Name: detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory at JoVE.com

Этот проект финансировался начальное финансирование TME и Амр Луизиана Tech университета и университета Фурман, соответственно. Дополнительное финансирование было предоставлено 2015 года факультет улучшению Грант Амр и TME от связанные колледжи Юга, Луизиана EPSCoR фунт Грант TME от национального научного фонда и Луизиана Совет регентов и премию путешествия для TME от Университет стран Юга. Мы благодарим д-р Дэвид Ойбанкс (Furman) для помощи в целях статистического анализа и г-н Кристофер Мур за «дает нам руку» во время съемок.

<ol>
	<li>Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+healthy+Mediterranean+diet:+estrogenic+activity+of+plants+used+as+food+and+flavoring+agents.">Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents.</a> Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).</li><li>Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+soybeans+(Glycine+max)+varies+by+plant+organ+and+developmental+stage.">Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage.</a> Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).</li><li>Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+and+anti-estrogenic+activity+of+off-the-shelf+hair+and+skin+care+products.">Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products.</a> J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).</li><li>Wagner, M., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors+in+bottled+mineral+water:+estrogenic+activity+in+the+E-Screen.">Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).</li><li>Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J., McLachlan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+estrogen+screen+for+examining+the+relative+exposure+of+cells+to+natural+and+xenoestrogens.">A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens.</a> Environ Health Perspect. 104 (5), 544-548 (1996).</li><li>Odum, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rodent+uterotrophic+assay:+critical+protocol+features,+studies+with+nonyl+phenols,+and+comparison+with+a+yeast+estrogenicity+assay.">The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 25 (2), 176-188 (1997).</li><li>Mellanen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood-derived+estrogens:+studies+in+vitro+with+breast+cancer+cell+lines+and+in+vivo+in+trout.">Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 136 (2), 381-388 (1996).</li><li>Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+four-hour+yeast+bioassay+for+the+direct+measure+of+estrogenic+activity+in+wastewater+without+sample+extraction,+concentration,+or+sterilization.">A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization.</a> Sci Total Environ. 408 (6), 1422-1429 (2010).</li><li>Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+recombinant+yeast+cell+estrogen+screening+assay.">Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay.</a> Environ Health Perspect. 105 (7), 734-742 (1997).</li><li>De Boever, P., Demar&#233;, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+yeast+estrogen+screen+and+its+applicability+to+study+the+release+of+estrogenic+isoflavones+from+a+soygerm+powder.">Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder.</a> Environ Health Perspect. 109 (7), 691-697 (2001).</li><li>Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+ligands+and+dissecting+nuclear+receptor-signaling+pathways+using+recombinant+strains+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protoc. 3 (3), 637-645 (2008).</li><li>Routledge, E. J., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+activity+of+surfactants+and+some+of+their+degradation+products+assessed+using+a+recombinant+yeast+screen.">Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen.</a> Environ Toxicol Chem. 15 (3), 241-248 (1996).</li><li>Miller, C. A., Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+plasmids+expressing+human+steroid+hormone+receptors+and+a+reporter+gene+for+use+in+yeast+signaling+assays.">Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays.</a> Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).</li><li>Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaill&#232;s, V., Balaguer, P., Bourguet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+profiling+of+environmental+ligands+for+estrogen+receptors.">Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors.</a> Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).</li><li>Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+detection+of+beta-galactosidase+in+transfected+mammalian+cells.">A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells.</a> Biotechniques. 11 (6), (1991).</li><li>Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+beta-galactosidase+tissue+levels+in+a+tumor+cell+xenograft+model.">Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model.</a> Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).</li><li>Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+beta-galactosidase+activity+in+tissue+in+the+presence+of+blood.">Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood.</a> J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).</li><li>Gray, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+alcohol+tolerance+of+yeasts.">Studies on the alcohol tolerance of yeasts.</a> J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).</li><li>Schug, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+endocrine+disruption+out+of+the+next+generation+of+chemicals.">Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals.</a> Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Да это низкая стоимость метод используется для выявления эстрогенных лигандов в пробах окружающей среды, таких как вода, еда, растительных тканей или личной гигиены. Данные представлены здесь сравнить 2 эстрогеновых рецепторов (ERα и ERβ), 2 субстратов (ONPG и CPRG) и 2 сроков (2 d протокол без охлаждения) и 7 дневный протокол с охлаждением для измерения estrogenicity в продуктах личной внимательности через да assay. 7 d, охлажденных протокол, с помощью CPRG и выражая ERα или ERβ лучше дрожжи количественно EEQs, а также совместим с временные ограничения навязываемые по бакалавриату Лаборатория курсы, отвечающие только один раз / неделя в течение нескольких часов. В самом деле по сравнению с 2 d assay без охлаждения, охлажденных пробирного семь дней был связан с сокращением дисперсия через пластины реплицирует. Кроме того линейной части стандартной кривой слегка была расширена для данных, собранных с помощью холодильных assay. Линейная часть стандартной кривой определяет дальность обнаружения пробирного и является единственной частью стандартной кривой, который может использоваться для интерполяции образец EEQs.
В всех исклучая одной из испытанных образцов EEQs, измеряется с помощью CPRG были ниже, чем те, которые количественно с ONPG. С более высокий коэффициент вымирания и Нижняя Kм и VМаксCPRG десять раз чувствительнее, чем ONPG17. Таким образом CPRG может использоваться при более низких концентрациях и могут быть использованы для выявления нижнюю β-галактозидазы. По этим причинам CPRG предпочтительнее вообще ONPG18,19. Однако большую чувствительность субстрат не объяснить, с CPRG обнаружены более низкие значения EEQ. Более высокие значения EEQ, обнаружены с ONPG может быть вызвано матрицы интерференции с assay, как было отмечено другими авторами2,18. Желтые пигменты от личной гигиены продукта выдержки может надуть EEQ значения, обнаруженные с ONPG. Другие обойти эту проблему, включая контроль пигмента в их экспериментальный дизайн2, подход, который удваивает количество пластин в эксперименте. Когда матрица вмешательство может быть проблематичным, CPRG может быть предпочтительным субстрат для assay Да, хотя это более дорого и требует больше инкубации раз чем ONPG. Кроме того изменение цвета, вызванные расщепления субстрата, β-галактозидазы более драматичным с CPRG, что делает его легче для студентов, чтобы визуализировать результаты.
Миллер и др. (2010), который спроектирован дрожжей, используемые в настоящем Протоколе, отметил, что дрожжи, выражая ERβ были более чувствительны к 17β-эстрадиола чем дрожжей, выражая ERα, вывод подтверждается нашими данных1430 x. Помимо потенциальных нюансы в строительстве плазмида, Миллер и др. (2010) не может объяснить эти различия в чувствительности14. Одно различие между двумя плазмидные конструкции является, что выражение ERα регулируется галактозы, тогда как выражение ERβ регулируется глюкозы или галактозы. Дрожжей, используемых в assay да культивировали в СМИ глюкозы и только дано галактозы, когда они разводят в начале assay. Таким образом выражая ERβ дрожжи могут накапливаться выше номеров копии рецептор белков до начала анализа, тем самым наделения более высокой чувствительности к эстрогенных лигандами.
Более низкую чувствительность ERα-выражая дрожжи можно объяснить более высоким уровнем обнаружения estrogenicity в образцах, измеренного с ERα, по сравнению с ERβ. Чтобы увеличить вероятность того, что образец EEQs будет обнаружен, пользователи могут использовать различные экстракции растворителями и методы или добавить больших объемов выборки дрожжи. Если используются большие объемы выборки, концентрации Е2 стандартов следует скорректировать таким образом, что же объем образцов и стандартов могут быть использованы в assay. Одно ограничение добавления более образца является, что дрожжи могут терпеть только 6-10% этанола, с лучшей толерантности при температуре инкубации 30 — 35 ° C20. Для контроля за эффекты этанола на дрожжи, следователи должны добавить тройные «дрожжи только» скважин в пластины макет и подтвердить, что ОД610 этих скважин «дрожжи только» сопоставимы с ОД610 транспортного средства контроля скважин немедленно После добавления LacZ буфера. Кроме того могут быть добавлены образцы, растворяется в этиловом спирте сухой микрорезервуар пластины и этанола, испаряется покинуть, прежде чем добавляются дрожжи. Диметилсульфоксид (ДМСО) используется также как образец растворителя в да assays, но окончательные рабочие концентрации ДМСО с дрожжи должна быть ограничена 1%12.
Да assay является мощным скрининга для выявления estrogenicity в пробах окружающей среды. В частности да обнаруживает лиганды, которые связывают ядерной эстрогеновых рецепторов, которые взаимодействуют с элементами ответ эстроген прямого выражения гена14. Однако да также имеет важные ограничения. Да не обнаружить ЭЭС, которые работают через неядерные механизмы, такие как мембранных рецепторов эстрогена или механизмы, которые включают дополнительные элементы, такие как факторы транскрипции активатор протеин 1 (AP-1). Кроме того поскольку дрожжи не имеют той же метаболической мощности как mammalian клеток, да не может обнаружить лиганды, которые требуют активации метаболических быть эстрогенных.
Кроме того да assay нельзя легко различать эстрогенных и анти-эстрогенных лигандами в сложных проб. Вместо этого он измеряет чистой estrogenicity, который является сумма эффект эстрогенных и анти-эстрогенных лигандов. Для количественного определения концентрации антагонистов ER или оценить ингибиторная активность смесей, assay могут быть изменены путем инкубации дрожжей с стандартным агонистов (17β-эстрадиола) и широкий спектр испытаний образец концентрации12. Этот процесс определяет если антагонистов в пробах может снизить активность агонист индуцированной репортер и обеспечивает полезные экран для выявления присутствия ER антагонистов в образцах.
Протокола, представленные здесь могут разместиться различные типы образцов, хотя некоторые образцы могут потребовать изменения действия по подготовке добычи и образца. Например EEQs, широко различались реплицирует некоторых продуктов личной гигиены. Более переменных образцы, как правило, содержат капельки масла или в противном случае не были полностью однородной, указав, что более липофильных растворителя, например диэтиловом эфире будет полезным. Кроме того масла и воска в продуктах личной гигиены могут быть исключены путем извлечения образцов с 50% этанола вместо 100% этанола.50% этанола добыча будет также захватить больше воды растворимые эстрогенных лигандами (например, некоторые пигменты). Однако 50% этанола испаряется более медленно, чем 100% этанола и таким образом может продлить время экстракции. Кроме того некоторые образцы (например, мыло) были цитотоксических дрожжи, в результате измерения плотности сокращение клеток (610OD). Фокс и др. (2008) показывают, что такие образцы следует разбавлять и повторно, если плотность различия клетки превышает 30% по сравнению с транспортного средства контроля скважин12.
Если да assay используется для аналитических исследований, кривые разбавления образца бассейнов может испытываться заранее определить соответствующие объемы экстракт для добавления дрожжей на шаге 4.5. Кроме того, экстракты могут быть одновременно проверены на несколько томов (например, 5 мкл и 20 мкл экстракт добавляются дрожжи в шаге 4.5) или разведения, которые охватывают порядков (например, 0,2 мкл, 2 мкл и 20 мкл). «Соответствующие» тома экстракта являются те, которые определяют estrogenicity, сопоставляя значения LacZ вдоль линейной части калибровочной кривой. Оптимизация предотвращает проблемы, вызванные слишком много или слишком мало образец добавления дрожжей, например цитотоксичность, ложных негативов или estrogenicity, что превышает калибровочной кривой. Как упоминалось выше, объемы выборок и E2 стандартов должны корректироваться, когда различное количество лигандом используются таким образом, что дрожжи подвергаются последовательного объема и концентрации этанола или другого транспортного средства через пластину.
Несмотря на потенциал для ложных негативов да пробирного была обнаружена как инструмент тестирования уровня 3 для КМР, Schug et al. (2013), который разработал всеобъемлющий многоуровневого протокол для функционирования эндокринной системы (TiPED)21. Для undergraduate образования ценные для обучения концепции, связанные с эндокринной, культуры клеток, связывания рецептора, активность фермента, генной инженерии, статистики и экспериментальный дизайн assay. Студенты, которые используют assay также практиковать навыки фундаментальных и широко применимые Лаборатория как серийно, разведение стандартов; Извлечение образцов; принятия решения; строительство и интерполяции стандартных кривых; расчет концентрации; принятия решения; демонстрируя стерилизации; Культивирование клеток; Определение переменных и элементов управления; сбора, Организации и анализа данных; Построение и интерпретация графиков; и с использованием общих лабораторного оборудования, таких как micropipettors и спектрофотометров.

Дрожжи экран эстрогена (да) широко используется для количественного определения лиганды, которые имитируют эстрадиола (Е2 или 17β-эстрадиола) в различных матриц, включая воду, растительных тканей, потребительские товары и продукты1,2,3, 4. Коллективно такие лигандов называются «Экологические эстрогены (ЭЭС).» Да, первоначально была разработана как низкая стоимость, в пробирке альтернативой в естественных условиях испытания как грызун Утеротропная пробирного5,6 и радужная форель, кормления пробирного7. Цель этих испытаний заключается в определении, если продукт содержит химические вещества, которые стимулируют или блокировать эстроген зависимых механизмов. Обнаружение EEs имеет решающее значение, потому что они могут мешать нормальной эндогенных эстрогенов, сигнализации, особенно во время внутриутробного развития. Это вмешательство подрывает здоровье, увеличивая риск ожирения, бесплодие, рак и когнитивные потери8.
Несмотря на важность ЕЭС и другими ЭЭС для общественного здравоохранения эндокринных обычно не входит в учебные программы бакалавриата. Отчасти из-за недостатка деятельности, которые иллюстрируют принципы этот недостаток участвует также будучи доступным для студентов. Кроме того существует несколько вариантов протокола да9,10,11,12,13, и это разнообразие делает пробирного оптимизации времени для Лаборатория координаторы не специально обученных в соответствующих методов. Наконец да анализов обычно комплектуются более 1 длинный день или 2 дня подряд с O/N инкубации. Это время не совместим с форматом Бакалавриат лабораторных курсов, которые обычно отвечают раз / неделя в течение нескольких часов.
В ответ на эти нужды эта рукопись сообщает оптимизированный протокол да 96-луночных, который включает обколоть извлечения методы для личной гигиены (винтовых)3 и 6-дневный холодильного шаг для размещения еженедельных совещаний лаборатория. Абсолютного этанола является универсальным органического растворителя, который может распустить целый ряд полярных и неполярных растворенных веществ. Кроме того это подходит для студентов курсов, потому что это легко доступны, относительно нетоксичны, доступным и смешивается с водой; Он также легко испаряется без специального оборудования. Однако этанола не является идеальным для извлечения сильно гидрофобной эндокринные расстройства или много масла и воски, последние две общие ингридиенты в винтовых. бедные извлечения эффективности повышает риск возникновения ложных отрицательных результатов. Это ограничение в виду следователи должны выбрать процедуры извлечения (например, обколоть извлечения или извлечения твердой фазы), адрес образец характеристики и целей исследование (исследование против студентов инструкция).
Да опирается на рекомбинантной Saccharomyces cerevisiae , первоначально созданные д-р Чарльз Миллер в Туланском университете. Пожалуйста, смотрите Миллер и др. (2010) для полной карты инженерии плазмида14. Дрожжи преобразован с этих плазмидов конститутивно Экспресс человека ядерных ERα или ERβ (также называемый ESR1 и ESR2, соответственно) при выращивании в средствах массовой информации, содержащие галактозу (для ERα) или глюкозы или галактозы (для ERβ). Если эстрогенные химические вещества присутствуют в средствах массовой информации, они связываются с рецепторами, создавая рецептор лиганд комплексы, которые активируют β-галактозидазы (lacZ) выражение на уровне пропорционально концентрации химических веществ, эстрогенные. Дрожжевые клетки затем лизированы выпустить накопленную β-галактозидазы. Буфер lysis содержит ONPG или CPRG, которые являются расщепляется β-галактозидазы приносить желтые или красные продукты, соответственно. Колориметрические продуктов могут быть количественно путем измерения оптической плотности, используя спектрофотометр микрорезервуар пластины. Степень изменения цвета пропорциональна концентрации эстрогенных лигандов, которым подвергалась дрожжей.
Выбор субстрата (CPRG или ONPG) зависит от возможности для поглощения фон, вытекающих из образцов. Например, экстракты растений часто будет добавить желтый оттенок в СМИ, что искусственно раздувает estrogenicity меры, если ONPG (количественно в 405 нм) используется в качестве субстрата для β-галактозидазы. С растительные экстракты, CPRG (количественно в 574 nm) может быть более подходящим колориметрические субстрата. CPRG является более дорогим, чем ONPG, но на одну десятую Молярность используется. Эта статья представляет estrogenicities ПХФ количественно с помощью ONPG и CPRG экстрактов.
Количественная оценка estrogenicity проб окружающей среды с помощью ERα и ERβ является более комплексный подход, чем при использовании только одной из этих рецепторов. В животных эти рецепторы exhibit дифференциальной тканей распределение, регулирования деятельности и сходство привязки для эстрогенных и анти-эстрогенных лигандов15. Например на основе завод phytoestrogens обычно привязывают ERβ более решительно2, тогда как синтетических химических веществ может показать предпочтение ERα или ERβ или можно связать оба одинаково хорошо рецепторов15. Таким образом привязка к одной эстрогенового рецептора не обязательно предсказать привязки на другой.
Хотя во многих потребительских товаров (например, пестициды, моющие средства, клеи, смазочных материалов, пластмасс, продукты и фармацевтика) а также растения найдены EEs, представленные данные были получены с помощью выбор винтовых. винтовых являются убедительными, легко доступные, бюджетный и экологически значимых для студентов. Студенты могут быть приглашены принести свои любимые винтовых из дома для тестирования в лабораторных условиях. Они могут также поиск по базе кожи глубоко разработанной окружающей среды Рабочая группа16 генерировать гипотеза driven сравнения винтовых с высокой и низкой токсичности баллы. Таким образом студенты могут одновременно развивать передовые лаборатории навыки; заниматься самостоятельной, запрос основе обучения; и изучение новых вопросов в области экологической науки и здравоохранения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex Mixer (for single or multiple tubes)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-215-365</td>
			<td >Any mixer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bucket centrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >75-063-839</td>
			<td >Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bunsen burner</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >17-012-823</td>
			<td >Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >50125590H</td>
			<td >Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate reader</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >EPOCH2</td>
			<td >A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gen5 microplate reader and imager software</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >GEN5</td>
			<td >Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05LREEFSA</td>
			<td >Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-681-15E</td>
			<td >Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144562G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144565G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 multichannel pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FBE1200300</td>
			<td >Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164001G</td>
			<td >Must be able to deliver 100-320 &#181;l; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Supplies</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15-ml conical tubes with caps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05-539-801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass scintillation vials</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >03-337-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12565501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid&#160;</td>
			<td >Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td>
			<td >EW-01728-81</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 ml glass beakers</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-539H</td>
			<td >Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 ml glass Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td>FB500250</td>
			<td >Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, adhesive, porous film&#160;</td>
			<td >VWR (www.vwr.com)</td>
			<td >60941-086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metal forceps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12-000-157</td>
			<td >Any metal forceps will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent reservoir</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >07-200-127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration units (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >09-761-52</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Squirt bottle (for ethanol)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-897-10</td>
			<td >Any laboratory squirt bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclavable storage bottles</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >06-414-1D</td>
			<td >Any autoclavable glass storage bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27F</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27C</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-3810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-8810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-9810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe tips for repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164150G</td>
			<td >Only required if a repeating pipettor is used.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile petri dishes</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FB0875712</td>
			<td >Any sterile petri dishes will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >S37440</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a)</td>
			<td >American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)</td>
			<td >MYA-151</td>
			<td >Recombinant yeast are also available upon request from the authors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#945;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#946;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemicals</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Difco agar</td>
			<td >BD (www.bd.com)</td>
			<td >214530</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >D0632</td>
			<td >CAUTION:&#160; Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.&#160; Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >N1127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >10884308001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>Y0626</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G8270</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Galactose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G5388</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine sulfate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >A9126</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uracil</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >U0750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leucine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Histidine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >H8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >17 &#946;-Estradiol&#160;</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MP Biomedicals&#160;</td>
			<td >E8875-250 mg&#160;&#160;&#160;&#160; 0219456401 - 1 mg</td>
			<td >CAUTION:&#160; Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.&#160; It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.&#160; Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.&#160; Estradiol is very toxic to aquatic life.&#160; Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.&#160; Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% ethanol</td>
			<td >Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td>
			<td >111000200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S9638</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate dibasic (anhydrous)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S0876</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >M8266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >P9333</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L5125</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium carbonate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S7795</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Excel spreadsheet software</td>
			<td >Microsoft&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Java software (required for Appendix 1 application)&#160;</td>
			<td >Oracle Corporation</td>
			<td ></td>
			<td >To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.&#160; LacZ results created by the application can be copied by pressing &#34;control (ctrl) + c&#34; on PC keyboards, or &#34;command + c&#34; on Mac keyboards.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JMP statistical software version 13.0.0</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td ></td>
			<td >Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.&#160; The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >R statistical computing and graphics software</td>
			<td >R Foundation</td>
			<td ></td>
			<td >Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.&#160; Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory

Дрожжи экран эстрогена (YES) используется для обнаружения эстрогенных лигандов в пробах окружающей среды и широко применялся в исследованиях эндокринных нарушений. Эстрогенных лигандов включают природного и техногенного характера» экологические эстрогены» (ЕЭС) в многих потребительских товаров, включая товары личной гигиены (винтовых), пластмасс, пестициды и продукты. ЭЭС нарушить гормонов сигнализации в организме человека и других животных, потенциально снижение рождаемости и увеличение риска заболеваний. Несмотря на важность ЕЭС и другие эндокринные нарушения химических веществ (ЭЭС) для общественного здравоохранения эндокринных обычно не входит в учебные программы бакалавриата. Этот недостаток частично объясняется отсутствием деятельности соответствующих лабораторий, которые иллюстрируют принципы участвуют также будучи доступным для студентов. Эта статья представляет оптимизированный Да для количественной оценки лигандами в личной гигиены, которые связывают эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) и/или бета (ERβ). Этот метод включает в себя один из двух колориметрические субстратов (Орто- нитрофенил-β-D-галактопиранозид (ONPG) или хлорфенол красно β-D-галактопиранозид (CPRG)), расщепляется, β-галактозидазы, шаг 6-дневный охлажденных инкубации облегчить использование курсов бакалавриата лаборатории, Автоматизированные приложения для вычисления LacZ и код R для анализа связанных 4-параметр логистической регрессии. Протокол был разработан чтобы позволить студентов разрабатывать и проводить эксперименты, в которых они экране продуктов по их выбору для мнемосхемы эстрогена. В процессе они узнают о эндокринной, культуры клеток, связывания рецептора, активность фермента, генной инженерии, статистики и экспериментальный дизайн. Одновременно, они также практикуют фундаментальных и широко применимые Лаборатория навыки, такие как: расчет концентрации; принятия решения; демонстрируя стерилизации; серийно, разведение стандартов; строительство и интерполяции стандартных кривых; Определение переменных и элементов управления; сбора, Организации и анализа данных; Построение и интерпретация графиков; и с использованием общих лабораторного оборудования, таких как micropipettors и спектрофотометров. Таким образом реализация этот assay поощряет студентов участвовать в запрос ориентированного обучения при изучении возникающих проблем в области экологической науки и здравоохранения.

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory at JoVE.com

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Эта статья содержит эстроген экран оптимизирован дрожжей для количественной оценки лигандов в продуктах личной внимательности (винтовых), которые связывают эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) и/или бета (ERβ). Этот метод включает в себя два варианта колориметрические субстрата, охлажденных инкубации шесть дней для использования в бакалавриату курсы и статистические инструменты для анализа данных.

Обнаружение эстрогенных лигандов в продуктах личной внимательности с использованием дрожжей эстроген экран оптимизирован для лаборатории обучения студентов

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Fundamentals

Scientific Inquiry

SCIENTISTS IN ACTION

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Количественный ПЦР в реальном времени использованием Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Imaging of Estrogen Receptor-ÃƒÅ½Ã‚Â± in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Визуализация эстрогеновых рецепторов-α в Крыса пиальных Артериолы использованием цифровой микроскоп иммунофлуоресцентного

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Регулярный уход и обслуживание данио рерио (<em&gt; Данио рерио</em&gt;) Лаборатория: введение

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Реверс дрожжевой Два-гибридная система для идентификации Mammalian ядерного рецептора Остатки, которые взаимодействуют с лигандами и / или антагонистов

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Анализ функциональной дополнительности (FCA): A Laboratory Упражнение Разработана и внедрена к дополнению Учение биохимических путей

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional межклеточной коммуникации: Функциональная биомаркеров для оценки неблагоприятного воздействия токсикантов и токсинами, и Польза для здоровья натуральных продуктов

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Измеряя ферментативную активность лактазы в лаборатории обучения

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Использование микрофлюидальных устройств для измерения срок службы и сотовых фенотипов в одиночных дрожжевых клетках почкования

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...