Name: real-time iontophoresis with tetramethylammonium to quantify volume fraction and tortuosity of brain extracellular space
Uploaded: 2017-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space at JoVE.com

Le travail a été soutenu par NIH NINDS subvention R01 NS047557.

Toutes les procédures animales, utilisées pour obtenir des échantillons de tissus, ont été approuvées par le comité d&#39;éthique animale au SUNY Downstate Medical Center. 1. Préparation des solutions et de l&#39;équipement <ol><li> Préparez une solution de remplissage de NaCl 150 mM pour le baril de référence de l&#39;ISM. Rangez-le dans une seringue de 10 mL attachée à un filtre de 0,22 μm (pour éliminer les bactéries ou les particules). </li><li> Préparez une solution...

<ol>
	<li>Sykova, E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+brain+extracellular+space.">Diffusion in brain extracellular space.</a> Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).</li><li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+related+transport+mechanisms+in+brain+tissue.">Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue.</a> Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).</li><li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment.">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).</li><li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum.">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li><li>Nicholson, C., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+space+structure+revealed+by+diffusion+analysis.">Extracellular space structure revealed by diffusion analysis.</a> Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).</li><li>Xie, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain.">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li><li>Hrabetova, S., Nicholson, C., Michael, A. C., Borland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+of+brain+extracellular+space+explored+with+ion-selective+microelectrodes,+integrative+optical+imaging+and+related+techniques.">Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques.</a> Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience. , 167-204 (2007).</li><li>Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+and+heterogeneous+diffusion+in+the+turtle+cerebellum:+implications+for+volume+transmission.">Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission.</a> J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).</li><li>Vargova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+parameters+of+the+extracellular+space+in+human+gliomas.">Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas.</a> Glia. 42 (1), 77-88 (2003).</li><li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-barreled+and+concentric+microelectrodes+for+measurement+of+extracellular+ion+signals+in+brain+tissue.">Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li><li>Xiao, F., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarged+extracellular+space+of+aquaporin-4-deficient+mice+does+not+enhance+diffusion+of+Alexa+Fluor+488+or+dextran+polymers.">Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers.</a> Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).</li><li>Sherpa, A. D., Pvan de Nes, ., Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliotoxin-induced+swelling+of+astrocytes+hinders+diffusion+in+brain+extracellular+space+via+formation+of+dead-space+microdomains.">Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains.</a> Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).</li><li>Kume-Kick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independence+of+extracellular+tortuosity+and+volume+fraction+during+osmotic+challenge+in+rat+neocortex.">Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex.</a> J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).</li><li>Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+diffusion+in+laminar+brain+structures+exemplified+by+hippocampus.">Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).</li><li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+use+of+high-speed,+concentric+H+-+and+Ca2+-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording.">Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).</li><li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+from+an+injected+volume+of+a+substance+in+brain+tissue+with+arbitrary+volume+fraction+and+tortuosity.">Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity.</a> Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).</li><li>Nicholson, C., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+diffusion+of+high+molecular+weight+compounds+in+brain+extracellular+microenvironment+measured+with+integrative+optical+imaging.">Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging.</a> Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).</li><li>Thorne, R. G., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+diffusion+analysis+with+quantum+dots+and+dextrans+predicts+the+width+of+brain+extracellular+space.">In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).</li><li>Wolak, D. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+macromolecules+in+the+brain:+implications+for+drug+delivery.">Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery.</a> Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).</li></ol>

<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig10.jpg" /> Figure 10: Données non idéales démontrant des problèmes techniques communs. (A) Les diagrammes de problèmes techniques communs avec iontophorèse microélectrodes: Comparaison de la libération normale de la TMA d&#39;un ionophorèse fonctionnement microélectrodes avec trois sources démontrant des problèmes techniques. [Agrandissement élevé, a1] Le courant dans une source iontophorétique...

<html> L&#39;espace extracellulaire (ECS) est le réseau de canaux interconnectés extérieurs à toutes les cellules du cerveau et contient à la fois le fluide interstitiel et la matrice extracellulaire ( Figure 1a et Figure 1b ). La distribution de nombreuses substances requises pour la fonction des cellules cérébrales, y compris les nutriments, les hormones et les neurotransmetteurs, se produit par diffusion à travers le système ECS. Les changements dans les paramètres physiques de cet espace, y compris le volume, la géométrie et la matrice extracellulaire, peuvent influer drastiquement sur la diffusion à travers l&#39;ECS et les concentrations d&#39;ions locales qui se baignent dans les cellules du cerveau, ce qui a un impact profond sur la fonction des cellules cérébrales 1 , 2 . L&#39;iontophorèse en temps réel (RTI) est utilisée pour déterminer deux caractéristiques structurelles d&#39;une région du cerveau: fraction volumique et tortuosité 3 , 4 ,&quot;Xref&quot;&gt; 5. La fraction de volume ( α ) est la proportion de volume tissulaire occupée par ECS ( V ECS ) par rapport au volume tissulaire total ( tissu V ) dans un volume élémentaire représentatif; <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq1.jpg" /> La tortuosité ( λ ) est l&#39;obstacle relatif qu&#39;une substance rencontre lors de la diffusion dans une région du cerveau par rapport à un milieu sans obstruction; <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq2.jpg" /> Où D * (cm 2 s -1 ) est le coefficient de diffusion efficace de la substance dans le cerveau et D (cm 2 s -1 ) est le coefficient de diffusion libre de la substance dans un milieu libre, tel qu&#39;un gel d&#39;agarose dilué. Aujourd&#39;hui, la substance de sondes la plus utilisée pour le RLa méthode TI est le petit cation tétraméthylammonium (TMA). Le TMA a un poids moléculaire de 74 g / mol, se dissocie complètement en solution et a une charge positive. Les études de RTI avec cette ion ont démontré que α <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 0,2 et λ <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 1.6 1 , 2 . Cela signifie que l&#39;ECS représente environ 20% du volume total du cerveau et que la diffusion d&#39;une petite molécule inerte est environ 2,5 fois plus lente dans l&#39;ECS que dans un milieu sans obstruction 3 . Cependant, α et λ varient selon l&#39;âge, la région et l&#39;état du cerveau et dans les pathologies 1 . Les modifications de ces paramètres ont été liées au développement du cerveau, au vieillissement, au sommeil, à l&#39;épilepsie et à de nombreux autres processus et maladies fondamentales du cerveau 1, 6 . Alors que d&#39;autres techniques mesurent α et λ , RTI peut mesurer à la fois dans les régions localisées du tissu vivant en temps réel. Pour cette raison, RTI est devenu un outil indispensable pour étudier les changements dans α et λ lors de défis aigus et réversibles. La théorie de RTI a été initialement validée par Nicholson et Phillips, et la technique a été largement utilisée depuis cette époque 4 , 7 . Les expériences utilisant RTI commencent par la libération d&#39;une impulsion de TMA à partir d&#39;une microélectrode source par iontophorèse dans un gel dilué d&#39;agarose. Une fois éjectés, les ions diffusent librement loin de la source ponctuelle, en choisissant d&#39;un nombre potentiellement infini de chemins aléatoires ( figure 1d ). La concentration changeante de l&#39;ion est mesurée au fil du temps à l&#39;aide d&#39;une microélectrode sélective d&#39;ions (ISM) positionnée à peu près100 μm loin ( Figure 1c ). Les changements dans la concentration de TMA sont représentés graphiquement et ajustés à une courbe qui permet le calcul de D et du nombre de transport de la microélectrode d&#39;iontophorèse (paramètres discutés dans le protocole). Avec ces valeurs, la procédure est répétée dans une région du cerveau d&#39;intérêt pour obtenir D * et pour calculer α et λ . Le contrôle de la microélectrode d&#39;iontophorèse, la collecte de données, la représentation graphique et l&#39;ajustement de la courbe de concentration de TMA et le calcul des paramètres expérimentaux sont généralement réalisés par les programmes Wanda et Walter, spécialement conçus à cet effet (le logiciel et leurs manuels sont Librement disponible auprès des auteurs sur demande). La section Protocole de cette revue décrit les procédures de base nécessaires à la conception et à l&#39;exécution de RTI dans les tranches de cerveau de rongeurs. La technique a également été utilisée en non-tigemodèles ent, notamment des tranches de cerveau humain et in vivo des préparations de cerveau 1, 4, 6, 8, 9. La section Résultats représentatifs fournit des résultats idéaux et non idéaux pour mettre en évidence les nuances de l&#39;interprétation des données. Enfin, la section de discussion couvre brièvement les techniques de dépannage, les limitations de RTI, les techniques alternatives utilisées pour étudier l&#39;ECS et les applications futures de RTI. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig1.jpg" /> Figure 1: Diagrammes de diffusion à travers ECS. (A) Schéma d&#39;ECS: Démontre la taille et l&#39; emplacement de l&#39;ECS dans une section typique du cerveau. Yellow marque le ECS entre les processus des cellules du cerveau gris. Le volume de l&#39;ECS est d&#39;environ 20% du volume tissulaire total ( c.-à-d., Fraction de volume = 0.2) dans des conditions physiologiques. ( B ) Diagramme agrandi de l&#39;ECS: met en évidence des paramètres physiques contribuant à la tortuosité, y compris la géométrie des cellules du cerveau (gris) et la matrice extracellulaire (diagrammes sous forme de maille de glycosaminoglycanes multicolores et de protéoglycans). ( C ) diagramme 3D de diffusion à partir d&#39;une source ponctuelle: démontre le mouvement net des molécules inertes d&#39;une source iontophorétique à un ISM. À l&#39;exclusion des barrières de diffusion et de l&#39;absorption cellulaire, les molécules diffusent vers l&#39;extérieur dans toutes les directions, produisant un front de concentration sphérique. L&#39;ISM quantifie la concentration locale des molécules inertes libérées par la source iontophorétique. ( D ) Simulation par ordinateur de la diffusion dans ECS du cerveau: [Extrême gauche] Configuration pour la simulation de Monte Carlo; Les sphères vertes représentent les processus des cellules du cerveau et la croix rouge représente une source ponctuelle. Cette configuration modélise le tissu cérébral diagramme de la figure 1a . [Images du milieu] 3 et6 molécules effectuant des mouvements aléatoires lorsqu&#39;elles se diffusent à travers l&#39;espace extracellulaire du cerveau, montrées en 2 dimensions. [Extrême droite] Des randonnées aléatoires de nombreuses molécules sorties de la source ponctuelle. Le mouvement net de toutes les molécules de la source ponctuelle est vers l&#39;extérieur comme représenté sur la figure 1c . Les randonnées aléatoires cumulatives décrivent les espaces entre les cellules ( c.-à -d. ECS, voir la référence 5 pour plus d&#39;explications). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55755/55755fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A/D and D/A converter</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>NI USB-6221 DAQ</td>
			<td>The NI USB-6221 is still sold as a &#39;Legacy&#39; device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>NuSieve GTG Agarose #50081</td>
			<td>to prepare dilute agarose gel for RTI measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amplifier for ISM</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier</td>
			<td>ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate theta capillary glass tubing</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811</td>
			<td>double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>brush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>University Series 233, size 0</td>
			<td>round shoft handle brush, available from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bunsen burner</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera for visualizing micropipettes</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td>requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chart recorder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp &#38; Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorotrimethylsilane, puriss., &#62; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>catalog # 92360</td>
			<td>for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Software</td>
			<td>The MathWorks</td>
			<td>MATLAB, Data acquisition toolbox</td>
			<td>for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye protective goggles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed-stage compound microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>can use other compound microscopes with fixed stages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11251-10</td>
			<td>to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#12-550A</td>
			<td>to chip microelectrode tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heater/stirrer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Corning PC-420D</td>
			<td>to prepare dilute agarose gel and stir solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iontophoretic unit</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>ION-100 and PS-100</td>
			<td>ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IE190 Potassium Ion Exchanger</td>
			<td>Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate - do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M3301EH</td>
			<td>to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td>to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microprobe thermometer</td>
			<td>Physiotemp</td>
			<td>Model BAT-12R</td>
			<td>fine probe of this thermometer is placed close to recording site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>Syringes and Needles # 305122 (25 gauge)</td>
			<td>for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5mm x 16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective 5x dry</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPlan N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective 10x water immersion</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPlan FL N</td>
			<td>10x objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic containers (with lids)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#14-375-148</td>
			<td>to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>Gibraltar Burleigh</td>
			<td>platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>porous minicup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reusable adhesive</td>
			<td>Bostik</td>
			<td>Blu-Tack</td>
			<td>for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>signal conditioning unit with low-pass filter</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>CyberAmp 320 or 380</td>
			<td>no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>#7830</td>
			<td>diameter 0.015&#34;, bare (no coating)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice chamber</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Warner Model RC-27L</td>
			<td>this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>Syringes and Needles #309604</td>
			<td>to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.22&#181;m pore</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>#6780-1302</td>
			<td>to filter backfill solutions; available from Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe needle, 28 gauge, 97mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MicroFil MF28G-5</td>
			<td>to backfill microelectrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon (=PTFE) tubing</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge)</td>
			<td>for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature control system</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Warner Models TC-344B and SH-27A</td>
			<td>TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethyammonium (TMA) chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-3411</td>
			<td>5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td>to cut brain slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylenes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X5-1</td>
			<td>for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time iontophoresis with tetramethylammonium to quantify volume fraction and tortuosity of brain extracellular space

Cette revue décrit les concepts et le protocole de base pour effectuer la méthode de l&#39;iontophorèse en temps réel (RTI), l&#39;étalon-or pour explorer et quantifier l&#39;espace extracellulaire (ECS) du cerveau vivant. L&#39;ECS entoure toutes les cellules du cerveau et contient à la fois du liquide interstitiel et de la matrice extracellulaire. Le transport de nombreuses substances requises pour l&#39;activité du cerveau, y compris les neurotransmetteurs, les hormones et les nutriments, se produit par diffusion à travers l&#39;ECS. Les changements dans le volume et la géométrie de cet espace se produisent au cours des processus cérébrales normaux, comme le sommeil, et les pathologies, comme l&#39;ischémie. Cependant, la structure et la régulation des ECS du cerveau, en particulier dans les états malades, restent largement inexplorées. La méthode RTI mesure deux paramètres physiques du cerveau vivant: fraction volumique et tortuosité. La fraction de volume est la proportion de volume tissulaire occupée par ECS. La tortuosité est une mesure de l&#39;obstacle relatif qu&#39;une substance rencontre lors de la diffusion à travers un cerveauPar rapport à un milieu sans obstruction. Dans RTI, une molécule inerte est pulsée à partir d&#39;une microélectrode source dans l&#39;ECS du cerveau. Au fur et à mesure que les molécules se diffusent loin de cette source, la concentration changeante de l&#39;ion est mesurée au fil du temps en utilisant une microélectrode sélective d&#39;ions positionnée à environ 100 μm. A partir de la courbe de diffusion résultante, on peut calculer la fraction de volume et la tortuosité. Cette technique a été utilisée dans des tranches de cerveau provenant d&#39;espèces multiples (y compris les humains) et in vivo pour étudier des modifications aiguës et chroniques à ECS. Contrairement à d&#39;autres méthodes, RTI peut être utilisé pour examiner à la fois des modifications réversibles et irréversibles de l&#39;ECS du cerveau en temps réel.

L&#39;utilité de la technique RTI est démontrée dans une expérience conçue pour mesurer les changements dans α et pendant un défi hypoosmolaire ( Figure 8 et Figure 9 ). Il a déjà été démontré que la réduction de l&#39;osmolarité de l&#39;ECS par lavage sur ACSF hypotonique produirait une diminution de α et une augmentation de λ 13 . <p class="jove_content" ...

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Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Ce protocole décrit l&#39;iontophorèse en temps réel, une méthode qui mesure les paramètres physiques de l&#39;espace extracellulaire (ECS) des cerveaux vivants. La diffusion d&#39;une molécule inerte libérée dans l&#39;ECS est utilisée pour calculer la fraction de volume ECS et la tortuosité. Il est idéal pour étudier les modifications réversibles aiguës des ECS du cerveau.

Itophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de l&#39;espace extracellulaire du cerveau

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Recherche

Neurosciences

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BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

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Électrophysiologie en temps réel: en utilisant des protocoles en boucle fermée à la sonde neuronaux Dynamics et au-delà

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Un protocole pour l’Administration de la Real-Time IRMf formation Neurofeedback

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

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Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

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Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

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