Name: detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory at JoVE.com

Este proyecto fue financiado por la puesta en marcha fondos a TME y AMR de Louisiana Tech University y la Universidad de Furman, respectivamente. Financiación adicional fue proporcionada por una beca de adelanto Facultad de 2015 a AMR y TME de la universidades asociadas del sur, una beca de Luisiana EPSCoR Pfund de TME de la National Science Foundation y el tablero de Luisiana de regentes y un premio de viaje a TME de la Universidad del sur. Agradecemos Dr. David Eubanks (Furman) ayuda con análisis estadísticos y el Sr. Christopher Moore para "que nos da una mano" durante el rodaje.

1. elaboración reactivos
<ol>
	<li>Preparar medios de glucosa y galactosa mediante la mezcla de 6,7 g levadura nitrógeno base, 20 g dextrosa o galactosa, 20 mg de sulfato de adenina (agregado como 10 mL de una solución stock acuosa de 200 mg/100 mL), uracil 20 mg (agregado como 10 mL de una solución stock acuosa de 200 mg/100 mL) , 60 mg leucina (agregado como 6 mL de una solución stock acuosa de 1 g/100 mL) e histidina 20 mg (agregado como 2 mL de una solución stock acuosa de 1 g/100 mL) en agua desionizada hasta un volumen final de 1 L. esterilizar por filtración (0,2 μm filtro). Los medios de comunicación pueden almacenarse a 4 ° C durante varias semanas.</li>
	<li>Preparar el estradiol (E2) estándares de E2 en polvo disuelve en etanol anhidro y dilución de las concentraciones apropiadas de trabajo (227.5 nM &#38; 9.75 nM) en etanol al 50%. Nota: Si estradiol se adquiere como un vial de 1 mg, agregar 1 mL de etanol directamente en el vial para disolver el polvo de estradiol. Esto produce una acción de 3,67 mM #1.  Diluir 10 μL del stock de #1 en 990 etanol μL para hacer 1 mL de caldo μM 36.71 #2.  Luego, diluir 10 μL del stock de #2 en 990 μL 50% de etanol para hacer 1 mL de stock nM 367.13 #3.  Para realizar las acciones de trabajo, diluir 619.7 stock μL #3 de 380.3 μL 50% de etanol para hacer 1 mL de 227,5 nM valores de trabajo permite crear curvas estándar con levadura expresión ERα.  Diluir 26.56 stock μL #3 de 973.44 μL 50% de etanol para hacer 1 mL de 9.75 nM stock de trabajo utilizado para crear curvas estándar con levadura expresando ERβ. Sello de normas con parafilm y almacenar a -20 ó -70 º C. PRECAUCIÓN: E2 es un carcinógeno y tóxicos reproductivos. Es dañino si se inhala, se traga o absorbe por la piel. E2 puede causar daño a la lactancia de los niños y los fetos. E2 es muy tóxico para la vida acuática. Utilice protección personal adecuada (guantes, campana extractora, mascarilla) y evitar la exposición durante el embarazo y la lactancia. Deseche E2 como residuos peligrosos y no lo deje en el medio ambiente.</li>
	<li>Preparar LacZ buffer mezclando 8,52 g de Na2HPO4, 5,52 g NaH2PO4cuadrados2O, 95,21 mg MgCl2, mg 745,5 KCl, sal de sodio 2 g N-lauroylsarcosine y ONPG (400 mg) o CPRG (77,7 mg) en agua desionizada a una final volumen de 1 L. tienda LacZ tampón en alícuotas de 20 mL a-20 ° C. Nota: Una alícuota de 20 mL es suficiente para una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Preparación de carbonato de sodio mezclando 105,9 g de carbonato de sodio en agua desionizada hasta un volumen final de 1 L. tienda a TA.</li>
	<li>Preparar 1 M dithiothreitol (DTT) en agua. Congelar alícuotas de 25 μl de la TDT a-20 ° C. PRECAUCIÓN: TDT es un aguda de la piel y un irritante de los ojos. Utilizar equipos de protección individual adecuados (guantes, campana extractora, mascarilla) para evitar la piel y contacto con los ojos, inhalación e ingestión. Nota: Cada alícuota es suficiente para una placa de 96 pocillos.</li>
</ol>
2. preparación de muestras y controles de extracción
<ol>
	<li>Seleccionar muestras para probar. Nota: Este artículo presenta datos de para quince de PCP, incluyendo jabón, crema, champú, protector solar, bálsamo labial, Fundación, crema de afeitar, esmalte de uñas y loción.</li>
	<li>Combinar 1 g de muestra con 10 mL de etanol anhidro en un tubo cónico de 15 mL. Preparar un control negativo de extracción de 11 mL de etanol en un tubo cónico de 15 mL. Preparar repeticiones según sea necesario. Nota: Para el diseño experimental presentado, se prepararon tres alícuotas de 15 PCP y soluciones de control de la extracción por triplicado, dando un total de 48 muestras, cada una de ellas se analizó por triplicado utilizando el protocolo en la sección 4. Una sola placa puede alojar hasta 23 muestras en triplicado. Etanol anhidro se utiliza en este paso porque se evapora fácilmente. Utilice controles negativos de extracción para comprobar que los estrógenos no son lixiviación en las muestras de los tubos cónicos.</li>
	<li>Homogeneizar el contenido del tubo durante 30 minutos por una combinación de agitación manual y de Vortex o agitando los tubos en un tubo Vortex.</li>
	<li>Tubos de centrífuga cónicos a la máxima velocidad permitida en una cubo la centrifugadora durante 10 minutos decantar el sobrenadante de cada tubo a través de un tamiz de 40 μm células en un tubo cónico de 50 mL. Vacíe el contenido de cada tubo de 50 mL en un vial de centelleo de vidrio.</li>
	<li>Frascos de licencia abierta en una campana de ventilación para una semana permitir que el etanol se evapore completamente. Alternativamente, seque las muestras en una campana ventilada bajo nitrógeno o con un evaporador rotatorio. Para evitar la degradación de los componentes sensibles luz, proteger muestras de secado de la luz (por ejemplo, coloque el tejido opaco sobre puerta campana ventilada).</li>
	<li>Reconstituya las muestras en 1,0 mL de etanol al 50% y de vortex para homogeneizar.</li>
</ol>
3. cultivo y subcultivo levadura14
<ol>
	<li>Mantener las culturas de levadura activa (recombinante W303a cepa de S. cerevisiae14) por incubación de levadura en medios de filtro esterilizado glucosa a 30 ° C. Subcultura levadura semanalmente en los medios de comunicación fresco esterilizado por filtro de glucosa.</li>
	<li>Dos noches (unos 42 h) antes de preparar las placas sí, subcultura de la levadura agregando 0,1 mL de cultivos de levadura activa a 10 mL de medio de filtro esterilizado de glucosa utilizando una técnica estéril.  Incubar a 30 ° C durante dos noches.  Agitación no es necesaria si la levadura se cultiva como cultivos superficiales en estéril de 250 mL Erlenmeyer frascos. Nota: La levadura puede también almacenarse en placas de agar refrigerado durante varios meses. Para almacenaje de más largo plazo (años), se combinan las culturas O/N con 15-50% de glicerol estéril, vortex y congelar a-70 ° C. Para preparar el glicerol estéril, utilizar una jeringa para transferir glicerol μl 300 un cryovial y un autoclave con la tapa que se afloja. Luego añadir 1.200 μL O/N levadura la cultura utilizando una técnica estéril.</li>
</ol>
4. preparar las placas sí (día 1 del ensayo)
<ol>
	<li>En un vaso estéril y utilizando una técnica estéril, diluir la levadura en el paso 3.2 a una densidad óptica de 0.065 ±0.005 610 nm (OD610) en medios de filtro esterilizado de la galactosa.<ol>
		<li>Confirmar la densidad óptica por pipeteo 120 μL de cada muestra de levadura por triplicado junto con espacios en blanco de galactosa por triplicado en una placa de poliestireno claro (placa no necesita ser estéril).  Utilice un espectrofotómetro de placa para verificar que la cultura de la levadura diluida tiene una red de OD610 de 0,065 ±0.005 restar OD610 lecturas de espacios en blanco en la galactosa de lecturas de610 OD de levadura para determinar el neto del OD610 de la levadura. Preparar un volumen final de al menos 30 levadura mL diluido por cada placa de 96 pocillos. Nota: Pueden utilizarse filtros de espectrofotómetro mide la absorbancia entre 595 y 610 nm para esta medida.</li></ol></li></ol>Un aproximado relación v: v de 1:6 de levadura: medios de comunicación produce típicamente un OD610 cerca de 0,065, así que comience agregando levadura de 4,5 mL a medios de 30 mL y agregar mas levadura o los medios de comunicación como adecuados lograr un netOD610 entre 0.060 y 0.070.
	
	
	<li>Utilizando una técnica estéril, añadir esta suspensión de levadura diluidos a los pocillos de una estéril, polipropileno, microplacas de 96 pocillos según el diseño de la placa (figura 1). Durante el pipeteo, mantenga la fuente de levadura suspendida por continuamente girando el recipiente o mezclar con la pipeta. Para este paso, es útil usar una pipeta de repetición con la punta de una jeringa estéril. Nota: Las placas de polipropileno son esterilizadas por autoclave dos apiladas las placas envueltas en papel de aluminio.  La placa superior sirve como una tapa para la placa de la muestra y puede ser lavado, re-autoclave y reutilizado.</li>
	<li>Añadir 120 μl galactosa esterilizado por filtro de los medios de comunicación a 3 pozos adicionales (H10 - 12) según el diseño de la placa (figura 1). Estos pozos sirven como controles de medios para tener en cuenta la absorción por los medios de comunicación solo.</li>
	<li>Construir una curva estándar en cada placa por dilución en serie triplicados de las normas de trabajo de E2 (227.5 nM de ERα, 9.75 nM de ERβ) en los pozos que contiene la suspensión de levadura (A1 - G3) según el diseño de la placa (figura 1).  Comience por añadir 5 μl de los estándares de E2 en los pocillos A1 a A3. Mezclar el contenido del pocillo mediante pipeteo y luego diluir en serie esta suspensión moviendo 205 μl de pozos A1 - 3 en los pocillos B1 - 3. Repetir la mezcla y la transferencia de 205 μl a través fila G. Nota: Después de la dilución serial, deseche 205 μL de pozos G1 - 3. Al final de este paso, todos los pozos estándar deben contener 120 μL. La dilución seriada permite obtener las concentraciones finales de E2 enumeradas en la tabla 1. Para los pasos de dilución seriada, es útil usar una pipeta multicanal con puntas estériles.</li>
	<li>Añadir 5 μl de vehículo (etanol al 50%) a los pocillos de control del vehículo que contiene la suspensión de levadura (H1 - 3) según el diseño de la placa (figura 1). Nota: Pozos de control de vehículos se utilizan para cuantificar la absorbancia de fondo asociada a medios de comunicación y las células de levadura. Además, citotoxicidad o crecimiento promover efectos de prueba de las muestras pueden detectarse mediante la comparación de los valores de OD610 de prueba de pozos con los pocillos de control del vehículo.</li>
	<li>Añadir 5 triplicados μl de las muestras y los controles negativos de extracción para pozos que contiene la suspensión de levadura según el diseño de la placa (figura 1). Nota: Tome nota de que muestras o controles negativos de extracción se añaden a cada pocillo.  Seguimiento de que wells tienen muestras y que no, comenzar con una nueva caja de consejos y utilice sugerencias desde los mismos lugares en el cuadro que las ubicaciones de los pozos correspondientes en la placa. Una placa de 96 pocillos para alojar hasta 23 muestras por triplicado.</li>
	<li>Mezcle el contenido de la muestra, control de extracción, pozos de control de vehículos mediante pipeteo. Ajustar los volúmenes de estos pozos a 120 μl quitando 205 μl de cada uno como se describe en la leyenda de la figura 1.</li>
	<li>Selle la placa con una capa estéril, adhesiva y porosa. Etiqueta de las placas e incubar de 17 h a 30 ° C. La placa no necesita agitarse durante la incubación</li>

5. proceso sí placas (día 2 del ensayo)
<ol>
	<li>Después de la 17 h de incubación a 30 ° C, quitar las placas de la incubadora. Si las placas se procesarán inmediatamente, proceda al paso 5.1.1. Si las placas se procesarán en una fecha posterior, proceda al paso 5.1.2.<ol>
		<li>Utilice una pipeta multicanal para mezclar el contenido de cada fila de pozos y entonces transfiera 50 μl de suspensión de levadura de cada pozo el correspondiente pozo de una microplaca clara, poliestireno, 96-well. Nota: Las placas de poliestireno no necesita ser estéril pero deben tener una tapa. Use puntas de pipeta nueva para cada fila de pozos para evitar Cruz-contaminar pozos, aunque si pipeteo en triplicado con una pipeta multicanal de 8 puntas, puntas sólo necesitan cambiar entre sistemas por triplicado.<ol>
			<li>Etiqueta de la nueva placa. Continúe con el paso 5.2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Para almacenar las placas antes de procesar, envuélvalos en papel plástico. Refrigere envueltas placas a 4 ° C para 6 d. después, sacar las placas de la nevera, les saque y transferir el contenido de todos los pozos mediante pipeteo como en el paso 5.1.1. Continúe con el paso 5.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Añadir 20 μl de DTT de 1 M a 20 mL de tampón de LacZ temperatura descongelado, para una concentración final de 1 mM TDT. Buffer de mezcla LacZ bien. Si con una pipeta multicanal, dispensar en un reservorio de reactivo. PRECAUCIÓN: Use guantes y trabajar con TDT en una campana, si es posible</li>
	<li>Usando ya sea una pipeta multicanal o pipeta de repetición, añadir 200 μL de tampón de LacZ que contienen TDT y ONPG o CPRG en todos los pocillos de la placa de poliestireno e inmediatamente Mida y registre el OD610 de todos los pozos utilizando un espectrofotómetro de placa. Repita según sea necesario para las placas adicionales. Nota: Las lecturas de OD610 se utilizan en el denominador del cálculo del LacZ (paso 6.1). Por este motivo, obtener la lectura inmediatamente después de su uso y antes de colocar las células o son sometidas a lisis por buffer de LacZ. Si OD610 valores para pozos de muestra son notablemente superior o inferior de los valores de OD610 para pocillos de control del vehículo, los extractos de muestra son promover el crecimiento o citotóxico a levadura, respectivamente. El LacZ cálculo corregirá para pequeñas diferencias en las densidades de célula a través de pozos, pero si las diferencias superan el 30% en cualquier dirección, entonces diluir la muestra reconstituida (del paso 2.6) en etanol al 50% adicional y vuelva a probar la muestra volviendo al paso 3.2 12.</li>
	<li>Placas con una tapa. Incube las placas que contienen levadura que expresa ERα14 a 30 ° C durante 40 minutos (de ONPG) o 3 h (para CPRG). Incube las placas que contienen levadura que expresa ERβ14 a 30 ° C durante 70 min (ONPG) o 4 h (para CPRG). Nota: Cuando se trabaja con CPRG, tiempos de incubación son flexibles; Incubar durante 2-4 h produce resultados adecuados con los receptores, con incubaciones más aumentando la sensibilidad del ensayo.</li>
	<li>Después de incubar las placas, utilice una pipeta multicanal o pipeta de repetición para agregar 100 μl de carbonato de sodio a cada pocillo. Carbonato de sodio eleva el pH y detiene la reacción de la β-galactosidasa.</li>
	<li>Mida y registre el OD405 (de ONPG) o OD574 (para CPRG) de todos los pozos utilizando un espectrofotómetro de placa.</li>
</ol>
6.Calcular valores de LacZ
Nota: Valores de LacZ cuantificar el grado de cambio de color para cada muestra y ofrecer un método normalizado de comparar valores entre ensayos separados por la contabilidad de varias variables (p. ej., densidad óptica levadura, densidad óptica media e incubación tiempo si Esto difiere entre pozos en la misma placa)12.
<ol>
	<li>Calcular medios triplicados OD610 valores de los medios de comunicación (galactosa) pocillos de control (H10-12) y calcular medios de triplicado OD405 o OD574 valores para el control del vehículo (etanol al 50%) (H1-3). Utilizar estos medios y el tiempo de incubación (t) en horas de la placa para cambiar color (paso 5.5) para calcular valores de LacZ (correspondiente al grado de cambio de color en cada pocillo) para todo el estándar y muestra los pozos utilizando las siguientes ecuaciones: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq1.jpg"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq2.jpg">
	<ol>
		<li>Por otra parte, la aplicación automatizada en el Apéndice 1 para calcular valores de LacZ para estándares y muestras. Nota: El diseño de la placa con la aplicación debe ser idéntico en el diseño del plato presentado en la figura 1. Si algunos pozos de muestra no se utiliza, mantener lecturas de absorbancia de los pocillos vacíos como los titulares de lugar en el conjunto de datos de absorbancia se pega en la aplicación de LacZ Apéndice 1 .  Esto conserva la disposición espacial de la placa en la aplicación y asegura que pozos de control de los medios de comunicación están en la posición requerida.  Además, la aplicación no se ejecutará si hay celdas vacías.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcular medios de valores de LacZ por triplicado para cada muestra y cada estándar E2. Informe valores LacZ como μl-1h-1. Transformación de registro de las concentraciones de cada E2 estándar y generar un documento de hoja de cálculo con formato del fichero de template.csv (Apéndice 2).</li>
</ol>
7. interpolar muestras equivalentes de Estradiol (EEQs) mediante regresión logística 4 parámetros
Nota: EEQs se relacionan con valores de LacZ muestra (cambio de color) los valores de LacZ de la curva estándar con E2. EEQs así determinar cuánto muestra es necesaria para obtener la misma respuesta de cambio de color como una concentración conocida de E2.
<ol>
	<li>Para calcular el EEQs de las muestras de prueba, primero trazar la curva estándar. Ajuste valores LacZ E2 normas (eje y) y el registro-transformada E2 concentraciones correspondientes (eje x) a un modelo de regresión logística de cuatro parámetros.</li>
	<li>Usar el modelo para EEQs de interpolar para valores de LacZ de la muestra de prueba. Llevar a cabo cálculos de regresión logística de EEQs utilizando software estadístico, como se indica en el Apéndice 2.</li>
</ol>
8. normalización EEQs (ng/mL) a la masa de la muestra de PCP
<ol>
	<li>EEQs se relaciona con la cantidad de muestra de la PCP a cada bien en el paso 4.5, EEQ (ng/mL) se multiplican por el volumen total plateado en los pocillos de la muestra (325 μL) y entonces dividir por el volumen de muestra extraído agregó a cada pozo (5 μl). Nota: Estos valores representan EEQ por mL de muestra extraída. Si las muestras se prepararon con 1 g de PCP, estos valores representan también EEQ por gramo de PCP (ng/g). Expresado de esta manera, valores EEQ (ng/g) pueden ser comparados a través de diferentes valores de PCP. EEQ (ng/g) para los productos de cuidado personal probados en este estudio se muestran en la tabla 2, y muestra datos recogidos en todo el conjunto del protocolo están incluidos en Apéndice 3.</li>
</ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+alcohol+tolerance+of+yeasts.">Studies on the alcohol tolerance of yeasts.</a> J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).</li><li>Schug, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+endocrine+disruption+out+of+the+next+generation+of+chemicals.">Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals.</a> Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El sí es un método de bajo costo para detectar ligands estrogénicas en muestras ambientales, tales como agua, alimentos, tejidos vegetales o productos de cuidado personal. Datos presentados aquí compara 2 receptores de estrógeno (ERα y ERβ), 2 soportes (ONPG y CPRG) y líneas de 2 tiempo (d 2 protocolo sin refrigeración) y Protocolo de siete días con refrigeración para medir estrogenicity en productos de cuidado personal mediante el análisis de sí. 7 d, protocolo refrigerado utilizando CPRG y levaduras expresando ERα y ERβ mejor cuantifica EEQs mientras que también siendo compatible con las limitaciones de tiempo impuestas por cursos de laboratorio de pregrado que cumplen sólo una vez / semana durante varias horas. De hecho, en comparación con el ensayo de 2 d sin refrigeración, se asoció con menor varianza el ensayo refrigerado de siete días a través de réplicas de la placa. Además, la parte lineal de la curva estándar se amplió levemente para datos recopilados usando el ensayo refrigerado. La parte lineal de la curva estándar define el rango de detección del ensayo y es la única porción de la curva estándar que puede utilizarse para interpolar muestras EEQs.
En todos sino una de las muestras en examen, EEQs con CPRG fueron menores a los cuantificados con ONPG. Con un mayor coeficiente de extinción y baja Km y Vmax, CPRG es diez veces más sensible que el ONPG17. Así, CPRG puede ser utilizado en concentraciones más bajas y puede utilizarse para detectar cantidades menores de la β-galactosidasa. Por estas razones, CPRG se prefiere generalmente sobre ONPG18,19. Sin embargo, una mayor sensibilidad de sustrato no explica los valores más bajos de la EEQ detectaron en la CPRG. Los valores más altos de la EEQ con ONPG podrían ser debido a interferencia de la matriz con el análisis, según lo observado por otros autores2,18. Pigmentos amarillos de extractos de productos de cuidado personal podrían inflar valores EEQ con ONPG. Otros han eludido este problema al incluir controles de pigmento en su diseño experimental2, un enfoque que duplica el número de placas en un experimento. Cuando interferencia de matriz puede ser problemático, CPRG puede ser un sustrato preferible para el análisis de sí, aunque es más caro y requiere tiempos de incubación más largo que el ONPG. Además, el cambio de color inducido por el clivaje del sustrato por β-galactosidasa es más dramático con CPRG, haciéndolo más fácil para los estudiantes a visualizar los resultados.
Miller et al. (2010), que la levadura utilizada en el presente Protocolo de ingeniería, señaló que la levadura que ERβ fueron más sensibles al 17β-estradiol que levadura expresión ERα, una constatación verificada por nuestros datos14x 30. Aparte de posibles matices en la construcción de plásmidos, Miller et al. (2010) no podría explicar esta diferencia en sensibilidad14. Una diferencia entre las dos construcciones de plásmido es que la expresión ERα es regulada por galactosa, mientras que ERβ expresión está regulada por glucosa o galactosa. La levadura utilizada en el ensayo sí son cultivadas en medios de la glucosa y sólo galactosa diluyendo al comienzo del ensayo. Por lo tanto, levadura expresando ERβ podría acumular más altos números de copia de proteínas del receptor antes del inicio de la prueba, de tal modo que confiere mayor sensibilidad a ligandos estrogénicas.
La menor sensibilidad de levaduras expresando ERα puede explicar las tasas más altas de la no detección de estrogenicity en muestras con ERα comparado con ERβ. Para aumentar la probabilidad muestra EEQs se detectarán, los usuarios podrían emplear métodos y disolventes de extracción diferentes o añadir mayores volúmenes de muestra a la levadura. Si se utilizan volúmenes mayores de muestra, las concentraciones de E2 normas deben ajustarse tal que el mismo volumen de muestras y estándares se puede utilizar en el ensayo. Una limitación de la adición de la muestra más es que la levadura puede tolerar solamente 6-10% de etanol, con mejor tolerancia a temperaturas de incubación de 30 y 35 ° C20. Para controlar para los efectos del etanol en levadura, los investigadores deben añadir pozos "de la levadura sólo" por triplicado para el diseño de la placa y confirmar que OD610 de estos pozos "de la levadura sólo" es comparable a OD610 de pozos de control de vehículo inmediatamente después de la adición de tampón de LacZ. Alternativamente, las muestras disueltas en etanol pueden añadirse para placas de pocillos seco y etanol evaporado apagado antes de añadir la levadura. Dimetilsulfóxido (DMSO) se utiliza también como ensayos de un solvente de la muestra en sí, pero la concentración final de trabajo de DMSO con levadura debe ser limitada a 1%12.
El ensayo sí es una herramienta de detección de gran alcance para la detección de estrogenicity en muestras ambientales. Específicamente, el sí detecta ligandos que se unen a los receptores estrogénicos nucleares que interactúan con elementos de la respuesta de estrógeno a gene expresión14. Sin embargo, sí tiene importantes limitaciones. El sí no detecta EEs que funcionan a través de mecanismos no nucleares como receptores de estrógeno de la membrana o mecanismos que involucran elementos adicionales tales como factores de transcripción activador de proteína 1 (AP-1). Por otra parte, porque la levadura no tienen la misma capacidad metabólica como células de mamífero, el sí no puede detectar ligands que requieren activación metabólica para ser estrogénico.
Además, el análisis de sí no puede fácilmente distinguir entre ligandos estrogénicos y anti-estrogenic en muestras complejas. En cambio, mide estrogenicity neto , que es el efecto de la suma de los ligandos estrogénicos y anti-estrogénicos. Para cuantificar la concentración de los antagonistas de la ER o evaluar la actividad inhibitoria de las mezclas, el ensayo puede ser modificado por incubación de levadura con el agonista estándar (17β-estradiol) y una gama de prueba muestra concentraciones12. Este proceso determina si los antagonistas en las muestras pueden disminuir la actividad de reportero inducida por el agonista y proporciona una pantalla útil para identificar la presencia de antagonistas de la ER en las muestras.
El protocolo presentado aquí puede acomodar una variedad de tipos de muestra, aunque algunas muestras pueden requerir modificaciones en los pasos de preparación de la muestra y extracción. Por ejemplo, EEQs variadas ampliamente entre réplicas de algunos productos de cuidado personal. Las muestras más variables tienden a contener las gotitas de aceite o de lo contrario no eran completamente homogéneas, lo que indica que un disolvente más lipofílico como el éter dietílico sería útil. Por otra parte, los aceites y la cera en productos de cuidado personal podrían ser excluidos mediante la extracción de las muestras con etanol al 50% en lugar de etanol 100%.Una extracción de etanol 50% también capturará más ligandos estrogénicos solubles en agua (por ejemplo, algunos pigmentos). Sin embargo, 50% de etanol se evapora más lentamente que el 100% de etanol y así puede extender el tiempo de extracción. Además, algunas muestras (por ejemplo jabones) fueron citotóxicos para levaduras, dando como resultado mediciones de densidad celular reducida (OD610). Fox et al. (2008) sugieren que dichas muestras deben ser diluidos y a analizar si las diferencias de densidad celular superan 30% en comparación con el vehículo de pozos de control12.
Si el ensayo sí es usado para fines de investigación analítica, curvas de dilución de pooles pueden probarse para determinar preventivamente adecuados volúmenes de extracto que se añade a la levadura en el paso 4.5. Por otra parte, extractos se pueden probar simultáneamente en múltiples volúmenes (p. ej., 5 μl y 20 μl extracto agregado a la levadura en el paso 4.5) o diluciones que abarcan órdenes de magnitud (por ejemplo, 0,2 μl, 2 μl y 20 μl). «Apropiados» volúmenes de extracto son los que identifican estrogenicity haciendo coincidir valores de LacZ a lo largo de la parte lineal de la curva estándar. Optimización previene problemas causados por la adición de la muestra demasiado o demasiado poco a la levadura, como citotoxicidad, falsos negativos o estrogenicity que supere la curva estándar. Como se mencionó anteriormente, los volúmenes de las muestras y estándares E2 deben ser ajustados cuando se utilizan diferentes cantidades de ligando que levadura están expuestos a un volumen constante y la concentración de etanol o en otros vehículos a través de la placa.
A pesar de la posibilidad de falsos negativos, el ensayo sí se ha identificado como una herramienta de prueba de nivel 3 para los disruptores endocrinos por Schug et al. (2013), que desarrolló un protocolo integral en niveles de disrupción endocrina (tipo)21. Para la educación universitaria, el ensayo es valioso para la enseñanza de conceptos relacionados con la disrupción endocrina, cultivo celular, atascamiento del receptor, la actividad enzimática, genética, estadística y diseño experimental. Estudiantes que usan el ensayo también practican habilidades de laboratorio fundamental y ampliamente aplicables como la dilución en serie de normas; extracción de muestras; fabricación de soluciones; construcción e interpolando curvas estándar; cálculo de concentraciones; fabricación de soluciones; demostrando una técnica estéril; cultivo de células; identificación de variables y controles; recoger, organizar y analizar datos; construir e interpretar gráficos; y el uso de equipo de laboratorio común como micropipettors y espectrofotómetros.

La pantalla de estrógeno de levadura (YES) es ampliamente utilizado para cuantificar ligandos que imitan el estradiol (E2 o 17β-estradiol) en una variedad de matrices, incluyendo agua, tejidos vegetales, productos de consumo y alimentos1,2,3, 4. Colectivamente, estos ligandos se llaman "Los estrógenos medioambientales (EEs)." El sí fue desarrollado originalmente como un bajo costo, alternativa en vitro en vivo pruebas como análisis de lo roedor uterotrophic5,6 y la trucha de arco iris alimentación ensayo7. El objetivo de estas pruebas es determinar si un producto contiene sustancias químicas que estimulan o bloquean mecanismos dependientes de estrógenos. Detección de EEs es crítica, ya que pueden interferir con estrógenos endógenos normales de señalización, especialmente durante el desarrollo fetal. Esta interferencia compromete salud aumentando el riesgo de obesidad, infertilidad, cáncer y pérdida cognitiva8.
A pesar de la importancia de EEs y otros interruptores endocrinos a la salud pública, disrupción endocrina no es comúnmente incluido en los programas de pregrado. Esta deficiencia en parte debido a la escasez de actividades que ilustran los principios participa al mismo tiempo accesible a estudiantes de pregrado. Además, existen varias variantes del protocolo sí9,10,11,12,13, y esta diversidad hace optimización de análisis desperdiciador de tiempo para coordinadores de laboratorio no específicamente capacitados en las técnicas pertinentes. Finalmente, sí ensayos se suelen realizar más de 1 día o 2 días consecutivos con una incubación de O/N. Este momento no es compatible con el formato de cursos de pregrado laboratorio, que suelen quedar una vez / semana durante varias horas.
En respuesta a estas necesidades, este manuscrito informa un protocolo de sí 96-bien optimizado que incluye métodos de extracción de etanol para productos de Cuidado Personal (PCP)3 y a un paso de refrigeración de 6 días para acomodar reuniones semanales de laboratorio. Etanol absoluto es un solvente orgánico versátil que puede disolver una gran variedad de solutos polares y no polares. Por otra parte, es adecuado para cursos de graduación porque es fácilmente disponible, relativamente no tóxico, asequible y miscible con agua; también se evapora fácilmente sin un equipo especial. Sin embargo, el etanol no es ideal para la extracción de disruptores endocrinos fuertemente hidrofóbicas o muchos aceites y ceras, estos dos últimos ingredientes comunes en PCP. eficiencia de extracción pobre aumenta el riesgo de resultados negativos falsos. Con esta limitación en mente, investigadores deben elegir procedimientos de extracción (p. ej., extracción de etanol o extracción en fase sólida) características de la muestra de dirección y cumplir objetivos del estudio (investigación versus instrucción de pregrado).
El sí depende recombinante Saccharomyces cerevisiae creado originalmente por el Dr. Charles Miller en la Universidad de Tulane. Véase Miller et al. (2010) para un completo mapa del plásmido ingeniería14. Levadura transformada con estos plásmidos constitutivamente expresan humano ERα nuclear o ERβ (también llamado ESR1 y ESR2, respectivamente) cuando se cultiva en medios que contienen galactosa (de ERα) o glucosa o galactosa (de ERβ). Si productos químicos estrogénicos están presentes en los medios de comunicación, se unen a los receptores, creando complejos ligando-receptor que activan la expresión de β-galactosidasa (lacZ) a un nivel proporcional a la concentración de productos químicos estrogénicos. Las células de levadura son entonces lisis para liberar el β-galactosidase acumulado. El tampón de lisis contiene ONPG o CPRG, que están divididos por β-galactosidasa para producir productos de amarillos o rojos, respectivamente. Productos colorimétricos pueden cuantificarse midiendo absorbancia con un espectrofotómetro de la placa de micropocillos. El grado de cambio de color es proporcional a la concentración de ligandos estrogénicas a que estuvo expuesta la levadura.
La elección del sustrato (CPRG o ONPG) depende de las posibilidades de absorción de fondo derivados de las muestras. Por ejemplo, extractos de plantas a menudo agregará un tono amarillo a los medios de comunicación que inflan artificialmente las medidas estrogenicity si ONPG (cuantificado a 405 nm) se utiliza como sustrato para la β-galactosidasa. Con planta de extractos, CPRG (cuantificado en 574 nm) puede ser un sustrato colorimétrico más apropiado. CPRG es más caro que el ONPG pero se utiliza en una décima la molaridad. Este artículo presenta estrogenicities de PCP extractos cuantificados utilizando ONPG y CPRG.
Cuantificación de estrogenicity de muestras ambientales mediante ERα y ERβ es un enfoque más amplio que el uso de sólo uno de estos receptores. En animales, estos receptores exhiben afinidades de Unión para ligandos estrogénicos y anti-estrogénicos15, actividades reglamentarias y distribución diferencial del tejido. Por ejemplo, fitoestrógenos vegetales típicamente enlazar ERβ más fuertemente2, considerando que los productos químicos sintéticos pueden mostrar preferencia por ERα o ERβ o pueden enlazar ambos receptores igualmente bien15. Por lo tanto, atar a receptor del uno estrógeno no predice necesariamente obligatorio a la otra.
Aunque EEs se encuentran en muchos productos de consumo (p. ej., pesticidas, detergentes, adhesivos, lubricantes, plásticos, alimentos y productos farmacéuticos), así como las plantas, los datos presentados se obtuvieron mediante una selección de PCP. PCP son convincentes, fácilmente disponible, económico y ambientalmente relevantes para estudiantes de pregrado. Los estudiantes pueden invitados a traer su PCP favorito de su casa para probar en el laboratorio. También puede buscar la base de datos profunda de la piel desarrollado por el grupo de trabajo ambiental16 para generar comparaciones basadas en la hipótesis de PCP con alta y baja puntuación de toxicidad. De esta manera, los estudiantes pueden simultáneamente habilidades avanzados de laboratorio; participar en el aprendizaje autodirigido, basado en la investigación; y temas emergentes en ciencias ambientales y salud.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex Mixer (for single or multiple tubes)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-215-365</td>
			<td >Any mixer will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bucket centrifuge</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >75-063-839</td>
			<td >Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bunsen burner</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >17-012-823</td>
			<td >Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >50125590H</td>
			<td >Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate reader</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >EPOCH2</td>
			<td >A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gen5 microplate reader and imager software</td>
			<td >BioTek (www.biotek.com)</td>
			<td >GEN5</td>
			<td >Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerator</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05LREEFSA</td>
			<td >Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipettor or PipetAid compatible with 1-10 ml serological pipets</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-681-15E</td>
			<td >Any pipettors will suffice if they are compatible with 1- and 10-ml serological pipets.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144562G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F144565G</td>
			<td >Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 multichannel pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FBE1200300</td>
			<td >Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 to 205 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164001G</td>
			<td >Must be able to deliver 100-320 &#181;l; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Supplies</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15-ml conical tubes with caps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >05-539-801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass scintillation vials</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >03-337-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (non-sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12565501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid&#160;</td>
			<td >Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td>
			<td >EW-01728-81</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 ml glass beakers</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-539H</td>
			<td >Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 ml glass Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td>FB500250</td>
			<td >Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, adhesive, porous film&#160;</td>
			<td >VWR (www.vwr.com)</td>
			<td >60941-086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metal forceps</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >12-000-157</td>
			<td >Any metal forceps will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent reservoir</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >07-200-127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration units (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >09-761-52</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Squirt bottle (for ethanol)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >02-897-10</td>
			<td >Any laboratory squirt bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclavable storage bottles</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >06-414-1D</td>
			<td >Any autoclavable glass storage bottles will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27F</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 ml glass serological pipets (sterile)</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >13-678-27C</td>
			<td >Any glass serological pipets will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P10 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-3810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P200 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-8810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >P300 micropipettor tips</td>
			<td >USA Scientific (www.usascientific.com)</td>
			<td >1120-9810</td>
			<td >Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe tips for repeating pipettor</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >F164150G</td>
			<td >Only required if a repeating pipettor is used.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile petri dishes</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >FB0875712</td>
			<td >Any sterile petri dishes will suffice.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td>
			<td >S37440</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g. W303a)</td>
			<td >American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)</td>
			<td >MYA-151</td>
			<td >Recombinant yeast are also available upon request from the authors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#945;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Receptor/reporter plasmid for ER&#946;</td>
			<td >Addgene (www.addgene.org)</td>
			<td >pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chemicals</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Difco agar</td>
			<td >BD (www.bd.com)</td>
			<td >214530</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dithiothreitol</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >D0632</td>
			<td >CAUTION:&#160; Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.&#160; Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >N1127</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >10884308001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast nitrogen base</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>Y0626</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glucose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G8270</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Galactose</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >G5388</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine sulfate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >A9126</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uracil</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >U0750</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leucine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Histidine</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >H8000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >17 &#946;-Estradiol&#160;</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MP Biomedicals&#160;</td>
			<td >E8875-250 mg&#160;&#160;&#160;&#160; 0219456401 - 1 mg</td>
			<td >CAUTION:&#160; Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.&#160; It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.&#160; Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.&#160; Estradiol is very toxic to aquatic life.&#160; Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.&#160; Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% ethanol</td>
			<td >Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td>
			<td >111000200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S9638</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate dibasic (anhydrous)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S0876</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >M8266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >P9333</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >L5125</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium carbonate</td>
			<td >Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td >S7795</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Excel spreadsheet software</td>
			<td >Microsoft&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Java software (required for Appendix 1 application)&#160;</td>
			<td >Oracle Corporation</td>
			<td ></td>
			<td >To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.&#160; LacZ results created by the application can be copied by pressing &#34;control (ctrl) + c&#34; on PC keyboards, or &#34;command + c&#34; on Mac keyboards.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JMP statistical software version 13.0.0</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td ></td>
			<td >Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.&#160; The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >R statistical computing and graphics software</td>
			<td >R Foundation</td>
			<td ></td>
			<td >Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.&#160; Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting estrogenic ligands in personal care products using a yeast estrogen screen optimized for the undergraduate teaching laboratory

La pantalla de estrógeno de levadura (YES) se utiliza para detectar ligands estrogénicas en muestras ambientales y ha sido ampliamente aplicado en los estudios de disrupción endocrina. Ligandos estrogénicos incluyen tanto naturales como provocados por el hombre "los estrógenos medioambientales" (EEE) en muchos bienes de consumo, incluyendo productos de Cuidado Personal (PCP), plásticos, plaguicidas y alimentos. EEs interrumpen hormona de señalización en los seres humanos y otros animales, potencialmente reduciendo la fertilidad y aumento de riesgo de la enfermedad. A pesar de la importancia de EEs y otros químicos interrupción endocrina (EDCs) para la salud pública, disrupción endocrina por lo general no está incluido en los programas de pregrado. Esta deficiencia en parte debido a la falta de actividades de laboratorio relevantes que ilustran los principios participa al mismo tiempo accesible a estudiantes de pregrado. Este artículo presenta una optimizada sí para la cuantificación de ligandos en productos de cuidado personal que se unen de estrógenos receptores alfa (ERα) o beta (ERβ). El método incorpora uno de los dos sustratos colorimétricos (Orto- nitrofenil-β-D-galactopiranosida (ONPG) o clorofenol rojo-β-D-galactopiranosida (CPRG)) que están divididos por β-galactosidasa, una incubación de 6 días refrigerada paso a facilitar el uso en cursos de pregrado laboratorio, una aplicación automatizada para cálculos de LacZ y código de R para el análisis de regresión logística de 4 parámetros asociados. El protocolo ha sido diseñado para permitir a estudiantes a desarrollar y llevar a cabo experimentos en que pantalla de productos de su elección para imitadores de estrógeno. En el proceso, aprenden sobre la disrupción endocrina, cultivo celular, atascamiento del receptor, la actividad enzimática, genética, estadística y diseño experimental. Al mismo tiempo, también practican destrezas de laboratorio fundamental y ampliamente aplicables, tales como: cálculo de concentraciones; fabricación de soluciones; demostrando una técnica estéril; dilución en serie de normas; construcción e interpolando curvas estándar; identificación de variables y controles; recoger, organizar y analizar datos; construir e interpretar gráficos; y el uso de equipo de laboratorio común como micropipettors y espectrofotómetros. Por lo tanto, aplicar este ensayo anima a los estudiantes a participar en el aprendizaje basado en la investigación mientras que la exploración de cuestiones emergentes en ciencias ambientales y salud.

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Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Este artículo presenta una pantalla de estrógeno levadura optimizado para la cuantificación de ligandos en productos de Cuidado Personal (PCP) que se unen de estrógenos receptores alfa (ERα) o beta (ERβ). El método incorpora dos opciones de sustrato colorimétrico, una incubación refrigerada de seis días para su uso en cursos de pregrado y herramientas estadísticas para análisis de datos.

Detección de ligandos estrogénica en productos de Cuidado Personal con una pantalla de estrógeno levadura optimizado para el laboratorio de enseñanza de pregrado

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

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