Name: detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory at JoVE.com

이 프로젝트는 시작 자금 TME 및 AMR 루이지애나 기술 대학, Furman 대학에서 각각에 의해 투자 되었다. AMR 및 국립 과학 재단 그리고 루이지애나 Regents 보드에서 TME 여행 수상에서 TME 루이지애나 EPSCoR Pfund 그랜트, 남쪽의에 관련 된 대학에서 TME 2015 교수 발전 보조금에 의해 제공 된 추가적인 자금에 남쪽의 대학입니다. 우리 감사 박사 데이비드 Eubanks (Furman) 통계 분석 및 씨 크리스토퍼 무어에 대 한 "우리에 게 주는 손을" 촬영 하는 동안.

1. 시 약
<ol>
	<li>6.7 g 효 모 질소 기본, 20 g 포도 당 또는 갈 락 토스, 20mg 아데닌 황산 (추가 200 mg/100 mL 재고 용액 10 mL), 20 mg uracil (추가 200 mg/100 mL 재고 용액 10 mL) 혼합 하 여 포도 당 그리고 갈 락 토스 미디어 준비 60 mg 신 (1 g/100 mL 수성 재고 솔루션의 6 mL 추가), 그리고 이온 물 여과 (0.2 µ m 필터)에 의해 1 L. Sterilize의 마지막 볼륨에 20mg 히스티딘 (추가 1 g/100 mL 수성 재고 솔루션의 2 개 mL). 몇 주 동안 4 ° C에서 미디어를 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>Estradiol (e 2) 표준 녹이는 가루 E2 무수 에탄올에 적절 한 작동 농도를 희석 하 여 준비 (227.5 nM &#38; 9.75 nM) 50% 에탄올에. 참고: estradiol 1mg의 유리병으로 구입한 경우 해산 estradiol 분말 유리병에 직접 1 mL 에탄올을 추가 합니다. 이 3.67 m m 재고 # 1을 생성합니다.  주식의 36.71 μ M #2 1 mL을 990 μ 에탄올에 #1 주식의 10 μ 희석.  그런 다음 희석 367.13 nM 주식 # 3의 1 mL을 990 μ 50% 에탄올에 #2 주식의 10 μ.  작업 주식을 하려면 619.7 μ 주식 #3 227.5 nM 일 주식 ERα을 표현 하는 효 모와 표준 곡선을 만드는 데 사용의 1 mL를 만들려고 380.3 μ 50% 에탄올을 희석.  26.56 μ 주식 #3 1 mL의 9.75 nM 작업 ERβ을 표현 하는 효 모와 표준 곡선을 작성 하는 데 사용 하도록 973.44 μ 50% 에탄올을 희석. 표준 parafilm와-20에 게 인감 또는-70 ° C 주의: e 2는 발암 의심된 물질 및 생식 toxicant. 그것은 흡입, 삼 켜, 또는 피부를 통해 흡수 하는 경우에 유해한입니다. E2 모유 어린이 태아에 해를 일으킬 수 있습니다. E2 수생 생활에 매우 독성이 있다. 적절 한 개인 보호 (장갑, 연기 후드, 먼지 마스크)을 사용 하 고 임신과 수 유 동안 노출을 피하십시오. 유해 폐기물으로 e 2를 처분 하 고 환경에 공개 하지 마십시오.</li>
	<li>마지막에 이온된 수에 8.52 g Na2HPO4, 5.52 g NaH2포4•H2O, 95.21 mg MgCl2, 745.5 mg KCl, 2 세대 N-lauroylsarcosine 나트륨 소금, ONPG (400 mg) 및 CPRG (77.7 m g)를 혼합 하 여 LacZ 버퍼를 준비 -20 ° c.에 20 mL aliquots에 1 나 저장소 LacZ 버퍼의 볼륨 참고: 20 mL aliquot는 충분 한 96 잘 접시입니다.</li>
	<li>105.9 g 1 나 게 실시간의 최종 볼륨을 이온된 수에 탄산 나트륨을 혼합 하 여 탄산 나트륨을 준비</li>
	<li>준비 물에서 1 M dithiothreitol (DTT). -20 ° c.에 DTT의 25 µ L aliquots 고정 주의: DTT는 급성 피부 및 눈 자극. 적절 한 개인 보호 장비 (장갑, 연기 후드, 먼지 마스크)를 사용 하 여 피부와 눈 접촉, 흡입 및 섭취를 피하기 위해. 참고: 각 약 수 한 96 잘 접시 충분 하다.</li>
</ol>
2. 샘플 및 추출 컨트롤 준비
<ol>
	<li>샘플 테스트를 선택 합니다. 참고:이 문서 15 Pcp, 비누, 헤어 크림, 샴푸, 선스크린, 립밤, 재단, 면도 크림, 매니큐어, 그리고 로션을 포함 하 여에 대 한 데이터를 제공 합니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 무수 에탄올 10 mL에 1 g 샘플의 결합. 15 mL 원뿔 튜브에서 에탄올의 11 mL의 구성 된 부정적인 추출 제어를 준비 합니다. 필요에 따라 복제를 준비 합니다. 참고: 제시 실험 설계에 대 한 모든 15 Pcp 및 triplicate 추출 제어 솔루션의 3 aliquots 준비 되었다, 저조한 총 48 샘플, 각각의 섹션 4에에서는 프로토콜을 사용 하 여 3 중에서 분석 했다. 단일 플레이트 triplicates에서 최대 23 샘플을 수용할 수 있습니다. 무수 에탄올은 쉽게 증발 하기 때문에이 단계에서 사용 됩니다. 부정적인 추출 제어를 사용 하 여 에스트로겐 원뿔 튜브에서 샘플에 leaching 하지는 확인.</li>
	<li>수동 진동 및 vortexing의 조합에 의해 또는 다중 튜브 vortexer에 튜브를 떨고 하 여 30 분 동안 튜브 내용을 균질.</li>
	<li>원심 10 분 Decant 대 양동이 분리기에 최대 허용 속도에 원뿔 튜브 각 튜브에서 상쾌한 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 원뿔 관으로. 유리 섬광 유리병으로 각 50 mL 튜브의 빈 내용입니다.</li>
	<li>두고 튜브 에탄올을 완전히 증발 수 있도록 1 주일에 대 한 환기 후드에서 엽니다. 또는, 통풍된 후드 또는 회전 증발 기 질소 아래에 샘플을 건조. 빛 민감한 성분의 저하를 방지 하려면 (예를 들어, 통풍된 후드 문에 장소 불투명 원단) 빛에서 건조 샘플을 보호 합니다.</li>
	<li>50% 에탄올과 균질에 소용돌이의 1.0 ml 샘플 reconstitute</li>
</ol>
3. 배양 및 효 모14 Subculturing
<ol>
	<li>30 ° c.에 필터 살 균 포도 당 미디어에서 효 모 배양에 의해 활성 효 모 문화 ( S. cerevisiae14의 재조합 W303a 변형)을 유지 신선한 필터 살 균 포도 당 미디어에서 매주 효 subculture</li>
	<li>2 박 (약 42 시간) 예 판 준비 전에 subculture 무 균 기술을 사용 하 여 필터 살 균 포도 당 미디어의 10 mL를 활성 효 모 문화의 0.1 mL를 추가 하 여 효 모.  이틀 동안 30 ° C에서 품 어.  만약 효 모는 성장 얕은 문화로 살 균 250 ml 삼각 플라스 크를 흔들어 필요 하지 않습니다. 참고: 효 모도 저장할 수 있습니다 냉장된 한 판에 몇 달 동안. 장기 저장을 위해 (년), O/N 문화 15-50% 메 마른 글리세롤, 소용돌이, 및 결합-70 ° c.에 동결 살 균 글리세롤을 준비 하려면 주사기를 사용 하 여 느슨하게 모자 cryovial 고 압력솥에 300 µ L 글리세롤을 전송. 그럼 1200 µ L O/N 효 모 문화 무 균 기술을 사용 하 여 추가 합니다.</li>
</ol>
4. 준비 예 판 (분석 결과 1 일)
<ol>
	<li>살 균 비 커, 무 균 기술을 사용 하 여 희석 610에서 0.065 0.005의 광학 밀도 단계 3.2에서에서 효 모 살 균 하는 필터 갈 락 토스 미디어에 nm (OD610).<ol>
		<li>명확한 폴리스 티 렌 격판덮개로 각 효 모 샘플 triplicate 갈 락 토스 공백 함께 3 중에 pipetting 120 μ에 의해 광학 밀도 확인 (접시 필요가 없습니다 살 균 수).  플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 희석된 효 모 문화 누 룩의 net OD610 를 결정 하기 위해 효 모 OD610 독서에서 갈 락 토스의 0.065 0.005 빼기 OD610 판독의 net OD610 있는지 확인 합니다. 각 96 잘 접시 적어도 30 mL 희석 효의 최종 볼륨을 준비 합니다. 참고: 595 610 nm 사이의 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계 필터는이 측정을 위해 사용할 수 있습니다.</li></ol></li></ol>대략 1:6 v: 비 효 모: 미디어의 일반적으로 수익률 0.065 가까이 OD610 , 그래서 30 mL 미디어 4.5 mL 누 룩을 추가 하 여 시작 하 고 netOD610 0.060 0.070 사이 달성 하기 위해 적절 한으로 더 많은 효 모 또는 미디어를 추가.
	
	
	<li>무 균 기술을 사용 하 여, 웰 스는 살 균의 폴 리 프로필 렌, 96-잘 microplate 접시 레이아웃 (그림 1)에 따라 희석된 효 모 현 탁 액이 추가 합니다. Pipetting, 동안 유지 소스 지속적으로 컨테이너 소용돌이 또는 피펫으로 혼합에 의해 중단 하는 효 모. 이 단계에 대 한 멸 균 주사기 팁 반복 pipettor를 사용 하 여 도움이 됩니다. 참고: 폴 리 프로필 렌 플레이트 압력가 마로 소독 두 누적된 판 호 일에 포장 하 여 멸 균.  상단 플레이트 샘플 접시 뚜껑 역할 수 세척, 다시 압력가 하는, 그리고 다시.</li>
	<li>3 추가 웰 스 (h 10-12) 플레이트 레이아웃 (그림 1)에 따라 120 µ L 필터 소독 갈 락 토스 미디어를 추가 합니다. 이러한 우물 혼자 미디어에 의해 공헌 하는 흡 광도을 미디어 컨트롤 역할을 합니다.</li>
	<li>직렬로 e 2 작업 표준의 triplicates를 diluting 하 여 각 접시에 표준 곡선을 생성 (227.5 nM ERα, 9.75에 대 한 ERβ에 대 한 nM) 효 모 현 탁 액 (A1-g 3은) 격판덮개 레이아웃 (그림 1)에 따라 포함 하는 우물에.  웰 스 A1 a 3 통해 E2 표준의 5 µ L을 추가 하 여 먼저. Pipetting, microwell 내용을 혼합 하 고 순차적으로 우물 A1-B1-3 웰 스에 3에서에서 205 µ L를 이동 하 여이 현 탁이 액을 희석. 혼합 및 행 G. 통해 205 µ L의 이전 반복 참고: 직렬 희석 완료 되 면 우물 g 1-3에서에서 205 μ를 삭제 합니다. 이 단계의 끝에, 모든 표준 웰 스 120 μ를 포함 해야 합니다. 직렬 희석 표 1에 나열 된 마지막 E2 농도 얻을 것입니다. 직렬 희석 단계에 대 한 멸 균 팁 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 도움이 됩니다.</li>
	<li>차량 제어 웰 스 효 모 현 탁 액 (h 1-3) 접시 레이아웃 (그림 1)에 따라 포함 된 차량 (50% 에탄올)의 5 µ L를 추가 합니다. 참고: 차량 제어 웰 스는 효 모 세포 및 미디어와 관련 된 배경 흡 광도 측정 하는 데 사용 됩니다. 또한, 테스트 샘플의 OD610 값을 비교 하 여 검출 될 수 있다 세포 독성 또는 성장 촉진 효과와 차량 제어 우물의 우물을 테스트 합니다.</li>
	<li>플레이트 레이아웃 (그림 1)에 따라 효 모 현 탁 액을 포함 하는 웰 스에 샘플 및 부정적인 추출 컨트롤의 5 µ L triplicates를 추가 합니다. 참고: 기록해 샘플 또는 부정적인 추출 컨트롤이 추가 되는 각 음에.  추적 하는 웰 스 샘플 하 고는 하지 않는, 팁의 신선한 상자와 함께 시작 하 고 접시에 해당 우물의 위치와 상자에 동일한 위치에서 도움말을 사용 하 여 있다. 한 96 잘 접시는 3 중에서 최대 23 샘플을 수용할 수 있습니다.</li>
	<li>Pipetting으로 샘플, 추출 제어, 그리고 차량 제어 웰 스의 내용을 혼합. 그림 1에 대 한 범례에 설명 된 대로 각 205 µ L을 제거 하 여 120 µ L에이 우물의 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>살 균, 접착제, 다공성 필름으로 plate(s) 인감. 접시를 레이블 및 17 h 30 ° c.에 대 한 품 어 접시 외피 동안 흔들릴 필요는 없습니다.</li>

5. 처리 예 판 (분석 결과의 주 2)
<ol>
	<li>30 ° C에서 17 h 부 화 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거 합니다. 접시는 즉시에서 처리 될 것입니다, 5.1.1 단계로 진행 합니다. 접시는 나중에 처리 됩니다, 5.1.2 단계로 진행 합니다.<ol>
		<li>멀티 채널 pipettor 우물, 각 행의 내용을 믹스를 사용 하 여 그리고 명확 하 고, 폴리스 티 렌, 96-잘 microplate의 해당 각 우물에서 효 모 현 탁 액의 50 µ L을 전송. 참고: 폴리스 티 렌 접시 살 균 될 필요가 없습니다 하지만 뚜껑이 있어야 한다. 사용 하 여 새로운 피펫으로 팁 웰 스의 각 행에 대 한 교차 오염 우물을 피하기 위해 팁만 triplicate 세트 사이 변경 해야 8 팁 멀티 채널 피 펫과 triplicates에 걸쳐 pipetting, 경우.<ol>
			<li>새로운 플레이트를 레이블을 지정 합니다. 5.2 단계로 진행 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>저장 처리 하기 전에 격판덮개, 플라스틱 랩에 포장. 6 4 ° C에서 래핑된 플레이트를 냉장 디 그 후, 냉장고에서 플레이트를 제거, 그들 풀 다 그리고 단계 5.1.1 에서처럼 pipetting에 의해 모든 우물의 내용을 전송. 5.2 단계로 진행 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1mm DTT의 최종 농도 대 한 해 동된, 실내 온도 LacZ 버퍼의 20 mL를 1 M DTT의 20 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스 LacZ 버퍼입니다. 다중 채널 피 펫을 사용 하는 경우 시 약 저수지로 분배. 주의: 장갑을 착용 하 고 가능한 경우 후드, DTT와 함께 작동</li>
	<li>어느 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 또는 pipettor 반복, 폴리스 티 렌 판 모든 우물에 DTT ONPG 및 CPRG를 포함 하는 LacZ 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 측정 한 즉시 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 우물의 OD610 기록. 추가 번호판에 대 한 필요에 따라 반복 합니다. 참고: OD610 판독 LacZ 계산 (단계 6.1)의 분모에 사용 됩니다. 이러한 이유로, 읽기 pipetting 직후와 셀 정착 하기 전에 얻거나 LacZ 버퍼에 의해 lysed. OD610 값 샘플 웰 스에 대 한 눈에 띄게 높거나 차량 제어 웰 스에 대 한 OD610 값 보다 낮은 경우, 샘플 추출은 성장 촉진 또는 효 모 세포 독성 각각. 계산 셀 밀도 작은 차이 웰 스, 하지만 차이가 어느 방향으로 30%를 초과할 경우 전체 수정 것 이다 LacZ 추가 50% 에탄올에 (단계 2.6)에서 재구성된 샘플 희석 그리고 3.2 단계로 반환 하 여이 샘플을 다시 테스트 12.</li>
	<li>커버 뚜껑 접시. 그 표현 ERα14 30 ° C (ONPG)에 대 일 분 또는 3 h (CPRG)에 대 한 효 모에 포함 된 접시를 품 어. 그 표현 ERβ14 30 ° C (ONPG)에 대 일 분 또는 4 h (CPRG)에 대 한 효 모에 포함 된 접시를 품 어. 참고: CPRG를 사용할 경우 보육 시간 있습니다 유연; 잠복기 2-4 h에 대 한 분석 결과 감도 증가 하는 더 이상 외피와 두 수용 체와 적당 한 결과 생성 합니다.</li>
	<li>플레이트 잠복기 후 각 우물에 탄산 나트륨의 100 µ L을 추가 하는 멀티 채널 피 펫 또는 반복 pipettor을 사용 합니다. 탄산 나트륨 pH를 제기 하 고 β-galactosidase 반응 중지.</li>
	<li>측정 하 고 OD405 (ONPG)에 대 한 또는 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 우물 (CPRG)에 대 한 OD574 기록.</li>
</ol>
6입니다.LacZ 값 계산
참고: LacZ 값 각 샘플에 대 한 색상 변경의 정도 계량 하 고 제공 하는 몇 가지 변수를 고려 하 여 별도 분석 실험 간의 값을 비교 하는 정규화 된 방법 (예, 효 모 광 밀도, 미디어 광 밀도, 그리고 보육 시간 이 같은 접시에 우물 마다 다릅니다)12.
<ol>
	<li>미디어 (갈 락 토스) 제어 웰 스 (h 10-12), triplicate OD610 값의 의미를 계산 하 고 계산 triplicate OD405 또는 차량 (50% 에탄올) 컨트롤 (h 1-3)에 대 한 OD574 값의 의미. 사용 하 여 이러한 의미와 부 화 시간 (t) 접시에 대 한 시간에 색상 (단계 5.5) LacZ 값 (각 잘에서 색상 변경의 정도 해당) 계산을 변경 모든 표준에 대 한 및 샘플 우물 다음과 같은 방정식을 사용 하 여: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq1.jpg"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq2.jpg">
	<ol>
		<li>또는 LacZ 표준 및 샘플에 대 한 값을 계산할 부록 1 에서 자동된 응용 프로그램을 사용 합니다. 참고: 응용 프로그램 함께 사용 하는 접시 레이아웃 동일 접시 레이아웃 그림 1에 제시 해야 합니다. 일부 샘플 우물 사용 되지 않은 경우 빈 우물에서 흡 광도 신호는 부록 1 LacZ 응용 프로그램에 붙여넣을 흡 광도 데이터 집합에서 자리 표시자로 유지 됩니다.  이 응용 프로그램에서 접시의 공간 레이아웃을 유지 하 고 그들의 원하는 위치에 미디어 컨트롤 웰 스는 되도록 합니다.  또한, 빈 셀이 응용 프로그램이 실행 되지 않습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>각 샘플에 대 한 각 E2 표준 triplicate LacZ 값의 의미를 계산 합니다. LacZ 평균값 µ L-1으로 보고 h-1. 로그 변환 표준, 각 E2의 농도 그리고 template.csv 파일 (부록 2)에서 같이 형식의 스프레드시트 문서를 생성.</li>
</ol>
7. 샘플 Estradiol 등가물 (EEQs) 4-매개 변수 로지스틱 회귀를 사용 하 여 보간
참고: EEQs e 2를 사용 하 여 만든 표준 곡선의 LacZ 값 샘플 LacZ 값 (색상 변경) 관계. EEQs는 따라서 얼마나 많은 샘플은 e 2의 알려진 농도 같은 색상 변경 응답을 유도 하는 데 필요한 결정 합니다.
<ol>
	<li>EEQs 테스트 샘플을 계산 하려면 먼저 표준 곡선을 플롯. E2 표준 (y 축) 및 해당 로그 변환 E2 농도 (x 축) 4-매개 변수 로지스틱 회귀 모델에 대 한 평균 LacZ 값에 맞게.</li>
	<li>테스트 샘플 LacZ 값 EEQs을 보간 하는 모델을 사용 합니다. 부록 2에 설명 된 대로 통계 소프트웨어를 사용 하 여 EEQs의 로지스틱 회귀 계산을 수행 합니다.</li>
</ol>
8. 표준화 주치의 샘플 질량에 EEQs (ng/mL)
<ol>
	<li>EEQs 주치의 샘플에 추가 금액에 관련 된 각 단계 4.5에서에서 잘, 증식 EEQ (ng/mL) 샘플 웰 스 (325 µ L)으로 도금 총 볼륨 그리고 다음 추출된 샘플 추가 볼륨을 나누어 각 음 (5 µ L)에. 참고:이 값은 추출 된 샘플의 mL 당 EEQ를 나타냅니다. 주치의의 1 g를 사용 하 여 샘플 준비, 이러한 값 그램 주치의 (ng/g) 당 EEQ를 또한 나타냅니다. 이 방식으로 표현, EEQ 값 (ng/g) 비교 될 수 있다 다른 Pcp. EEQ (ng/g) 값이 연구에서 테스트 하는 퍼스널 케어 제품 표 2에 표시 됩니다 및 전체 프로토콜에 걸쳐 수집 된 샘플 데이터는 에 포함 되어 있습니다. 부록 3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+healthy+Mediterranean+diet:+estrogenic+activity+of+plants+used+as+food+and+flavoring+agents.">Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents.</a> Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).</li><li>Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+soybeans+(Glycine+max)+varies+by+plant+organ+and+developmental+stage.">Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage.</a> Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).</li><li>Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. 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A., Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+plasmids+expressing+human+steroid+hormone+receptors+and+a+reporter+gene+for+use+in+yeast+signaling+assays.">Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays.</a> Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).</li><li>Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaill&#232;s, V., Balaguer, P., Bourguet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+profiling+of+environmental+ligands+for+estrogen+receptors.">Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors.</a> Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).</li><li>Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. 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저자는 공개 없다.

예 물, 음식, 식물 조직, 개인 케어 제품 등 환경 샘플에서 estrogenic ligands를 검출 하는 데 사용 하는 저렴 한 비용 방법입니다. 데이터 되 게 여기 비교 2 에스트로겐 수용 체 (ERα 및 ERβ), 2 기질 (ONPG 및 CPRG), 그리고 2 타임 라인 (냉장 없이 2 d 프로토콜)과 7 일 프로토콜 냉장 예 분석 결과 통해 퍼스널 케어 제품에 estrogenicity를 측정. 한 번만 만족 하는 학부 실험실 과정에 의해 부과 된 또한 시간 제약와 호환 되는 동안 7 d 냉장된 프로토콜 사용 하 여 CPRG 및 ERα 및 ERβ를 가장 잘 표현 하는 효 모 EEQs 단정 / 여러 h 주. 사실, 냉장 없이 2 d 분석 결과에 비해, 7 일간 냉장된 분석 결과와 연관 되었다 감소 분산 판 복제에 걸쳐. 또한, 표준 곡선의 선형 부분 약간 냉장된 분석 결과 사용 하 여 수집 된 데이터에 대 한 확장 되었다. 표준 곡선의 선형 부분 분석 결과 검색 범위를 정의 하 고 샘플 EEQs 보간 하는 데 사용할 수 있는 표준 곡선의 유일한 부분입니다.
테스트 샘플 중 하나를 제외한 모든, CPRG를 사용 하 여 측정 하는 EEQs ONPG와 정량 보다 낮은 했다. 와 높은 멸종 계수 및 낮은 Km V최대, CPRG ONPG17보다 10 배 더 과민 하다. 따라서, CPRG 더 낮은 농도에서 사용할 수 있습니다 그리고 β-galactosidase의 낮은 금액을 감지 하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로 CPRG ONPG,1819통해 일반적으로 기본 설정입니다. 그러나, 큰 기판 감도 낮은 EEQ 값 CPRG을 검색 설명 하지 않는다. 다른 저자2,18에 의해 설명 했 듯이 ONPG 발견 높은 EEQ 값 분석 결과, 매트릭스 방해가 때문일 수 있었다. 퍼스널 케어 제품 추출 물에서 노란 안료 ONPG 감지 하는 EEQ 값을 부 풀 려 수 있습니다. 다른 그들의 실험 디자인2, 실험에 있는 격판덮개의 수를 두 배로 하는 방법에에서 안료 컨트롤을 포함 하 여이 문제를 피할 수 있다. 매트릭스 간섭 문제가 있을 수 있습니다, 비록 더 비싼 ONPG 보다 긴 부 화 시간을 요구 한다 CPRG 예 분석 결과 대 한 바람직 기판 될 수 있습니다. 또한, β-galactosidase에 의해 기판의 분열에 의해 유도 된 색상 변경 쉽게 결과 시각화 하기 위해 학생 들을 위한 CPRG와 함께 더 극적 이다.
밀러 외. (2010), 누가이 프로토콜에 사용 되는 누 룩을 설계, 표현 ERβ 30 x 17β estradiol ERα, 우리의 데이터14에 의해 입증 발견을 표현 하는 효 모 보다 더 민감한 했다 그 누 룩을 지적 했다. 플라스 미드 건설, 밀러 그 외 여러분 에서 잠재적인 뉘앙스를 제외 하 고 (2010 년) 감도14에이 차이 설명할 수. 한 차이 두 플라스 미드 구조 ERβ 식 포도 당 또는 갈 락 토스에 의해 규제 됩니다 반면 ERα 식 갈 락 토스에 의해 통제 된다 이다. 예 시험에 사용 된 효 모 포도 당 미디어에서 교양 있으며 그들이 분석 결과의 시작에서 희석 하 때만 갈 락 토스를 주어진. 따라서, ERβ을 표현 하는 효 모 복사본 수가 수용 체 단백질 estrogenic ligands에 높은 감도 부여 함으로써 분석 결과의 시작 이전에 축적 수 있습니다.
ERα 표현 효 낮은 감도 감지 ERα ERβ와 비교 측정 샘플에서 estrogenicity의 더 높은 속도 설명할 수 있다. 가능성을 증가 하는 샘플 EEQs 검색 됩니다, 사용자 수 다른 추출 용 매 및 방법 또는 높은 볼륨 샘플의 누 룩을 추가. 높은 샘플 볼륨을 사용 하는 경우는 같은 양의 표준 및 샘플 분석 결과에 사용할 수 있습니다 표준 E2의 농도 조정 되어야 한다. 더 많은 샘플을 추가 한 한계 효 모 30 대 35 ° C20의 외피 온도에 더 나은 공차와만 6-10%의 에탄올을 참을 수입니다. 효 모에 에타 놀의 효과 제어 하려면 조사 triplicate "효 모 만" 웰 스 플레이트 레이아웃을 고이 "효 모 만" 웰 스의 OD610 즉시 비교 차량 제어 우물의 OD610 은 확인 후에 LacZ 버퍼의 추가. 또는, 에탄올에 용 해 하는 샘플 건조 microwell 접시와 효 모 추가 되기 전에 떨어져 증발 하는 에탄올에 추가할 수 있습니다. Dimethylsulfoxide (DMSO)는 또한 사용 예에 예제 용 매 분석 실험, 하지만 효 모와 DMSO의 최종 작업 농도 112에 국한 되어야 합니다.
예 시험 환경 샘플에서 estrogenicity을 탐지 하기 위한 강력한 검사 도구입니다. 특히, 예 진 식14를 에스트로겐 응답 요소와 상호 작용 하는 핵 스 트로 겐 수용 체를 바인딩하는 ligands를 감지 합니다. 그러나, 예는 또한 중요 한 제한이 있습니다. 예에 스 막 에스트로겐 수용 체 등 비 핵 메커니즘 또는 활성 제 단백질 1 (AP-1) 녹음 방송 요인에와 같은 추가 요소를 포함 하는 메커니즘을 통해 작동 하는 검색 하지 않습니다. 또한, 효 모 하지 않아도 동일한 대사 용량 포유류 세포로, 때문에 예 estrogenic 되도록 신진 대사 활성화를 필요로 하는 ligands를 검색할 수 없습니다.
또한, 예 분석 결과 구별할 수 없습니다 쉽게 복잡 한 샘플에서 estrogenic 및 안티 estrogenic ligands. 대신, net estrogenicity estrogenic 안티 estrogenic ligands의 합계 효과 측정 합니다. ER 길 항 근의 농도 정량 또는 혼합물의 금지 활동을 평가, 분석 결과 표준 길 항 제 (17β-estradiol)와 다양 한 테스트 샘플 농도12효 모 배양 하 여 수정할 수 있습니다. 이 프로세스 샘플에 길 항 근 주 작동 근 유도 기자 활동을 점감 할 수 있다 하는 경우를 결정 하 고 샘플에서 응급실 길 항 근의 존재를 식별 하는 데 유용한 화면을 제공 합니다.
일부 샘플 추출 및 샘플 준비 단계를 수정 해야 할 수도 있습니다 있지만 여기에 제시 된 프로토콜 샘플 형식의 다양 한을 수용할 수 있습니다. 예를 들어 EEQs 중 널리 다양 한 몇 가지 개인 케어 제품의 복제. 더 가변 샘플 기름 작은 물방울을 포함 하는 경향이 나 그렇지 않으면 하지 완전히 균질, 나타내는 diethyl 에테르 같은 더 질 성 용 매 도움이 될 것 이다. 또는 오일과 왁 스 퍼스널 케어 제품에 샘플 100% 에탄올 대신 50% 에탄올으로 추출 하 여 제외 될 수 있습니다.50% 에탄올 추출 더 많은 수용 estrogenic ligands (예를 들어, 일부 안료) 캡처할 것입니다. 그러나, 50% 에탄올 100% 에탄올 보다 더 느리게 증발 하 고 따라서 추출 시간을 확장할 수 있습니다. 또한, (비누) 등 일부 샘플 했다 감소 셀 밀도 측정 (OD610)에서 발생 하는 효 모 세포 독성. 여우 외. (2008) 같은 샘플 희석 하 고 셀 밀도 차이 차량 제어 웰 스12에 비해 30%를 초과 하는 경우 다시 테스트 해야 좋습니다.
예 시험 분석 연구 목적으로 사용 하는 경우 샘플 풀의 희석 곡선 선제 추출 단계 4.5에서에서 누 룩을 추가할 수의 적절 한 볼륨을 결정 하기 위해 테스트할 수 있습니다. 또는, 추출 물 시험 될 수 있다 동시에 여러 볼륨 (예:5 µ L, 20 µ L 추출 단계 4.5에서에서 효 모에 추가) 또는 주문 크기 (예를 들어, 0.2 µ L, 2 µ L, 및 20 µ L)에 걸쳐 있는 희석. "적절 한" 볼륨 추출의 표준 곡선의 선형 부분을 따라 LacZ 값을 일치 하 여 estrogenicity를 식별 하는 있습니다. 최적화는 효 모 세포 독성, false 네거티브, 또는 표준 곡선을 초과 하는 estrogenicity 등을 너무 많이 또는 너무 작은 샘플을 추가 하 여 발생 하는 문제를 방지할 수 있습니다. 위에서 설명 했 듯이, ligand의 다른 양의 효 모는 접시에 걸쳐 일관 된 볼륨 및 농도의 에탄올 또는 다른 차량에 노출 되도록 사용 하는 경우 샘플 및 E2 표준의 볼륨을 조정 합니다.
False 네거티브를 위한 잠재력에도 불구 하 고 예 분석 결과 확인 되었습니다 계층 3 테스트 도구로 내 분 비 분리기에 대 한 Schug 그 외 여러분 에 의해 (2013), 누가 내 분 비 장애 (TiPED)21에 대 한 포괄적인 계층 프로토콜을 개발. 학부 교육에 대 한 분석 결과 내 분 비 장애, 세포 배양, 수용 체 바인딩, 효소 활동, 유전 공학, 통계, 그리고 실험 설계에 관련 된 개념을 교육에 대 한 유용 합니다. 분석 결과 사용 하 여 학생 또한 직렬 표준; diluting 등 근본적이 고 광범위 하 게 적용 가능한 실험실 연습 추출 샘플; 만드는 솔루션; 구성 하 고 표준 곡선; 보간 계산 농도; 만드는 솔루션; 시연 메 마른 기술; 배양 세포; 식별 하는 변수 및 컨트롤; 수집, 조직, 및 데이터 분석 구성 하 고 해석 그래프; 그리고 micropipettors, 광 등 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여.

효 모 에스트로겐 화면 (예)는 estradiol (e 2 또는 17β-estradiol) 행렬, 물, 식물 조직, 소비자 제품 및 식품1,2,3,를 포함 하 여 다양 한 모방 ligands를 계량에 널리 사용 됩니다. 4. 샨 다, 이러한 ligands "환경 에스트로겐 (EEs)." 라고 예는 낮은 비용, 대안 생체 외에서 vivo에서 테스트 같은 설치류 uterotrophic5,6 분석 결과 및 분석 결과7먹이 무지개 송어로 원래 개발 되었다. 이 테스트의 목표는 제품 포함 자극 또는 에스트로겐-종속 메커니즘을 차단 하는 화학 물질 결정 하는. EEs의 탐지는 중요 한, 그들은 신호, 태아의 개발 중 특히 정상적인 내 인 성 에스트로겐을 방해할 수 있습니다 때문입니다. 이 방해는 비만, 불 임, 암, 그리고 인지 손실8의 위험을 증가 시켜 건강을 타협.
EEs 및 다른 EDCs 공중 보건의 중요성에도 불구 하 고 내 분 비 장애 일반적으로 학부 교육 과정에 포함 되지 않습니다. 이 부족은 또한 학부 학생 들에 게 접근할 수 있는 동안 참여 원칙을 설명 하는 활동의 부족 때문에 부분적으로 이다. 또한, 예 프로토콜의 여러 변형이 존재9,10,11,,1213, 그리고이 다양성은 분석 결과 최적화에 대 한 시간이 실험실 코디네이터는 명확 하 게 관련 기술에서 훈련. 마지막으로, 네 분석 실험은 일반적으로 이상의 1 긴 하루 또는 완료 O/N 외피와 함께 2 일 연속. 이 타이밍은 일반적으로 한 번만 나 학부 실험실 과정의 형식으로 호환 되지 않습니다 / 몇 시간 주.
이러한 요구에 대응,이 원고는 개인 배려 제품 (Pcp)3 , 매주 실험실 회의 수용 하기 위해 6 일 냉장 단계에 대 한 ethanolic 추출 방법을 포함 하는 최적화 된 96 잘 예 프로토콜을 보고 합니다. 절대 에탄올은 다양 한 극 지와 비 극성 용액을 해산 할 수 있는 다양 한 유기 용 매 이다. 또한, 그것은 학부 과정에 적합 하기 때문에 그것은 쉽게 사용할 수, 상대적으로 비 독성, 저렴 한, 혼합할 수 있는 물; 그것은 또한 특별 한 장비 없이 쉽게 증발. 그러나, 에탄올 강하게 소수 성 내 분 비 분리기 또는 많은 오일과 왁 스를 추출 하기 위한 이상적인, Pcp. 가난한 추출 효율에 일반적인 재료 되 고 후자의 두 틀린 부정적인 결과의 모험을 증가 한다. 마음에이 제약 조사 그 주소 샘플 특성 추출 절차 (예를 들어, ethanolic 추출 또는 고체 상 추출)를 선택 하 고 연구 목적 (연구 학부 교육 대)을 충족 해야 합니다.
예는 재조합 Saccharomyces cerevisiae 원래 Tulane 대학에서 박사 찰스 밀러에 의해 만들어진에 의존 합니다. 밀러 그 외 여러분 보십시오 (2010 년) 엔지니어링된 플라스 미드14의 완전 한 지도 위해. 익스프레스 인간의 핵 ERα 또는 ERβ (또한 부르는 ESR1 그리고 ESR2, 각각) 효 모 constitutively이 플라스 미드와 변형 (ERα)에 대 한 갈 락 토스 또는 포도 당 또는 갈 락 토스 (ERβ)에 대 한 포함 된 미디어에 성장 될 때. Estrogenic 화학 미디어에 있다면, 그들은 β-galactosidase (lacZ) 식 estrogenic 화학 물질의 농도에 비례 하는 수준을 활성화 하는 리간드-수용 체 복합물을 만드는 수용 체에 바인딩합니다. 효 모 세포는 다음 출시 축적 된 β-galactosidase lysed. 세포의 용 해 버퍼는 ONPG 또는 CPRG, β-galactosidase 노란색 또는 빨간색 제품을 각각 산출 하 여 죽 습 포함 되어 있습니다. 색도계 제품 microwell 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 흡 광도 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 색상 변경의 정도 누 룩 노출 되었다 estrogenic ligands의 농도에 비례.
테스트 중인 샘플에서 발생 하는 배경 흡 광도 대 한 잠재력에 따라 기판 (CPRG 또는 ONPG) 선택 합니다. 예를 들어 식물 추출 됩니다 추가 하기도 노란색 색조 미디어 경우 인위적으로 estrogenicity 측정을 웃 기는 ONPG (405에서 계량 nm) β-galactosidase는 기판으로 사용 됩니다. 와 식물 추출 물, CPRG (574에 계량 nm) 더 적절 한 색도계 기판 있을 수 있습니다. CPRG는 ONPG 보다 더 비싼 하지만 10 분의 1 몰에 사용 됩니다. 이 문서는 주치의의 estrogenicities ONPG와 CPRG를 사용 하 여 정량 추출 물을 선물 한다.
ERα 및 ERβ를 사용 하 여 환경 샘플의 estrogenicity를 측정 이러한 수용 체 중 하나만 사용 하 여 보다 더 포괄적인 접근 이다. 동물,이 수용 체 차동 조직 배포, 규제 활동, 및 바인딩 선호도 estrogenic 안티 estrogenic ligands15전시. 예를 들어 식물 기반 에스트로겐 일반적으로 바인딩할 ERβ 더 강력 하 게2, 합성 화학 물질 중 ERα 또는 ERβ에 대 한 선호를 표시할 수 있습니다 또는 두 수용 체 똑같이 잘15를 바인딩할 수 있습니다. 따라서, 한 에스트로겐 수용 체에 바인딩은 반드시 다른 바인딩을 예언 하지 않습니다.
EEs는 식물 뿐만 아니라 많은 소비자 제품 (예, 농약, 세제, 접착제, 윤활제, 플라스틱, 식품 및 의약품)에서 발견, 제시 데이터 Pcp. 선택을 사용 하 여 가져온 Pcp는 경쟁력, 쉽게 사용할 수 있는, 예산 친화적인, 그리고 학부생을 위한 환경 관련. 학생 가정 실험실에서 테스트에서 그들의 좋아하는 Pcp를가지고 초대 될 수 있습니다. 그들은 또한 높은 Pcp의 가설 기반 비교를 생성 하 여 독성 점수 낮은 환경 실무 그룹16 에 의해 개발 된 피부 깊은 데이터베이스를 검색할 수 있습니다. 이 방법에서는, 학생 들은 동시에 고급 실험실 능력; 개발할 수 있습니다. 자율, 기반 학습;에 관여 환경 과학 및 건강에 새로운 문제를 탐구 하 고.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex Mixer (for single or multiple tubes)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-215-365</td>
			<td >Any mixer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bucket centrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >75-063-839</td>
			<td >Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bunsen burner</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >17-012-823</td>
			<td >Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >50125590H</td>
			<td >Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate reader</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >EPOCH2</td>
			<td >A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gen5 microplate reader and imager software</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >GEN5</td>
			<td >Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05LREEFSA</td>
			<td >Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-681-15E</td>
			<td >Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144562G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144565G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 multichannel pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FBE1200300</td>
			<td >Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164001G</td>
			<td >Must be able to deliver 100-320 &#181;l; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Supplies</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15-ml conical tubes with caps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05-539-801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass scintillation vials</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >03-337-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12565501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid&#160;</td>
			<td >Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td>
			<td >EW-01728-81</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 ml glass beakers</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-539H</td>
			<td >Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 ml glass Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td>FB500250</td>
			<td >Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, adhesive, porous film&#160;</td>
			<td >VWR (www.vwr.com)</td>
			<td >60941-086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metal forceps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12-000-157</td>
			<td >Any metal forceps will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent reservoir</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >07-200-127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration units (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >09-761-52</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Squirt bottle (for ethanol)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-897-10</td>
			<td >Any laboratory squirt bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclavable storage bottles</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >06-414-1D</td>
			<td >Any autoclavable glass storage bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27F</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27C</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-3810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-8810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-9810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe tips for repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164150G</td>
			<td >Only required if a repeating pipettor is used.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile petri dishes</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FB0875712</td>
			<td >Any sterile petri dishes will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >S37440</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a)</td>
			<td >American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)</td>
			<td >MYA-151</td>
			<td >Recombinant yeast are also available upon request from the authors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#945;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#946;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemicals</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Difco agar</td>
			<td >BD (www.bd.com)</td>
			<td >214530</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >D0632</td>
			<td >CAUTION:&#160; Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.&#160; Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >N1127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >10884308001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>Y0626</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G8270</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Galactose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G5388</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine sulfate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >A9126</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uracil</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >U0750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leucine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Histidine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >H8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >17 &#946;-Estradiol&#160;</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MP Biomedicals&#160;</td>
			<td >E8875-250 mg&#160;&#160;&#160;&#160; 0219456401 - 1 mg</td>
			<td >CAUTION:&#160; Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.&#160; It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.&#160; Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.&#160; Estradiol is very toxic to aquatic life.&#160; Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.&#160; Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% ethanol</td>
			<td >Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td>
			<td >111000200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S9638</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate dibasic (anhydrous)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S0876</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >M8266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >P9333</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L5125</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium carbonate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S7795</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Excel spreadsheet software</td>
			<td >Microsoft&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Java software (required for Appendix 1 application)&#160;</td>
			<td >Oracle Corporation</td>
			<td ></td>
			<td >To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.&#160; LacZ results created by the application can be copied by pressing &#34;control (ctrl) + c&#34; on PC keyboards, or &#34;command + c&#34; on Mac keyboards.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JMP statistical software version 13.0.0</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td ></td>
			<td >Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.&#160; The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >R statistical computing and graphics software</td>
			<td >R Foundation</td>
			<td ></td>
			<td >Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.&#160; Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory

효 모 에스트로겐 화면 (예) 환경 샘플에서 estrogenic ligands를 검출 하는 데 사용 하 고 내 분 비 장애의 연구에 광범위 하 게 적용 되었습니다. Estrogenic ligands는 자연적이 고 인공 "환경 에스트로겐" (EEs) 퍼스널 케어 제품 (Pcp), 플라스틱, 농약, 및 식품을 포함 한 많은 소비자 제품에서 발견 포함 되어 있습니다. EEs는 인간과 다른 동물에서 신호, 잠재적으로 비 옥을 감소 하 고 질병 위험 증가 호르몬을 방해. EEs 및 기타 내 분 비 방해 화학 물질 (EDCs) 공중 보건의 중요성에도 불구 하 고 내 분 비 장애 일반적으로 학부 교육 과정에 포함 되지 않습니다. 이 결점은 또한 학부 학생 들에 게 접근할 수 있으면서도 참여 원칙을 설명 하는 관련 실험실 활동의 부족 때문에 부분적으로. 이 문서를 에스트로겐 수용 체 알파 (ERα) 또는 베타 (ERβ) 퍼스널 케어 제품에 ligands를 측정에 대 한 예는 최적화 된 제공 합니다. 메서드가 두 색도계 기판 중 통합 (ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 또는 chlorophenol 레드-β-D-galactopyranoside (CPRG))는 β-galactosidase에 의해 죽 습, 6 일 냉장된 인큐베이션 단계 LacZ 계산과 관련된 4-매개 변수 로지스틱 회귀 분석에 대 한 R 코드에 대 한 학부 실험실 과정, 자동화 된 응용 프로그램에서 사용을 촉진 한다. 프로토콜 개발 하 고 있는 그들은 제품의 에스트로겐 모방에 대 한 그들의 선택의 화면 실험 학부생 수 있도록 설계 되었습니다. 이 과정에서 그들은 내 분 비 장애, 세포 배양, 수용 체 바인딩, 효소 활동, 유전 공학, 통계, 그리고 실험 설계에 대해 알아보십시오. 동시에, 그들은 또한 근본적이 고 광범위 하 게 적용 가능한 실험실 기술을 연습와 같은: 계산 농도; 만드는 솔루션; 시연 메 마른 기술; 직렬 diluting 표준; 구성 하 고 표준 곡선; 보간 식별 하는 변수 및 컨트롤; 수집, 조직, 및 데이터 분석 구성 하 고 해석 그래프; 그리고 micropipettors, 광 등 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여. 따라서,이 분석 결과 구현 기반 학습 환경 과학 및 건강에 새로운 문제를 탐험 하는 동안에 종사 하는 학생 들을 장려 한다.

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Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

이 문서는 퍼스널 케어 제품 (Pcp) 에스트로겐 수용 체 알파 (ERα) 또는 베타 (ERβ)를 결속 하는 ligands를 측정에 대 한 최적화 된 효 모 에스트로겐 화면을 표시 합니다. 메서드는 두 색도계 기판 옵션, 학부 과정에서 사용 하기 위해 6 일 냉장된 인큐베이션 및 데이터 분석을 위한 통계 도구를 통합합니다.

학부 교육 연구소에 대 한 효 모 에스트로겐 화면 최적화를 사용 하는 퍼스널 케어 제품에서 Estrogenic Ligands를 검출

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