Name: in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells into functional cardiomyocyte-like cells
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells at JoVE.com

De auteurs danken de volgende personeelsleden en onderzoek personeel voor hun bijdragen: Matthew Librach, Leila Maghen Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg en Andrée Gauthier-Fisher. Dit werk werd gesteund door de The Ontario Fonds voor onderzoek inzake - Research Excellence (ORF-RE, ronde #7) en maken programma Inc.

All studies involving animals were conducted and reported according to ARRIVE guidelines48. All studies were performed with institutional research ethics board approval (REB number 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, University of Toronto, Toronto, Canada). All animal procedures were approved by the Animal Care Committee of the University Health Network (Toronto, Canada), and all animals received humane care in compliance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8...

De cardiale differentiatie van stamcellen is in ontwikkeling voor meer dan 2 decennia, met meerdere verschillende strategieën wordt gebruikt voor het genereren van cardiomyocyte-achtige cellen uit MSC bronnen. Veel van deze strategieën, echter zijn inefficiënt, en de voorwaarden gebruikt zijn vaak niet representatief voor het milieu getransplanteerde cellen ontmoeting in vivo.
In tegenstelling tot de bestaande methoden, het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van een combina...

Congestief hartfalen (CHF) blijft bestaan als een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. CHF treedt vaak op na het massale verlies van cardiomyocytes en de ontwikkeling van cel-vrije littekenweefsel als gevolg van een myocardinfarct (MI)1pathologische. Terwijl het hart een gedeeltelijk zichzelf vernieuwende orgaan is, vermindert de resident stam en progenitor cel pool verantwoordelijk voor de uitvoering van weefselregeneratie aanzienlijk in overvloed en functie in leeftijd patiënten, vaak steeds onvoldoende voor optimaal herstel na blessure. Er is dus grote belangstelling bij de ontwikkeling van experimentele behandelingen waarbij de transplantatie van cellen van de gezonde donor in het beschadigde myocardium. Het is noodzakelijk dat de donor cellen niet alleen de structuur van het weefsel herstellen, maar ook het bereiken van het functionele herstel van de getroffen myocard.
De inheemse hart hart weefsel-ingezetene werkzaam en endogene afkomstig is van het beenmerg cellen van de stam voor na letsel herstellen2,3,4. Regeneratieve cellen-host - en donor-afgeleide gelijk moet hebben de capaciteit om het verkrijgen van de juiste fenotype en functie in de communicatie van de remodelleert myocard, samen met het vermogen om efficiënt en veilig de verloren cellen vervangen. In vitro differentiatie methoden hebben is gebruikt uitgebreid tot hoogrenderende, stamcel gebaseerde cardiomyocyte productie5,6. Het profiel van de expressie van cardiale lineage markers wordt gebruikt voor het definiëren van het proces van differentiatie van de stamcel naar de cardiale lineage7. Vroege differentiatie markers, zoals NKX2.5, myocyte versterker factor 2 C (Mef2c), en GATA48,9, kunnen een indicatie van de opening van het cardiomyogenic-proces. Volwassen cardiomyocyte markeringen gebruikte om differentiatie effectiviteit te beoordelen zijn signaal regelgevende proteÃ¯ne α (SIRPA)10, cardiale troponine T (cTnT)11, zware ketting cardiale myosin (MYH6),8,,12,13en connexin 43 (Cx43)14,15,16. De methoden gebruiken van embryonale stamcellen (SER's) en pluripotente stamcellen (PSC's) zijn grondig geoptimaliseerd en besproken met betrekking tot de details van de inductieve factoren, zuurstof en voedingsstoffen verlopen, en de exacte timing van actie5,6,7,17,18. ESC - en PVC-gebaseerde technologieën presenteren echter nog steeds meerdere ethische en veiligheid zorgen, samen met suboptimaal elektrofysiologische en immunologische functies19,20. Hosts getransplanteerde met deze cellen vaak ervaren immunorejection en permanente immuunsuppressie vereisen. Dit is voornamelijk te wijten aan de grote histocompatibility complex (MHC) moleculen in de gastheer en de donor en de resulterende T-cel reactie21mismatching. Terwijl individuele MHC klasse I matching is een mogelijke oplossing, een toegankelijker klinische praktijk zou vereisen een cel bron die universeel immunoprivileged te overwinnen van de bezorgdheid van de afwijzing.
Als een bron van alternatieve cel voor gebruik in klinische toepassingen, MSCs en in het bijzonder, BMSCs, zijn onderzocht voor gebruik in weefselregeneratie sinds hun initiële beschrijving in 199522. MSCs worden verondersteld om ingezetene regeneratieve cellen die worden in bijna elke gevacuoliseerd weefsel23 gevonden kunnen. Bij isolatie van de gewenste bron, MSCs kunnen gemakkelijk worden uitgebreid in cultuur, hebben uitgebreide paracrine capaciteit, en vaak immunoprivileged of immunomodulerende eigenschappen24,25te bezitten. Hun veiligheid en de werkzaamheid hebben reeds te zien in verscheidene pre-klinische studies, met name voor cardiale regeneratie3,26.
Veel MSC differentiatie strategieën gebruik maken van farmacologische stoffen, zoals 5-azacytidine22 en DMSO27, en groei of morfogenisch factoren, zoals BMP's5,7,28,29 of angiotensine-II30, met variabele efficiëntie. Deze strategieën, zijn echter niet gebaseerd op de obstakels die een naïeve regeneratieve cel is waarschijnlijk tegenkomen na homing of wordt geleverd aan de site van letsel in vivo. Meer fysiologisch relevante strategieën, terwijl moeilijker te definiëren en manipuleren, zijn gebaseerd op de vooronderstelling dat MSC differentiatie kan worden opgewekt door middel van signalen uit het weefsel communicatie zelf. Eerdere studies hebben aangetoond dat de blootstelling aan de cardiale cel lysates31 of ventriculaire myocard32,33, of rechtstreeks contact met primaire cardiomyocytes in vitro15,34, kan de expressie van cardiale markers in MSCs verhogen. Anderen hebben aangetoond dat spontane cardiomyogenesis na behandeling van cardiale letsel met MSCs35,36,,37,38, hoewel gedeeltelijk, de fusie van BMSCs en cardiomyocytes39,40 het ontluikende myocardium gegenereerd. Om onze kennis, hebben functionele, spontaan aanbestedende cardiomyocytes van menselijke MSCs (hMSCs) van elke bron weefsel nog niet is gerapporteerd.
De huidige consensus is dat alle MSCs uit gerelateerde cellen23 voortvloeien. Young MSCs met pericyte eigenschappen kunnen worden geïsoleerd uit de regio gerelateerde van menselijke navelstreng weefsel41,42,43. In vergelijking met BMSCs bezitten HUCPVCs meer differentiatie potentiële en verschillende andere regeneratieve voordelen, zowel in vitro41,44 en in vivo45,46,47. Met name hebben de bron wordt de moeders-foetale interface, HUCPVCs aanzienlijk lager immunogeniciteit in vergelijking met volwassen bronnen van MSCs. Ons onderzoek richt zich op de karakterisering en de pre-klinische toepassingen van FTM HUCPVCs, de jongste bron van MSCs onderzocht, die wij hebben eerder getoond te zijn toegenomen proliferatieve en hogere multilineage differentiatie capaciteiten, met inbegrip van de cardiomyogenic afstamming41.
Hier presenteren we een protocol die totale vorming en primaire cardiale cel feeder lagen combineert zoals inductieve krachten te bereiken van de differentiatie van de volledige cardiomyogenic van MSCs. aggregaten leveren een 3D-omgeving, die beter voorwaarden in vivo in vergelijking met 2D aanhangend culturen modellen. Met behulp van cardiale feeder lagen biedt een omgeving die representatief is voor de site van de ultieme transplantatie voor de MSCs. We laten zien dat jongere bronnen van MSCs geïsoleerd van pre- of postnatale umbilical koorden een hogere capaciteit formulier aggregaten en hebben te bereiken van de cardiale fenotype in vergelijking met volwassen BMSCs, terwijl nog het handhaven van hun immuun-voorrecht. Naast de steile verhoging van markers van cardiale bloedlijn en de geïnduceerde expressie van intracellulaire (dat wil zeggen, cTnT en MYH6) en celoppervlak eiwitten (dat wil zeggen, SIRPA en Cx43) specifiek voor cardiomyocytes, we laten zien dat het potentieel van de differentiatie van FTM HUCPVCs met deze methode kan worden aangewend en dat zij aanleiding geven kunnen tot spontaan verdragsluitende cardiomyocyte-achtige cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td style="width:299px;">For cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Alpha-MEM</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td>12571071</td>
			<td style="width:299px;">For HUCPVC and BMSC culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody</td>
			<td style="width:203px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">313612</td>
			<td style="width:299px;">Integrin marker for FC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody</td>
			<td style="width:203px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">FAB7737A</td>
			<td style="width:299px;">Connexin 43 marker for FC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">FITC-conjugated HLA-A2 antibody</td>
			<td style="width:203px;">Genway Biotech Inc.</td>
			<td style="width:119px;">GWB-66FBD2</td>
			<td style="width:299px;">Immunogenicity marker for FC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody</td>
			<td style="width:203px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab7904</td>
			<td style="width:299px;">Immunogenicity marker for FC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody</td>
			<td style="width:203px;">AbD Serotec/Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MCA2518F</td>
			<td style="width:299px;">Cardiac marker for FC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody</td>
			<td style="width:203px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">FAB3195A</td>
			<td style="width:299px;">Human cell marker for FC and FACS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody</td>
			<td style="width:203px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">FAB3195F</td>
			<td style="width:299px;">Human cell marker for FC and FACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Anti-connexin 43/GJA1 antibody</td>
			<td style="width:203px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab11370</td>
			<td style="width:299px;">Cx43. For ICC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A-21428</td>
			<td style="width:299px;">For ICC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody</td>
			<td style="width:203px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab9465</td>
			<td style="width:299px;">aSARC. For ICC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:297px;">Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21426</td>
			<td style="width:299px;">For ICC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody</td>
			<td style="width:203px;">New England BioLabs Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">5030S</td>
			<td style="width:299px;">For ICC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A-21206</td>
			<td style="width:299px;">For ICC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody</td>
			<td style="width:203px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB1281</td>
			<td style="width:299px;">For ICC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MZ9.5 Stereomicroscope</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:299px;">For imaging aggregates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">1.5 ml centrifuge microtubes</td>
			<td style="width:203px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:299px;">For staining MSCs with fluorescent dye.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:299px;">Open source image processing software.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aria II&#160;</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:299px;">UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bone marrow mesechymal stromal cells</td>
			<td style="width:203px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">PT-2501</td>
			<td style="width:299px;">BMSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7030-100G</td>
			<td style="width:299px;">BSA. To prepare solutions for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:297px;">BrdU</td>
			<td style="width:203px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB3424</td>
			<td style="width:299px;">Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Canto II</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:299px;">UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">cDNA EcoDry Premix</td>
			<td style="width:203px;">Clontech/Takara</td>
			<td style="width:119px;">639570</td>
			<td style="width:299px;">For preparation of cDNA for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C7025</td>
			<td style="width:299px;">Fluorescent imaging of cell cytoplasm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Countess automated cell counter</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
			<td style="width:299px;">For cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6421</td>
			<td style="width:299px;">For rat primary cardiomyocyte culture medium.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:299px;">D-PBS, without Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">EVOS</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:299px;">In-house fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">FACSCalibur</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:299px;">In-house. For flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Fetal bovine serum (Hyclone)</td>
			<td style="width:203px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">SH3039603</td>
			<td style="width:299px;">FBS. Component of cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:297px;">IDT Prime Time qPCR probes</td>
			<td style="width:203px;">Integrated Data Technologies</td>
			<td style="width:119px;">FAM fluorophore</td>
			<td style="width:299px;">http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium</td>
			<td style="width:203px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">TA-030-FM</td>
			<td style="width:299px;">For storage of cells to undergo ICC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">LSR II&#160;</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:299px;">UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MoFlo Astrios</td>
			<td style="width:203px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:299px;">UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:203px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">5425S</td>
			<td style="width:299px;">NGS. Used in blocking solution for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:119px;">155409</td>
			<td style="width:299px;">To prepare samples for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:297px;">OmniPur Triton X-100 Surfactant</td>
			<td style="width:203px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">9410-OP</td>
			<td style="width:299px;">As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade</td>
			<td style="width:203px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td style="width:299px;">For fixing cells for ICC.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td style="width:299px;">Component of cell culture medium.</td>
		</tr>
		<tr height="110">
			<td height="110" style="height:110px;width:297px;">Primers</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 &#956;mol</td>
			<td style="width:299px;">CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Quorum Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:203px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:299px;">SickKids Imaging Facility</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes</td>
			<td style="width:203px;">ReproCell</td>
			<td style="width:119px;">RCD001N</td>
			<td style="width:299px;">Positive control for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">RNeasy mini kit</td>
			<td style="width:203px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74106</td>
			<td style="width:299px;">To isolate RNA for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit</td>
			<td style="width:203px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">204074</td>
			<td style="width:299px;">For qPCR with master mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td>A1049101</td>
			<td style="width:299px;">For MSC, monocyte coculture medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TaqMan qPCR primer assays</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4444556</td>
			<td style="width:299px;">For qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T10282</td>
			<td style="width:299px;">Staining of cells for viability and counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Trypsin</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td>272500108</td>
			<td style="width:299px;">For cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Volocity</td>
			<td style="width:203px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Volocity 6.3</td>
			<td style="width:299px;">Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">0.2 &#956;m pore filter</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">566-0020</td>
			<td style="width:299px;">For sterilizing tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:297px;">HERAcell 150i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51026410</td>
			<td style="width:299px;">For incubating cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:299px;">PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:203px;">Almedic</td>
			<td style="width:119px;">7727-A10-704</td>
			<td style="width:299px;">For handing rat heart. Can use any similar forceps.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Scissors</td>
			<td style="width:203px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14059-11</td>
			<td style="width:299px;">For mincing rat heart. Curved scissors recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:297px;">50 mL tube</td>
			<td style="width:203px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:299px;">For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">15 mL tube</td>
			<td style="width:203px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352096</td>
			<td style="width:299px;">For general tissue culture procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">6-well plates</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:119px;">CA73520-906</td>
			<td style="width:299px;">For tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">10 cm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25382-428</td>
			<td style="width:299px;">For aggregate formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Axiovert 40C Microscope</td>
			<td style="width:203px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:299px;">For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">70 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:203px;">Fisherbrand</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22363548</td>
			<td style="width:299px;">To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:203px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">9410-1L</td>
			<td style="width:299px;">Used in permeabilization solution for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:299px;">Stain used during visualization of Cx43 localization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells into functional cardiomyocyte-like cells

Myocardinfarct en de daaropvolgende ischemische cascade resulteren in de uitgebreide verlies van cardiomyocytes, wat leidt tot congestief hartfalen, de belangrijkste oorzaak van kindersterfte wereldwijd. Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn een veelbelovende optie voor cel-gebaseerde therapieën ter vervanging van de huidige, invasieve technieken. MSCs kunnen onderscheiden in mesenchymale lineages, met inbegrip van de soorten van de cardiale cellen, maar volledige differentiatie in functionele cellen nog niet is bereikt. Vorige methoden van differentiatie waren gebaseerd op farmacologische agenten of groeifactoren. Meer fysiologisch relevante strategieën kunnen echter ook MSCs cardiomyogenic transformatie ondergaan. Hier presenteren we een methode van de differentiatie met MSC aggregaten op cardiomyocyte feeder lagen cardiomyocyte-achtige aanbestedende cellen produceren.
Menselijke navelstreng gerelateerde cellen (HUCPVCs) is gebleken dat een grotere differentiatie potentiële dan vaak onderzocht MSC typen, zoals beenmerg MSCs (BMSCs). Als een ontogenetisch jongere bron onderzochten we de mogelijkheden van de cardiomyogenic van eerste-trimester (FTM) HUCPVCs in vergelijking met oudere bronnen. FTM HUCPVCs zijn een roman, rijke bron van MSCs die hun in utero immunoprivileged eigenschappen behouden wanneer gekweekt in vitro. Met behulp van dit protocol van de differentiatie, de FTM en de term bereikt HUCPVCs aanzienlijk verhoogde cardiomyogenic differentiatie ten opzichte van BMSCs, zoals aangegeven door de verhoogde expressie van cardiomyocyte markers (dat wil zeggen, myocyte versterker factor 2 C, cardiale troponine T, zware ketting cardiale myosin, signaal regelgevende proteÃ¯ne α en connexin 43). Ze onderhouden ook aanzienlijk lager immunogeniciteit, zoals blijkt door hun lagere HLA-A expressie en hogere HLA-G expressie. Toepassing van differentiatie aggregaat gebaseerde, toonde FTM HUCPVCs verhoogde totale vorming potentiële en gegenereerde verdragsluitende cellen clusters binnen 1 week na co cultuur op cardiale feeder lagen, steeds de eerste MSC-type te doen.
Onze resultaten tonen aan dat deze strategie van de differentiatie effectief van het potentieel van de cardiomyogenic van jonge MSCs, zoals FTM HUCPVCs benutten kan, en dat in vitro pre differentiatie zou een mogelijke strategie suggereert te vergroten hun regeneratieve werkzaamheid in vivo.

HUCPVCs Display Higher Aggregate-formation Potential and CD49f Expression Levels Compared to BMSCs:
To induce the differentiation of hMSCs (i.e., FTM HUCPVCs, term HUCPVCs, and BMSCs), single-cell suspensions of undifferentiated MSCs or MSC-containing hanging drops (Table 1) were transferred onto rat primary cardiomyocyte monolayers to establish direct co-cultures or aggregate co-cultur...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Afleiding en differentiatie van Canine ovariële mesenchymale stamcellen

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...