中エストロゲンを検出するための強力なスクリーニング ツールです。具体的には、[はい] は、遺伝子式14を直接にエストロゲン応答の要素と相互作用する核のエストロゲン受容体に結合するリガンドを検出します。しかし、はい、重要な制限事項があります。はい膜エストロゲン受容体などの非原子力機構や活性剤蛋白質 1 (AP-1) 転写因子などの追加要素を含むメカニズムを通じて働く EEs を検出しません。また、酵母は、哺乳類のセルとして同じ代謝能力を持っていない、ためはいはエストロゲンに代謝活性化を必要とするリガンドを検出できません。
さらに、はいアッセイは、複雑な試料中エストロゲン配位子間容易に区別できません。代わりに、エストロゲン、抗エストロゲンの配位子の合計効果である純エストロゲンを測定します。ER 拮抗薬の濃度を定量化する混合物の阻害活性の評価するには、標準のアゴニスト (17 β-エストラジ オール) とテスト サンプル濃度12各種酵母を培養してアッセイを変更できます。このプロセスはどう拮抗薬のサンプルでは、アゴニストによるレポーターの活動を減らすことができます、サンプルの ER 拮抗薬の存在を識別するため有用なスクリーンを提供しています。
ここで提示されたプロトコルは、いくつかのサンプルの抽出およびサンプル準備の手順に変更が必要なものの、サンプル各種を収容できます。たとえば、一部のパーソナルケア製品の EEQs の間では様々 をレプリケートします。可変サンプル油滴を含むがちか完全に均一なより脂溶性溶媒ジエチル エーテルなどが参考になることを示すなかったそれ以外の場合。また、オイルとパーソナルケア製品のワックスは、50% エタノール 100% エタノールの代わりにサンプルを抽出することにより除外できます。50% エタノール抽出はまたより多くの水溶性エストロゲン リガンド (例えば、いくつかの顔料) をキャプチャします。しかし、50% エタノール 100% エタノールよりもゆっくりと蒸発、抽出時間を延ばすことができます。さらに、(石鹸) などのいくつかのサンプルが減らされた細胞密度測定 (外径610) の結果、酵母細胞傷害性。フォックスらこのようなサンプルが希釈し、再テストするセル密度の違いは車両制御井戸12と比較して 30% を超える場合、(2008 年) をお勧めします。
はい試金分析研究目的のため使用する場合は、先手を打って 4.5 の手順で酵母に追加する抽出物の適切なボリュームを決定するサンプル プールの稀釈曲線をテストできます。また、抽出が同時に複数ボリューム (例えば、5 μ L と 4.5 の手順で酵母に追加 20 μ L 抽出) でテストことができますまたは桁 (例えば、0.2 μ L、2 μ L、20 μ L) をまたがる希薄。エキスの「適切な」のボリュームは、標準曲線の線形部分に沿って LacZ 値を照合することによってエストロゲンを識別するものです。最適化は、酵母、細胞毒性、偽陰性は、標準曲線を超えるエストロゲンなどにあまりまたはほんのわずかのサンプルを追加することによって引き起こされる問題を防ぐことができます。前述のようは、酵母がプレート間で一貫性のあるボリュームとエタノールやその他の車両の濃度にさらされているような配位子の量が異なるを使用する場合サンプルおよび E2 標準のボリュームを調整する必要があります。
偽陰性の可能性、にもかかわらずはいアッセイで識別されている層 3 テスト ツールとして内分泌かく乱物質の Schugら(2013) 内分泌かく乱作用 (TiPED)21のための包括的な階層型プロトコルを開発しました。アッセイは、学部教育は、内分泌かく乱、細胞培養、受容体結合、酵素活性、遺伝子工学、統計、および実験の設計に関連する概念を教えるための貴重です。アッセイを使用する学生はまた連続希釈基準など基本的かつ広範に適用される研究室スキルを練習します。抽出サンプルです。ソリューション;構築し、標準曲線の補間計算濃度;ソリューション;生殖不能の技術を実証培養細胞;変数とコントロールを識別します。収集、整理、およびデータの分析構築して、グラフの解釈micropipettors、分光光度計など一般的な実験装置を使用して。

行列、水、植物組織、消費者製品、食品1,2,3などの様々 なエストラジ オール (E2 または 17 β-エストラジ オール) を模倣する配位子の定量に広く用いられて酵母エストロゲン画面 (はい) 4。総称して、このような配位子を「環境エストロゲン (EEs)」と呼ばれている[はい] は、元々 低コスト、体外体内テスト方法のような齧歯動物のピアレビュー アッセイ5,6と餌アッセイ7レインボー ・ トラウトとして開発されました。これらのテストの目的は、製品に刺激したり、エストロゲン依存性のメカニズムをブロックする化学物質が含まれているかどうかです。EEs の検出は、彼らすることができます通常の内因性エストロゲンが胎児の発育、特に中に、信号を妨害するために重要です。この干渉には、肥満、不妊、癌、および認知喪失8の危険性を増やすことによって健康が損なわれます。
EEs と公衆衛生、その他の内分泌かく乱化学物質の重要性にもかかわらず、内分泌かく乱は、学部のカリキュラムで一般は含まれません。この欠乏は部分的に原理を説明活動の不足のため学部学生がアクセスしている関与しています。さらに、[はい] プロトコルのいくつかのバリエーションが存在する9,10、11,12,13, と、この多様性は、アッセイ条件の最適化は時間がかかる場合研究室コーディネーターの特に関連技術の訓練。最後に、はいの試金は通常以上 1 の長い一日または完了 O/N 培養で 2 日連続。このタイミングは通常一度を満たす学部研究所講座の形式と互換性がない/週いくつかの時間。
これらのニーズに対応してでは、この原稿は、個人的な心配プロダクト (PCPs)3研究所の例会に合わせて 6 日間冷凍ステップのエタノール抽出メソッドを含む最適化された 96 ウェルはいプロトコルを報告します。無水エタノールは、さまざまな北極および無極性の溶質を溶解できる汎用性の高い有機溶剤です。学部の授業に適していますまた、容易に利用できる、比較的無毒、手頃な価格で、水と混和性であります。それはまた特別な機器なしに簡単に蒸発します。しかし、エタノールは強く疎水性ホルモンの油やワックスの多くを抽出に最適ではない、PCPs 貧しい抽出効率の一般的な成分をされている後者の 2 つは偽否定的な結果のリスクを増加させます。この制約を念頭に置いて、捜査官そのアドレス サンプル特性抽出プロシージャ (例えば、エタノール抽出、固相抽出) を選択し、研究目標 (学部教育と研究) を達成します。
[はい] は、組換え酵母チューレーン大学で博士チャールズ ミラーによって最初に作成されたに依存します。ミラーらを参照してください。(2010 年) の組み換えプラスミド14の完全なマップ。酵母これらのプラスミドで形質転換恒常エクスプレス人間核 ERα または ERβ (また呼ばれる ESR1、ESR2、それぞれ) (ERα) のガラクトースやグルコースやガラクトース (ERβ) の培地で成長しました。エストロジェン様化合物がメディアに存在する場合、これらはエストロゲン様化学物質の濃度に比例したレベルの β-ガラクトシダーゼ (lacZ) 式をアクティブ化リガンド-受容体複合体を作成する、受容体に結び付きます。酵母細胞が蓄積した β-ガラクトシダーゼを解放する分離します。換散バッファーには ONPG または CPRG は、黄色または赤の製品をそれぞれ生成する β-ガラクトシダーゼによって裂かれるのいずれかが含まれています。比色製品は、マイクロウェル プレート分光光度計を使用して吸光度を測定することによって定量化することができます。色変化の度合いは酵母だった公開されているエストロゲンのリガンドの濃度に比例します。
(CPRG または ONPG) 基板の選択は、テストされているサンプルから生じるバック グラウンドの吸光度の可能性に依存します。植物エキスが場合エストロゲン対策を人為的に膨らませるメディアに頻繁に黄色の色合いを追加してたとえば、ONPG (定量化 405 nm) β-ガラクトシダーゼの基質として使用されます。植物エキス、CPRG (574 で定量化 nm) より適切な比色の基板があります。CPRG は ONPG より高価ですが 10 分の 1 のモル濃度で使用されます。この記事は、PCP の estrogenicities エキス ONPG および CPRG の両方を使用して量を示されるを示します。
ERα と ERβ の両方を用いた環境試料のエストロゲンの定量化は、これらの受容体の 1 つだけを使用するよりもより包括的なアプローチです。動物では、これらの受容体は差分組織分布、規制活動、エストロゲン、抗エストロゲン配位子15の結合親和性を表わします。たとえば、植物ベースの植物性エストロゲン通常 bind ERβ より強く2、ERα または ERβ のいずれかのための好みを示すことができるか両方の受容体にも同様に15をバインドする合成化学物質に対し。したがって、1 つのエストロゲン受容体に結合は他へのバインドは必ずしもでは想定していません。
PCPs の選択を使用して表示されているデータが得られたが、EEs は、植物だけでなく、多くの消費者製品 (例えば農薬、洗剤、接着剤、潤滑剤、プラスチック、食品、医薬品) で発見され、PCPs、説得力のある、容易に利用可能な予算にやさしいや生の環境に関連します。学生は、実験室でテストするのには自宅から自分のお気に入りの PCPs をもたらすに招待することができます。彼らはまた高 PCPs の仮説ドリブン比較を生成し、低毒性スコア16環境ワーキング グループによって開発された皮膚深部のデータベースを検索できます。これで、学生は同時に高度な研究能力を開発します。自己指示、お問い合わせベースの学習; に従事します。環境科学と健康の新たな問題を探る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex Mixer (for single or multiple tubes)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-215-365</td>
			<td >Any mixer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bucket centrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >75-063-839</td>
			<td >Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bunsen burner</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >17-012-823</td>
			<td >Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >50125590H</td>
			<td >Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate reader</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >EPOCH2</td>
			<td >A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gen5 microplate reader and imager software</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >GEN5</td>
			<td >Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05LREEFSA</td>
			<td >Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-681-15E</td>
			<td >Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144562G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144565G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 multichannel pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FBE1200300</td>
			<td >Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164001G</td>
			<td >Must be able to deliver 100-320 &#181;l; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Supplies</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15-ml conical tubes with caps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05-539-801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass scintillation vials</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >03-337-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12565501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid&#160;</td>
			<td >Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td>
			<td >EW-01728-81</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 ml glass beakers</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-539H</td>
			<td >Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 ml glass Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td>FB500250</td>
			<td >Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, adhesive, porous film&#160;</td>
			<td >VWR (www.vwr.com)</td>
			<td >60941-086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metal forceps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12-000-157</td>
			<td >Any metal forceps will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent reservoir</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >07-200-127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration units (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >09-761-52</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Squirt bottle (for ethanol)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-897-10</td>
			<td >Any laboratory squirt bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclavable storage bottles</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >06-414-1D</td>
			<td >Any autoclavable glass storage bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27F</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27C</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-3810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-8810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-9810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe tips for repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164150G</td>
			<td >Only required if a repeating pipettor is used.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile petri dishes</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FB0875712</td>
			<td >Any sterile petri dishes will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >S37440</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a)</td>
			<td >American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)</td>
			<td >MYA-151</td>
			<td >Recombinant yeast are also available upon request from the authors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#945;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#946;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemicals</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Difco agar</td>
			<td >BD (www.bd.com)</td>
			<td >214530</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >D0632</td>
			<td >CAUTION:&#160; Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.&#160; Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >N1127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >10884308001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>Y0626</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G8270</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Galactose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G5388</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine sulfate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >A9126</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uracil</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >U0750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leucine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Histidine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >H8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >17 &#946;-Estradiol&#160;</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MP Biomedicals&#160;</td>
			<td >E8875-250 mg&#160;&#160;&#160;&#160; 0219456401 - 1 mg</td>
			<td >CAUTION:&#160; Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.&#160; It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.&#160; Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.&#160; Estradiol is very toxic to aquatic life.&#160; Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.&#160; Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% ethanol</td>
			<td >Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td>
			<td >111000200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S9638</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate dibasic (anhydrous)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S0876</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >M8266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >P9333</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L5125</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium carbonate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S7795</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Excel spreadsheet software</td>
			<td >Microsoft&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Java software (required for Appendix 1 application)&#160;</td>
			<td >Oracle Corporation</td>
			<td ></td>
			<td >To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.&#160; LacZ results created by the application can be copied by pressing &#34;control (ctrl) + c&#34; on PC keyboards, or &#34;command + c&#34; on Mac keyboards.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JMP statistical software version 13.0.0</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td ></td>
			<td >Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.&#160; The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >R statistical computing and graphics software</td>
			<td >R Foundation</td>
			<td ></td>
			<td >Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.&#160; Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory

酵母エストロゲン画面 (はい) 環境試料中エストロゲンのリガンドを検出するために使用し、内分泌かく乱作用の研究で広く用いられています。エストロゲン配位子には、自然と人工の両方「環境ホルモン」(EEs) 個人的な心配プロダクト (PCPs)、プラスチック、殺虫剤、食品などを含む多くの消費財が見つかりましたが含まれます。EEs は、ヒトと他の動物のシグナリング、潜在的肥沃度を減らすと病気のリスクを増大させるホルモンを混乱させます。EEs の他内分泌かく乱化学物質 (内分泌かく乱化学物質) 国民の健康に重要であるにもかかわらず、内分泌かく乱は、学部のカリキュラムで通常は含まれません。この欠点は原則を示す関連性の高い研究室の活動の不足のために一部学部生にアクセスしている関与しています。この記事は示すエストロゲン受容体 α (ERα) および/またはベータ版 (ERβ) を結合するパーソナルケア製品有機配位子を定量化するためはいで最大限に活用されました。メソッドに 2 つの比色定量の基板の 1 つが組み込まれています (オルト- ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド (ONPG) またはクロロフェノール赤-β-D-ガラクトピラノシド (CPRG)) β-ガラクトシダーゼによって切断するが、6 日間冷蔵インキュベーションへのステップLacZ の計算、および関連付けられている 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰分析の R コードの学部研究所コース、自動アプリケーションでの使用を容易にします。プロトコルは実験、彼らはエストロゲンを模倣の任意の製品を画面を開発して学生を許可するように設計されています。過程で、彼らは内分泌かく乱作用、細胞培養、受容体結合、酵素活性、遺伝子工学、統計、および実験的なデザインについて学ぶ。同時に、基礎的かつ広範に適用される検査スキルをよう練習するも: 計算濃度;ソリューション;生殖不能の技術を実証連続希釈標準;構築し、標準曲線の補間変数とコントロールを識別します。収集、整理、およびデータの分析構築して、グラフの解釈micropipettors、分光光度計など一般的な実験装置を使用して。したがって、このアッセイを実装する環境科学と健康の新たな問題を探索しながら調査に基づく学習に従事する学生を奨励しています。

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Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

この記事では、パーソナルケア製品 (PCPs) エストロゲン受容体 α (ERα) および/またはベータ版 (ERβ) を結合するリガンドを定量化するための最適化された酵母エストロゲン画面を示します。メソッドには、2 つの比色基板オプション、学部コースで使用するため 6 日間冷蔵インキュベーションとデータ分析のための統計ツールが組み込まれています。

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